孫偉哲,曲玲玉,滕 超,2,*,安向宇,師雨夢,2,李良軍,2

(1.食品質(zhì)量與安全北京實驗室(北京工商大學(xué)),北京 100048;2.北京市食品添加劑工程技術(shù)研究中心(北京工商大學(xué)),北京 100048)

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傳統(tǒng)饅頭老面中醋酸菌的鑒定及產(chǎn)酸條件優(yōu)化

孫偉哲1,曲玲玉1,滕 超1,2,*,安向宇1,師雨夢1,2,李良軍1,2

(1.食品質(zhì)量與安全北京實驗室(北京工商大學(xué)),北京 100048;2.北京市食品添加劑工程技術(shù)研究中心(北京工商大學(xué)),北京 100048)

自晉南地區(qū)傳統(tǒng)饅頭發(fā)酵劑(老面)中篩選出一株產(chǎn)酸量較高的醋酸菌(Q2534),對其進行了菌種鑒定及產(chǎn)酸量優(yōu)化研究。通過16S rDNA測序分析初步鑒定為熱帶醋酸桿菌(Acetobactertropicalis)。在單因素實驗的基礎(chǔ)上通過響應(yīng)面分析法繼續(xù)對發(fā)酵產(chǎn)酸條件進行優(yōu)化,確定該菌株的最優(yōu)發(fā)酵條件為:溫度32 ℃,轉(zhuǎn)速140 r·min-1,pH6.0,乙醇體積分數(shù)3.4%(v/v),在此條件下產(chǎn)總酸量可達26.74 g/L。其結(jié)果對傳統(tǒng)主食饅頭發(fā)酵劑中醋酸菌資源的發(fā)掘及應(yīng)用具有一定的意義。

醋酸菌,菌種鑒定,老面,響應(yīng)面優(yōu)化

傳統(tǒng)主食饅頭[1-2]在中國有著悠久的歷史和廣泛的分布,是中國古代勞動人民發(fā)明的一種具有中國文化特色的主食。傳統(tǒng)的饅頭是將面粉、水以及發(fā)酵劑混合在一起加工蒸制而成[3]。在我國北方,尤其是以山東、山西、河南等主要以面食為主的地區(qū),饅頭幾乎是人們每日必吃的主食,南方也有其特色的饅頭。南北方饅頭的差異主要體現(xiàn)在口感以及風(fēng)味上,究其原因主要是饅頭發(fā)酵劑中不同的酵母菌、醋酸菌[4]、乳酸菌等菌種的糖化、酯化等作用,從而產(chǎn)生多種多樣的有機物質(zhì),進而造成了南北方饅頭質(zhì)構(gòu)及風(fēng)味的差異[5]。目前,國內(nèi)已有學(xué)者對傳統(tǒng)饅頭發(fā)酵劑中的酵母菌Succhuromycescerevisiae、Sacchuromycesexiguus、Candidamilleri、Pichianorvegensis、Hansenulanomala和Candidakrusei等進行了研究[6];另一方面多種產(chǎn)酸菌株也被證實在老面發(fā)酵劑中存在,且多為乳酸桿菌,經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)Lactobacillussanfranciscensis、Lactobacillusplantarum、Lactobacilluspontis、Lactobacillusrossiae等乳桿菌都是酸面團中的關(guān)鍵微生物[7]。但目前關(guān)于傳統(tǒng)饅頭發(fā)酵劑中醋酸菌的研究相對較少[8-9]。因此,對于傳統(tǒng)發(fā)酵劑中主要菌種尤其是對于醋酸菌在傳統(tǒng)饅頭發(fā)酵劑混合體系中所起到的作用展開研究具有非常重要的意義。

本實驗以晉南地區(qū)傳統(tǒng)發(fā)酵劑為研究對象,篩選、鑒定其中的優(yōu)勢醋酸菌,并考察確定菌株發(fā)酵條件,充分了解該醋酸菌生長特性,為后續(xù)在實際中應(yīng)用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

傳統(tǒng)面食發(fā)酵劑 晉南地區(qū)采集饅頭發(fā)酵劑;葡萄糖、酵母膏、無水乙醇、鹽酸、氫氧化鈉等 均為國產(chǎn)分析純。

PHS-3C型pH計 Thermo公司;TE1502S型電子天平 上海天平廠;VS-1300L-U型潔凈工作臺 北京賽伯樂實驗儀器有限公司;YXQ-LS-100A型立式壓力蒸汽滅菌器 上海博訊實業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠;722E型可見光分光光度計 棱光技術(shù);培英2-2型臺式恒溫振蕩器 蘇州培英實驗設(shè)備有限公司。

1.2 培養(yǎng)基

PDA培養(yǎng)基:20%土豆汁,2%葡萄糖,2%瓊脂,115 ℃滅菌20 min。

基礎(chǔ)培養(yǎng)基:1.0%酵母膏,1.0%葡萄糖,pH為4.5～5.5,115 ℃滅菌20 min,使用前加入3.0%(v/v)乙醇。

分離培養(yǎng)基:1.0%酵母膏,1.0%葡萄糖,瓊脂2%,pH為5.5,115 ℃滅菌20 min,滅菌后,加入1.5%無菌CaCO3和3.0%(v/v)乙醇,制成平板[10]。

1.3 醋酸菌分離、純化

鈣平板分離方法:稱取1.00 g(精確到0.01 g)傳統(tǒng)面食發(fā)酵劑,用無菌生理鹽水以10倍遞增作梯度稀釋,取10-5～10-6稀釋度的菌液涂布到PDA培養(yǎng)基上,30 ℃的溫箱內(nèi)培養(yǎng)2 d,挑取培養(yǎng)基上細菌單菌落至分離培養(yǎng)基上,30 ℃的恒溫箱培養(yǎng)2 d。挑選有鈣溶解圈的菌株轉(zhuǎn)接純培養(yǎng)2 d,對純化的菌株進行鏡檢。將純化的菌株接入斜面培養(yǎng)基中,4 ℃保藏,并進行分子生物學(xué)實驗[11]。

1.4 16S rDNA序列分析

1.4.1 基因組DNA的提取 具體方法參考朱揚玲等[12]描述方法。取單菌落接種于5 mL醋酸菌基礎(chǔ)培養(yǎng)基中,在32 ℃下培養(yǎng)。取此培養(yǎng)條件下1.0 mL菌液于1.5 mL離心管中,13000 r/min離心2 min,棄上清。沉淀重懸于1.0 mL 0.85% NaCl中。室溫13000 r/min離心2 min,棄上清。沉淀重懸于550 μL 1×TE中。加17 μL溶菌酶(35 mg/mL),37 ℃溫育30 min。加3 μL蛋白酶K(20 mg/mL),37 ℃溫育30 min。加30 μL 10% SDS,37 ℃溫育30 min。加100 μL 5 mol/L NaCl充分混勻。加80 μL CTAB/NaCl溶液,混勻,65 ℃水浴10 min。加等體積(0.7～0.8 mL)氯仿/異戊醇(24∶1),輕輕振蕩混勻。室溫,13000 r/min離心10 min。將上清液轉(zhuǎn)移到一新1.5 mL離心管中,加入等體積酚/氯仿/異戊醇(25∶24∶1)輕輕振蕩混勻。

1.4.2 PCR基因擴增 適當(dāng)稀釋的模板DNA 1.0 μL,2.5 mmol/L的dNTP 2.5μL,10 mmol/L的PCR Buffer 2.5 μL,10 μmol/L的引物各1 μL,Taq DNA聚合酶1 μL(1.0 U),補水至25 μL。

PCR條件:94 ℃預(yù)熱4 min,每個循環(huán)包括94 ℃變性30 s,52 ℃退火30 s,72 ℃延伸1 min,30個循環(huán),最后72 ℃ 10 min,降溫至16 ℃取出。最后用1.5%的瓊脂糖電泳檢測PCR產(chǎn)物。

1.4.3 系統(tǒng)發(fā)育分析 根據(jù)測序結(jié)果,先利用BLAST程序?qū)?6S rDNA的PCR擴增產(chǎn)物測序結(jié)果在NCBI上比對,然后從GenBank數(shù)據(jù)庫中搜索有關(guān)種的基因序列數(shù)據(jù),用MEGA 4.1中的Neighbor-Joining法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹[12]。

1.5 單因素實驗

1.5.1 溫度對產(chǎn)酸量的影響 設(shè)定轉(zhuǎn)速為120 r·min-1,pH為5.5,乙醇體積分數(shù)為3%(v/v),裝液100 mL,醋酸菌接種量為2%,考察溫度分別為24、28、32、36、40 ℃時搖床培養(yǎng)發(fā)酵對醋酸菌產(chǎn)酸量的影響,間隔2 d測其總酸度。

1.5.2 轉(zhuǎn)速對產(chǎn)酸量的影響 設(shè)定溫度為32 ℃,pH為5.5,乙醇體積分數(shù)為3%(v/v),裝液100 mL,醋酸菌接種量為2%,考察轉(zhuǎn)速分別為110、120、130、140、150 r·min-1時搖床培養(yǎng)發(fā)酵對醋酸菌產(chǎn)酸量的影響,間隔2 d測其總酸度。

1.5.3 pH對產(chǎn)酸量的影響 設(shè)定溫度為32 ℃,轉(zhuǎn)速為140 r·min-1,乙醇體積分數(shù)為3%(v/v),裝液100 mL,醋酸菌接種量為2%,考察pH分別為3.5、4.5、5.5、6.5、7.5、8.5時搖床培養(yǎng)發(fā)酵對醋酸菌產(chǎn)酸量的影響,間隔2 d測其總酸度。

1.5.4 乙醇體積分數(shù)對產(chǎn)生酸量的影響 設(shè)定溫度為32 ℃,轉(zhuǎn)速為140 r·min-1,pH為5.5,裝液100 mL,醋酸菌接種量為2%,考察乙醇體積分數(shù)分別為0%、1%、2%、3%、4%、5%、6%、7%(v/v)時搖床培養(yǎng)發(fā)酵對醋酸菌產(chǎn)酸量的影響,間隔2 d測其總酸度。

1.6 產(chǎn)酸響應(yīng)面優(yōu)化

根據(jù)單因素實驗結(jié)果,確定乙醇體積分數(shù)(A)、溫度(B)、搖床轉(zhuǎn)速(C)3因素為自變量,醋酸菌Q2534產(chǎn)酸量為響應(yīng)值,對該醋酸菌發(fā)酵條件做進一步優(yōu)化。利用Design-Expert 8.0.6.1分析軟件,采用Box-Behnken[13-14]設(shè)計,進行三因素三水平的響應(yīng)面分析實驗,各因子的水平設(shè)置及編碼值見表1[15]。

表1 響應(yīng)面分析因素及水平表

1.7 菌株生長曲線及產(chǎn)酸曲線

根據(jù)產(chǎn)酸響應(yīng)面結(jié)果,設(shè)定溫度為32 ℃,pH6.0,轉(zhuǎn)速為140 r·min-1,乙醇體積分數(shù)為3.4%(v/v),裝液100 mL,醋酸菌接種量為2%,用吸光度法測量時間間隔為2 h時該醋酸菌菌體密度和總酸度。

1.8 產(chǎn)酸測定方法

總酸測定:GB/T 15038-1994,酸堿中和法。具體操作參考董叔閣等[14]描述方法。

1.9 數(shù)據(jù)處理

采用Design-Expert 8.0.6.1軟件進行方差分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 醋酸菌分離、純化及鑒定

通過初篩及鑒定平板復(fù)篩,選取在鈣平板上透明圈最大的一株醋酸菌進行后期分析研究。菌株Q2534的形態(tài)特征見圖1。

圖1 醋酸菌Q2534顯微鏡照片F(xiàn)ig.1 The microscope photograph of strain Q2534

該菌株在基礎(chǔ)培養(yǎng)基上呈乳白色,單菌落直徑約1.5～2 mm,革蘭氏陰性菌。單純的形態(tài)、鑒定平板及生理生化實驗還不能夠準確的將菌株鑒定到種,需要結(jié)合分子生物學(xué)方法。通過基因比對并采用Neighbor-Joining法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹,結(jié)果如圖2所示。序列分析表明,菌株Q2534與菌株AcetobactertropicalisDQ887340.1達到99%以上的序列同源性,且在基因進化樹中位于同一分枝上,可以初步確定目的菌株Q2534屬于Acetobactertropicalis,即熱帶醋酸桿菌。

圖2 菌株Q2534 16S rDNA基因序列系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.2 Phylogenetic tree inferred from Neighbour-joining analysis of partial 16S rDNA gene sequence of selected species

2.2 溫度對產(chǎn)酸量的影響

由圖3可看出,目的菌株在24～40 ℃時,隨著溫度的升高,產(chǎn)酸量呈現(xiàn)出先上升再下降的趨勢,溫度過高或過低對菌株產(chǎn)酸量都有影響。從上圖分析來看,目的菌株對溫度敏感,耐高溫性能較差,過高的溫度可能抑制其生長,如40 ℃時,該醋酸菌幾乎不產(chǎn)酸;溫度過低則緩慢生長,產(chǎn)酸量較低,如24 ℃時,前6 d幾乎不產(chǎn)酸;在32 ℃時,溫度適宜,菌株產(chǎn)酸量最高。

圖3 溫度對產(chǎn)酸量的影響Fig.3 Effect of temperature on acid yield

2.3 轉(zhuǎn)速對產(chǎn)酸量的影響

酒精醋化為需氧發(fā)酵,醋酸菌的生長增殖需要耗氧,乙醇在脫氫酶的作用下氧化成醋酸也需要耗氧,因此,醋酸菌發(fā)酵供氧水平與醋酸的生產(chǎn)效率密切相關(guān)[16]。由圖4可看出,醋酸菌Q2534在110～150 r·min-1時產(chǎn)酸量呈現(xiàn)先上升再下降的趨勢,在110～140 r·min-1的轉(zhuǎn)速變化范圍內(nèi),總產(chǎn)酸量基本維持在25 g/L左右,說明其轉(zhuǎn)速對其產(chǎn)酸量的影響較小。

圖4 轉(zhuǎn)速對產(chǎn)酸量的影響Fig.4 Effect of shaking speed on acid yield

2.4 pH對產(chǎn)酸量的影響

圖5 pH對產(chǎn)酸量的影響Fig.5 Effect of pH on acid yield

由圖5可看出,目的菌株在pH為3.5～8.5時,呈現(xiàn)出隨著pH的升高產(chǎn)酸量先上升后下降的趨勢。pH過高時會導(dǎo)致醋酸菌的遲滯期變得非常長,如當(dāng)pH為8.5時,該菌到前6 d幾乎都不產(chǎn)酸。pH過低會影響其最終的產(chǎn)酸量,如pH為3.5時該菌在后期生長緩慢并且最終的總產(chǎn)酸量也較低。分析其原因可能為:偏堿性的環(huán)境,抑制該醋酸菌產(chǎn)酸或者可能是醋酸菌的產(chǎn)酸量少且被環(huán)境中的堿性環(huán)境中和,從而導(dǎo)致其遲滯期變得非常長;當(dāng)pH過低時,隨著產(chǎn)酸量的累積,導(dǎo)致整個體系pH更低,從而導(dǎo)致后期生長更加緩慢。綜合來看,pH4.5～6.5的范圍內(nèi),醋酸菌都能較好的生長,產(chǎn)酸量較高。

2.5 乙醇濃度對產(chǎn)酸量的影響

由圖6可看出,目的菌株的乙醇耐受性較好,在乙醇體積分數(shù)為3%(v/v)時,隨著乙醇體積分數(shù)的升高,產(chǎn)酸量呈現(xiàn)先上升后略微下降的趨勢。過高或過低的乙醇體積分數(shù)都會對醋酸菌總產(chǎn)酸量產(chǎn)生一定的影響。分析其原因可能為:在發(fā)酵后期,發(fā)酵液中氧氣供應(yīng)充足,而乙醇含量不足的情況下,會發(fā)生過氧化反應(yīng),醋酸菌將醋酸進一步氧化成水和二氧化碳,使酸度迅速下降[17];當(dāng)乙醇體積分數(shù)過低時,醋酸菌的直接碳源乙醇含量較少,不足以維持醋酸菌產(chǎn)酸對碳源的需要;當(dāng)乙醇體積分數(shù)增高時,產(chǎn)酸量逐漸增加;當(dāng)乙醇體積分數(shù)過高時,則可能由于菌株直接利用的底物乙醇濃度過大,而對菌株的產(chǎn)酸量稍有抑制,例如乙醇體積分數(shù)為6%(v/v)的樣本,其最高產(chǎn)酸量僅為25 g/L左右。綜合上圖來看,醋酸菌Q2534在乙醇體積分數(shù)為3%(v/v)時總產(chǎn)酸量最高。

圖6 乙醇體積分數(shù)對產(chǎn)酸量的影響Fig.6 Effect of ethanol volume on acid yield

2.6 響應(yīng)面法優(yōu)化醋酸菌發(fā)酵條件

Box-Behnken實驗的設(shè)計表及實驗結(jié)果見表2,二次回歸分析的結(jié)果見表3。

表2 Box-Benhnken設(shè)計及其結(jié)果

利用Design-Expert 8.0.6.1軟件對表二結(jié)果進行擬合,得到二階回歸方程為:Y=24.70+3.59A-1.12B+2.68C-0.34AB+1.27AC-7.5×10-3BC-9.39A2-6.48B2-4.36C2

對回歸模型的顯著性進行檢驗和分析,其結(jié)果見表3。由回歸模型顯著性檢驗結(jié)果及方差分析可知,模型的p值為<0.0001小于0.05,表明模型顯著;模型的擬合度R2=0.9761,模型失擬項的p>F值為0.3215遠大于0.05,表明失擬項不顯著。所以回歸方程對實驗的擬合度較好,可以對實驗區(qū)域的菌株產(chǎn)酸情況進行有效地評估,即可以用于對菌株Q2534產(chǎn)酸條件優(yōu)化的模擬。

從表3還可以看出,在實驗區(qū)域內(nèi)培養(yǎng)乙醇體積分數(shù)(A)、pH(C)以及乙醇體積分數(shù)、溫度、pH的二次項(A2、B2、C2)均對菌株Q2534發(fā)酵產(chǎn)酸情況影響極顯著。各因素間交互作用的響應(yīng)面及等高線圖由圖7所示。

由圖7中等高線可知,AB、AC和BC交互作用不顯著,即乙醇體積分數(shù)、溫度和pH兩兩之間相互交互作用不顯著,與表3結(jié)果相同。通過進一步分析得知,響應(yīng)面優(yōu)化最佳產(chǎn)酸條件為溫度31.63 ℃,轉(zhuǎn)速140 r·min-1,pH5.84,乙醇體積分數(shù)3.43%(v/v),在此條件下該菌產(chǎn)醋酸水平可以達到25.59 g/L。對模型進行驗證,考慮實驗的可操作性,將最佳產(chǎn)酸條件調(diào)整為:溫度32 ℃,轉(zhuǎn)速140 r·min-1,pH6.0,乙醇體積分數(shù)3.4%(v/v),三次平行實驗結(jié)果均值為26.74 g/L,與預(yù)測值相差較小,說明此模型的預(yù)測可靠。

2.7 醋酸菌菌體數(shù)量與產(chǎn)酸量之間的關(guān)系

由圖8可看出,醋酸菌菌體密度隨著時間的變化在0～18 h內(nèi)增長迅速,由規(guī)律判斷此階段屬于對數(shù)生長期。至20 h左右,菌體密度達到最大值并在此發(fā)酵條件下基本穩(wěn)定維持至200 h左右,隨后菌體密度逐漸下降,菌群開始衰亡。產(chǎn)酸規(guī)律方面,在0～240 h內(nèi)該菌產(chǎn)酸量逐漸上升,最高值達到26.25 g/L,240 h后總產(chǎn)酸量略微下降,但總體下降幅度不大。并且在該菌到達穩(wěn)定期后,產(chǎn)酸量基本維持一定的速率增加并逐漸積累,在第10 d左右,產(chǎn)酸達到最大值。

表3 Box-Benhnken設(shè)計回歸分析結(jié)果

圖7 各因素間交互作用的響應(yīng)面Fig.7 Response surface of the combined effects on acetic acid production by Q2534

注:*:表示顯著,p<0.05;**:表示極顯著,p<0.01。

圖8 醋酸菌Q2534菌體密度及產(chǎn)酸量變化 Fig.8 The relationship between cell density and the acid yield of strain Q2534

3 結(jié)論

對實驗室自晉南地區(qū)篩選保藏的醋酸菌Q2534進行了鑒定,根據(jù)16S rDNA序列分析初步判定為Acetobactertropicalis,實驗繼續(xù)研究了醋酸菌培養(yǎng)條件并對其進行優(yōu)化,確定最佳發(fā)酵產(chǎn)酸條件為:乙醇體積分數(shù)3.4%(v/v),溫度32 ℃,轉(zhuǎn)速140 r·min-1,pH6.0,在此最佳發(fā)酵條件下該醋酸菌產(chǎn)酸量為26.74 g/L。由于傳統(tǒng)饅頭老面中關(guān)于醋酸菌的研究較少,根據(jù)已進行實驗初步判斷其可能對傳統(tǒng)饅頭風(fēng)味的形成產(chǎn)生作用,擬后續(xù)進一步完善相關(guān)工作。

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Identification of acetic acid bacteria in fermenting agent of Chinese steamed bread and optimization of fermentation conditions

SUN Wei-zhe1,QU Ling-yu1,TENG Chao1,2,*,AN Xiang-yu1,SHI Yu-meng1,2,LI Liang-jun1,2

(1.Beijing Laboratory for Food Quality and Safety,Beijing Technology & Business University(BTBU),Beijing 100048,China; 2.Beijing Engineering and Technology Research Center of Food Additives, Beijing Technology & Business University(BTBU),Beijing 100048,China)

A high acid producing acetic acid bacteria(Q2534)was screened from traditional steamed bread fermentation agent in the south of Shanxi. The identification and acid production optimization have been done to it. It has been identified asAcetobactertropicalisbased on 16S rDNA method. On the basis of single factor experiments,the best fermentation conditions and medium composition were optimized by response surface analysis method. The best fermentation conditions were as follows:temperature 32 ℃,rotation rate 140 r·min-1,pH6.0 and alcohol content 3.4%(v/v). Under these conditions,the yield of acetic acid of this bacteria can reach 26.74 g/L. The results have some effects on exploitation and application of the resource of acetic acid bacteria that got from traditional fermenting agent of Chinese steamed bread.

acetic acid bacteria;identification;traditional starter;response surface analysis

2016-05-27

孫偉哲(1994-)，男，大學(xué)本科，研究方向：微生物發(fā)酵，E-mail:sun.wz@foxmail.com。

*通訊作者:滕超(1981-)，男，副教授，研究方向：食品生物技術(shù)，E-mail:tc2076paper@163.com。

國家自然科學(xué)基金(31201449，31371723)。

TS210.1

A

1002-0306(2016)22-0190-06

10.13386/j.issn1002-0306.2016.22.029