張永波　胡遠(yuǎn)強

[摘 要] 目的：探討卵巢乳頭狀癌組織中VEGF和MMP-2的表達(dá)特征，與卵巢乳頭狀癌發(fā)生侵襲、轉(zhuǎn)移的相關(guān)性。方法：利用實時定量聚合酶鏈反應(yīng)（QT-PCR ）、免疫組織化學(xué)染色法、Western blot法檢測VEGF/MMP-2基因及蛋白在正常卵巢組織、卵巢乳頭狀癌組織中的表達(dá)情況。結(jié)果：與正常卵巢組織相比，在卵巢乳頭狀癌組織中，VEGF/MMP-2基因和蛋白的表達(dá)量均明顯升高，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05 ）。對比I-II期和III-IV期，在III-IV期VEGF/MMP-2基因和蛋白的表達(dá)也明顯升高，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05 ）。結(jié)論：VEGF/MMP-2的高表達(dá)可能與卵巢乳頭狀癌的侵襲和轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。

[關(guān)鍵詞] 卵巢乳頭狀癌；VEGF；MMP-2；侵襲和轉(zhuǎn)移

中圖分類號：R737.31 文獻標(biāo)識碼：A 文章編號：2095-5200（2016）06-111-03

DOI：10.11876/mimt201606041

卵巢癌是女性患者中死亡率最高的一類惡性腫

瘤[1]，最常見的類型是卵巢乳頭狀癌。而卵巢癌高死亡率的主要原因[2]是70%左右的病例確診時已有卵巢癌的浸潤、盆腹腔的轉(zhuǎn)移，無法手術(shù)和放療。腫瘤發(fā)生轉(zhuǎn)移和侵襲的兩個重要環(huán)節(jié)就是新生血管形成與細(xì)胞外基質(zhì)金屬降解[3]。血管內(nèi)皮生長因子 （Vascular endothelial growth factor，VEGF）是一種多功能的細(xì)胞因子[4-5]，可以增強癌組織中內(nèi)皮細(xì)胞的增生，促進新生血管的形成，同時增加腫瘤中血管的通透性，促進癌細(xì)胞進入血管的過程，提高其浸潤和侵襲的能力?；|(zhì)金屬蛋白酶（Matrix Metalloproteinases， MMPs）是一種鋅離子依賴的高度保守的內(nèi)切蛋白水解酶家族，包括MMP1-MMP26等26個成員，能有效降解血管基底膜及細(xì)胞外基質(zhì)的各種蛋白成分，從而破壞阻礙癌細(xì)胞侵襲的組織學(xué)屏障[6]。而MMP-2 [7]具有降解基膜Ⅳ型膠原的能力，一直是卵巢乳頭狀癌轉(zhuǎn)移和浸潤機制的研究熱點。

本實驗利用QT-PCR 法、免疫組織化學(xué)染色法、Western blot法檢測VEGF/MMP-2基因及蛋白在正常卵巢組織、卵巢乳頭狀癌組織中的表達(dá)情況，探討其與卵巢乳頭狀癌侵襲、轉(zhuǎn)移的關(guān)系，為下一步研究卵巢乳頭狀癌的早診斷早治療及預(yù)后提供參考。

1 材料和方法

1.1 材料

VEGF兔多克隆抗體（武漢博士德有限公司）；MMP-2鼠單克隆抗體（武漢博士德有限公司）；檸檬酸鹽修復(fù)液（福州邁新生物技術(shù)有限公司）； RNeasy FFPE Tissue Kit試劑盒 （廈門艾德生物醫(yī)藥科技有限公司）；Maxima SYBR Green QT-PCR Master Mixes（Thermo Fisher Scientific）；HiFi-MMLV Two Step RT-PCR Kit（北京康為世紀(jì)生物科技有限公司）；DL1000Protein Marker （TaKaRa）；組織蛋白提取試劑盒（上海經(jīng)科化學(xué)科技有限公司）；ECL顯色試劑盒（Thermo） ；PBS緩沖液（pH7.2～7.4）（福州邁新生物技術(shù)有限公司）。

1.2 方法

1.2.1 標(biāo)本來源 收集我院從2013年1月至2015年6月期間具有完整的臨床資料、經(jīng)手術(shù)和病理檢查診斷明確卵巢乳頭狀癌且術(shù)前均未行放、化療的病例80例，正常卵巢組織49例。臨床資料包括患者的姓名、年齡、有無浸潤和轉(zhuǎn)移等。卵巢乳頭狀癌病理診斷由兩位高年資病理醫(yī)師復(fù)閱切片，不一致病例由第三名醫(yī)師進行評估，最后討論達(dá)成共識。所有卵巢乳頭狀癌患者臨床分期按國際婦產(chǎn)科聯(lián)盟 （FIGO，1988 年）標(biāo)準(zhǔn)，其中I-II期15例，III-IV 期 65例。

1.2.2 總RNA提取，檢測VEGF/MMP-2基因水平的表達(dá)情況 收集的正常卵巢組織、卵巢乳頭狀癌組織石蠟標(biāo)本，用RNeasy FFPT試劑盒，按照說明書對每一份病例的石蠟標(biāo)本分別進行總RNA提取。經(jīng)反轉(zhuǎn)體系得到cDNA，用QT-PCR方法檢測VEGF/MMP-2基因的表達(dá)。QT-PCR條件：底物液12μL，H2O7.5μL ，引物（VEGF/MMP-2/actin）2μL模板2μL。

1.2.3 免疫組織化學(xué)染色法檢測VEGF/MMP-2蛋白的表達(dá)情況 1）卵巢組織脫蠟和水化；2）抗原修復(fù)；3）免疫組織化學(xué)染色 ： 3%H2O2滴加在組織上，室溫靜置10min；PBS洗3次各5min；滴加正常山羊血清封閉液，室溫20min；滴加一抗50μL， 4℃過夜；PBS洗3次各5min；滴加二抗50μL，37℃20min；PBS洗3次各5min；DAB顯色2-3min，在顯微鏡下掌握染色程度；自來水沖洗5min；蘇木精復(fù)染3min，鹽酸酒精分化3s；自來水沖洗10min；脫水、透明、封片、鏡檢。4）結(jié)果判讀：VEGF/MMP-2以胞漿出現(xiàn)黃色或棕黃色顆粒為陽性細(xì)胞。陽性結(jié)果的判斷標(biāo)準(zhǔn)是按照染色程度和顯色細(xì)胞的數(shù)量結(jié)合進行歸類：細(xì)胞顯色比例 < 5%（-）；細(xì)胞顯色的比例在 5%～25%之間，呈現(xiàn)為淡黃色（+）；細(xì)胞顯色的比例在25%～50%之間，呈現(xiàn)為黃色（++）；細(xì)胞顯色的比例 > 50% ，呈現(xiàn)棕黃色（+++）。以（ ++ ）（ +++ ）者為免疫組化陽性表達(dá)。

1.2.4 提取總蛋白，Western blot法檢測VEGF/MMP-2蛋白的表達(dá) 從上述收集的病例中正常卵巢組織、卵巢乳頭狀癌組織石蠟標(biāo)本I-II期、III-IV期中各選取5例，用組織蛋白提取試劑對每一份病例的石蠟組織分別進行總蛋白的提取，測定蛋白濃度。Western blot具體步驟：配置分離膠和濃縮膠，蛋白上樣，SDS-PAGE 80V電泳3h后轉(zhuǎn)移至聚偏氟乙烯（PVDF）膜，5%脫脂奶37℃封閉1h，一抗（1：500）4℃過夜，二抗（1：1000）37℃孵育1h，ECL法顯色，同時檢測actin（1：500）的表達(dá)作為內(nèi)參。

1.2.5 統(tǒng)計學(xué)處理 使用SPSS11.0軟件系統(tǒng)，計數(shù)資料進行χ2檢驗或Fishers確切概率法檢驗，相關(guān)比較采用Spearman等級相關(guān)分析，P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 VEGF/MMP-2基因水平的表達(dá)情況

如表1所示，正常卵巢組織中VEGF/MMP-2基因表達(dá)分別為0.18±0.11和0.41±0.35。卵巢乳頭癌組織VEGF/MMP-2基因表達(dá)分別為0.69±0.24和1.21±0.65。在卵巢乳頭癌組織中VEGF/MMP-2基因表達(dá)明顯升高，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。并且隨著卵巢乳頭癌組織分期升高，VEGF/MMP-2基因表達(dá)也增加，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。

2.2 VEGF/MMP-2蛋白的表達(dá)情況

正常卵巢組織中VEGF/MMP-2蛋白表達(dá)陽性率分別是6.1%和4.1%，而在卵巢乳頭狀癌中VEGF/MMP-2蛋白表達(dá)陽性率分別是91.3%和86.3%。

與正常卵巢組織相比，卵巢乳頭狀癌中VEGF/ MMP-2蛋白表達(dá)量顯著升高，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。在III-IV中VEGF/ MMP-2蛋白高于I-II級的表達(dá)（P<0.05）（見表2）。

P<0.05

2.3 Western blot法檢測VEGF/MMP-2蛋白的表達(dá)

情況

對比圖1正常卵巢組織、卵巢乳頭狀癌組織石蠟標(biāo)本I-II期、III-IV期，可見VEGF/ MMP-2蛋白表達(dá)逐級升高，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。

3 討論

卵巢癌在女性生殖系統(tǒng)癌瘤中排名第三[8]，僅次于子宮頸癌和子宮體癌。近年，宮頸癌及宮體癌早期篩查技術(shù)的大力發(fā)展，對宮頸癌及宮體癌的防治已取得顯著成效，總生存率明顯升高。而卵巢癌的早期診斷非常困難[9-10]，發(fā)現(xiàn)時已有卵巢癌的浸潤、盆腹腔的轉(zhuǎn)移，因此成為死亡率最高的腫瘤。而腫瘤發(fā)生轉(zhuǎn)移和侵襲的兩個重要環(huán)節(jié)就是新生血管形成與細(xì)胞外基質(zhì)金屬降解。

VEGF作為血管內(nèi)皮特異性的有絲分裂原，對血管內(nèi)皮細(xì)胞的增殖、血管滲透性增加等方面具有很強的調(diào)控作用[11-13]。因此VEGF在腫瘤細(xì)胞與血管內(nèi)皮細(xì)胞都有陽性表達(dá)，只是在惡性細(xì)胞中，VEGF過度表達(dá)。從我們的研究發(fā)現(xiàn)，VEGF無論是基因水平還是蛋白水平表達(dá)量在正常卵巢組織、卵巢乳頭狀癌組織表達(dá)差異均非常明顯，尤其是在卵巢癌III-IV期表達(dá)量最高，這說明VEGF在卵巢乳頭狀癌轉(zhuǎn)移過程中發(fā)揮重要的作用。

MMP-2作為細(xì)胞外蛋白水解酶，主要功能是降解細(xì)胞外基質(zhì)的多種成分。細(xì)胞外基質(zhì)是阻礙癌組織學(xué)屏障，而癌細(xì)胞可以通過自身分泌或旁分泌等方式合成大量的MMP-2，破壞基底膜的完整性，發(fā)生侵襲和轉(zhuǎn)

移[14-15]。我們的實驗中可以觀察到MMP-2基因和蛋白的表達(dá)在正常卵巢組織、卵巢乳頭狀癌組織石蠟標(biāo)本I-II期、III-IV期也逐漸升高，而MMP-2在III-IV期高表達(dá)，有利于卵巢癌細(xì)胞的浸潤和侵襲。

總之，VEGF通過增加血管通透性和促進血管形

成[16]，MMP-2通過裂解細(xì)胞外基質(zhì)，加速了卵巢癌的惡性轉(zhuǎn)移[17]。因此研究VEGF/ MMP-2兩者的相關(guān)性為深入了解調(diào)控腫瘤微血管生成的分子機制及其與腫瘤侵襲和轉(zhuǎn)移關(guān)系奠定基礎(chǔ)。而VEGF/ MMP-2在III-IV期的高表達(dá)，成為設(shè)計和研制治療卵巢癌藥物的新思路。

參 考 文 獻

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