曾 杰 劉 瑤 焦薇薇 許明賀 王 杰綜述 王傳航審校

1. 中日友好醫(yī)院（北京 100029）；2. 西南醫(yī)科大學(xué)護理學(xué)院

·綜 述·

糖尿病勃起功能障礙動物模型的制備

曾 杰1劉 瑤2焦薇薇1許明賀1王 杰1綜述 王傳航1審校

1. 中日友好醫(yī)院（北京 100029）；2. 西南醫(yī)科大學(xué)護理學(xué)院

流行病學(xué)調(diào)查顯示，糖尿病患者中ED的發(fā)病率為19.5%～75.2%[1,2]。隨著糖尿病發(fā)病率的不斷升高，糖尿病勃起功能障礙（DMED）的發(fā)病率也日漸增高，預(yù)計我國到2025年DMED患者會達到4000萬[3]。對疾病的發(fā)病機制進行研究可以指導(dǎo)臨床診療，而制備合適的動物模型是進行高質(zhì)量實驗研究的前提。本文針對DMED動物模型的制備進行綜述。

一、造模動物的選擇

綜合考慮實驗?zāi)康?、?jīng)費狀況、動物自身特點、飼養(yǎng)環(huán)境和與人體結(jié)構(gòu)的相似度等因素，選用恰當(dāng)?shù)脑炷游锟梢源_保實驗的科學(xué)性和可信性。實踐中常選擇大鼠、小鼠、兔、豬等動物，少數(shù)情況下也選擇靈長類動物如猴[4]。

在DMED的造模中，嚙齒類動物因為價格較低和技術(shù)成熟等原因故較多的被選用[5]。其中，大鼠盆腔及陰莖組織的神經(jīng)反射、血管走向以及相關(guān)受體分布等與人類有較強相似度，而且抗感染能力強和繁殖周期短[6]，故在DMED的造模中使用最多。小鼠因體型小易捕捉，發(fā)育迅速，性成熟早，尾部血管豐富，在DMED的分子病因?qū)W機制研究中選用較多[7]。

與其他常用實驗動物相比，豬和人類在解剖結(jié)構(gòu)、生理病理等方面具有更大的相似度，與人的基因純合度為95%，人工選育的小型豬由于性格溫順而易于進行實驗操作，特別是隨著現(xiàn)代動物保護意識的增強和“3R原則[即減少（Reduction）、優(yōu)化（Refinement）和替代（Replacement）]”的實行，小型豬在動物實驗中具有更大優(yōu)勢[8]。有研究采用高脂高糖飼料喂廣西巴馬小型豬，半年后有50%小型豬產(chǎn)生糖尿病，1年后DMED的總成模率為13%[9]。

兔大小適宜、方便管理，其陰莖結(jié)構(gòu)和人很相似，尤其是在海綿體張力的神經(jīng)與非神經(jīng)因素方面[10]，且沒有陰莖骨，海綿體組織相對豐富。陳國強等[11]從兔的耳緣靜脈注射四氧嘧啶，成功建立糖尿病動物模型，再通過測定海綿體內(nèi)壓，成功建立DMED動物模型。Pereira等[12]采取相同的方式建立家兔DMED模型，通過病理和免疫組化檢測，發(fā)現(xiàn)發(fā)生ED的機制是血管結(jié)構(gòu)變化，陰莖血液供應(yīng)減少。

嚙齒類動物雖然廣泛用于建立人類疾病動物模型，但是由于存在巨大的種屬差異，很多在動物研發(fā)中證明對鼠有效的藥物卻對人無效。靈長動物從生物學(xué)上來說是人類的近親，相比其他動物模型，靈長類動物可更好地復(fù)制人類疾病[13]。但是由于數(shù)量相對少、費用昂貴等因素，目前缺少使用非人類靈長類動物建立DMED模型的報道。

二、DM動物模型的建立

（一）1型糖尿?。═ype 1 diabetes mellitus，T1DM）動物模型

T1DM動物模型的建立多基于破壞動物胰島，方式有藥物誘導(dǎo)和手術(shù)切除胰腺[14]。手術(shù)切除胰腺對實驗動物傷害較嚴重，操作有一定難度，批量造模困難。藥物誘導(dǎo)簡便易操作，常用的藥物有鏈脲佐菌素（STZ）和四氧嘧啶（alloxan,ALX）。STZ和ALX對動物胰島β細胞有特異的破壞作用，可減少或終止動物胰島素分泌，引起實驗動物患糖尿病。

STZ是一種誘導(dǎo)DNA雙鍵斷裂的強烷基化藥劑，可抑制葡萄糖運轉(zhuǎn)，影響葡萄糖激酶功能，損傷胰島β細胞。據(jù)報道[15]，成年雄性長尾猴靜脈注射STZ,兩個月后再次注射該藥,定期靜脈抽血可發(fā)現(xiàn)長尾猴血糖水平明顯升高，內(nèi)源性胰島素明顯降低。由于大鼠和小鼠以及同種動物不同品系之間對STZ敏感性不同，藥物注射劑量和給藥方式等也有差異。有報道稱，一次性給小鼠大劑量注射STZ（100mg/kg）[16]，大鼠注射STZ（55～65mg/kg）[17]可導(dǎo)致胰腺β細胞壞死，建立無炎癥性T1DM模型。也有研究報道，小鼠小劑量（40mg/kg）連續(xù)腹腔注射STZ，可引發(fā)自身免疫性損害，誘導(dǎo)產(chǎn)生免疫性T1DM動物模型[18]。

ALX對胰島β細胞具有特殊的破壞作用，可通過產(chǎn)生超氧自由基終止胰島素的分泌。以兔為造模動物，可采用耳緣靜脈注射ALX的方式，連續(xù)2次小劑量（首次按80mg/kg，24h后按照120mg/kg）給藥比1次大劑量（150mg/kg）給藥成模率更高（80%/20%），實驗動物死亡率更低（10%/70%）[19]。梁沛余等[20]認為多次ALX給藥法建立糖尿病大鼠模型時，第1次大鼠腹腔注射ALX 100 mg/kg，24h后補注相同劑量是最佳給藥時間和劑量。丁利等制備T1DM小鼠模型時[21]，利用ALX腹腔兩次注射法，首次劑量為120mg/kg，24h后再次注射80mg/kg，可防止小鼠低血糖的發(fā)生，降低死亡率。

（二）2型糖尿?。═ype 2 diabetes mellitus，T2DM）動物模型

在T2DM模型動物的構(gòu)建中，為避免大劑量注射STZ導(dǎo)致T1DM和動物血糖過低而死亡，可采用煙酰胺（NAA）預(yù)先15min注射保護胰島β細胞，再給STZ破壞，能夠建立成模率高、病死率低、癥狀明顯的T2DM模型[22,23]。大鼠可預(yù)先注射NAA100～200mg/kg，小鼠可預(yù)先注射NAA120～240mg/kg，有助于清除氧自由基，減輕STZ導(dǎo)致的胰島細胞氧化損害。

飲食聯(lián)合藥物干預(yù)也是建立T2DM動物的重要手段，樂嶺等[24]利用高脂飲食喂養(yǎng)SD大鼠，8周后大鼠體質(zhì)量增加，腹腔脂肪明顯增多，以小劑量STZ腹腔注射誘導(dǎo)糖尿病，檢測發(fā)現(xiàn)大鼠出現(xiàn)甘油三酯、游離脂肪酸和胰島素抵抗指數(shù)升高，高血糖與胰島素抵抗均出現(xiàn)，與人類T2DM病理生理特點相似。在利用小鼠[25]、獼猴[26]造模時，給予高脂高糖飲食飼養(yǎng)后，再使用藥物制備DM模型，也能發(fā)現(xiàn)實驗動物出現(xiàn)肥胖、高脂血癥、胰島素抵抗，符合人類T2DM的臨床特點和病理特征。因此，這種造模方法簡便可行，重復(fù)性好，是研究T2DM機制和并發(fā)癥較為理想的模型。

在實驗性DM動物模型之外，近年也有自發(fā)性T2DM動物模型應(yīng)用于相關(guān)研究。例如OLETF大鼠、GK大鼠、db/db小鼠、黑線倉鼠等，具有慢性DM病程、多食、輕度肥胖、胰腺增生等特點，早期可出現(xiàn)胰島素抵抗、糖脂代謝紊亂，繼而胰島功能逐步減退，很接近人類T2DM。而且，OLETF大鼠具有由于代謝紊亂而致的血管內(nèi)皮功能障礙的病理表現(xiàn)[27]，血管內(nèi)皮功能障礙是ED的病理基礎(chǔ)之一，因此利用自發(fā)性T2DM動物建立2型糖尿病勃起功能障礙模型是值得研究的方向。

近年來基因編輯技術(shù)已成為生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的一大熱點，通過對基因組進行精確定點修飾，可快速構(gòu)建動物模型。利用基因編輯技術(shù)，研究者已經(jīng)成功制備T2DM動物模型[28]。然而，目前基因工程動物模型有成本較高、單基因模擬、繁殖時間長等缺點，也可能因脫靶效應(yīng)而引發(fā)生物安全風(fēng)險，仍需隨著基因工程技術(shù)進一步發(fā)展，建立科學(xué)安全的多基因修飾的動物模型。

三、勃起功能的評估

DM造模成功后，下一步需評估實驗動物的勃起功能。誘導(dǎo)陰莖勃起的方法有血管活性藥物海綿體注射法、負壓吸引法、電刺激法、可視性性興奮刺激法等，在實際實驗中常使用阿撲嗎啡實驗、電刺激法以及模擬自然狀態(tài)下交配行為等。

阿撲嗎啡（APO）作為一種非選擇性的中樞多巴胺受體激動劑，可通過激動D1、D2樣受體，誘發(fā)實驗動物產(chǎn)生陰莖勃起。研究者對DM兔予APO皮下注射,觀察和記錄勃起狀態(tài)，發(fā)現(xiàn)DM兔表現(xiàn)出顯著的勃起功能抑制[29]。DM大鼠成模后進行APO實驗，隨著時間延長，勃起次數(shù)和勃起率逐漸降低，從中可篩選出DMED大鼠進行研究[30]。此法評價陰莖勃起的判定標(biāo)準(zhǔn)具有一定主觀性，對于動物同樣的表現(xiàn)，不同的實驗者可能會產(chǎn)生判斷上的差異。

運用電刺激動物陰莖海綿體神經(jīng)誘發(fā)勃起，再通過換能器讀取陰莖海綿體內(nèi)壓（ICP），ICP可直接反映陰莖的勃起功能，因此該法較為客觀準(zhǔn)確。用電刺激大鼠陰莖海綿體神經(jīng)后測量ICP及平均頸動脈壓（MAP），對比正常組和T2DM組大鼠的ICP和MAP，可發(fā)現(xiàn)T2DM組的ICP明顯低于正常組[31]。通過改良ICP測量方法，選擇陰莖腳作為穿刺部位，利用倒刺狀穿刺針進行穿刺，可使進針穩(wěn)定精準(zhǔn)，實驗測定ICP成功率可達100%[32]。利用電刺激盆神經(jīng)，也可以誘發(fā)兔[11]、狗[33]等動物陰莖勃起，評價其勃起功能。電刺激法在國外是評價陰莖勃起功能的標(biāo)準(zhǔn)方法，穩(wěn)定準(zhǔn)確，重復(fù)性較好，故應(yīng)用較為廣泛[34,35]，但也有操作方法復(fù)雜、對動物創(chuàng)傷大、電刺激參數(shù)難以把握等不足。

評價動物勃起功能也可采用交配實驗，通過以藥物誘導(dǎo)雌鼠發(fā)情，隨后將雌鼠和STZ注射后的糖尿病雄鼠放在一起，觀察記錄雄鼠乘騎、插入、射精次數(shù)及射精潛伏期、射精后間隔來評價勃起功能[36]。馬凱偉等[37]將DM大鼠分為APO組、西地那非組和模型組，分別予以相應(yīng)藥物干預(yù)后用發(fā)情雌鼠與之配對，結(jié)果發(fā)現(xiàn)造模動物經(jīng)過藥物刺激后的狀態(tài)難以準(zhǔn)確體現(xiàn)勃起功能，相比之下，由發(fā)情雌鼠誘導(dǎo)更可能激發(fā)出模型雄鼠陰莖的確切勃起。該法易受環(huán)境影響，有的勃起功能正常的動物可能因與雌性動物同籠受驚，缺乏交配主動性，從而會導(dǎo)致假陽性的實驗結(jié)果。

四、小結(jié)

目前，在人類身上進行性功能的相關(guān)研究受到倫理等多方因素的制約，因此研究者需要設(shè)計各種DMED的動物模型，研究并闡明糖尿病導(dǎo)致ED的發(fā)病機制、藥物的藥理作用等。在DMED實驗動物模型中，嚙齒類動物模型的建立比較成熟，在較大程度上取代其他動物成為DMED的主要動物模型。最后，探索建立更加符合人類生理病理特點的糖尿病動物模型，提高評價勃起功能的方法的準(zhǔn)確性，減少實驗動物傷害，降低實驗成本，提高成模率，是今后研究工作的著力點之一。

致謝：本課題受國家自然科學(xué)基金資助（編號：81673978）

糖尿病; 勃起功能障礙; 疾病模型, 動物

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（2017-05-30收稿）

10.3969/j.issn.1008-0848.2017.04.017

R 587.1; R 698.1