黃利堅 徐振興 王國亮 楊嘉恩

廈門市中醫(yī)院肝病中心，福建廈門 361001

IL28B基因多態(tài)性與聚乙二醇干擾素ɑ治療HBeAg陽性慢性乙型肝炎24周療效的關(guān)系

黃利堅 徐振興 王國亮 楊嘉恩

廈門市中醫(yī)院肝病中心，福建廈門 361001

目的探討IL28B基因多態(tài)性（SNP）與聚乙二醇干擾素ɑ（PegIFNα）24周療程治療HBeAg陽性慢性乙型肝炎（CHB）療效的相關(guān)性。方法采集398例接受PegIFNα24周療程治療HBeAg陽性CHB患者的外周血，采用直接測序法檢測IL28B基因3個SNP位點rs12980275、rs12979860、rs8099917的多態(tài)性。應(yīng)答定義：谷丙轉(zhuǎn)氨酶（ALT）復常、HBV DNA＜500IU/mL、HBeAg血清轉(zhuǎn)換。結(jié)果治療總應(yīng)答率為42.46%（169/398），HBV基因B型52.01%（207/398），C型47.99%（191/398）。IL28B 3個SNP位點的基因型在應(yīng)答組與無應(yīng)答組中的分布無顯著性差異（P＞0.05），rs12980275 AA型與非AA型應(yīng)答對比（OR0.916，95%CI0.460～1.825，P=0.804），rs12979860 CC型與非CC型應(yīng)答對比（OR0.921，95%CI0.442～1.921，P=0.826），rs8099917 TT型與非TT型應(yīng)答對比（OR0.921，95%CI0.442～1.921，P=0.826）。結(jié)論IL28B的SNP與聚乙二醇干擾素24周的治療應(yīng)答無顯著相關(guān)。

慢性乙型肝炎; IL28B基因；干擾素；單核苷酸多態(tài)性；應(yīng)答

我國慢性乙型肝炎（chronic hepatitis B，CHB）患者眾多約有2000萬例[1]，乙型肝炎病毒（hepatitis B virs，HBV）以B、C型為主，多系母嬰傳播，為治療增加難度。據(jù)報道48周療程聚乙二醇干擾素ɑ（peginterferon alpha，PegIFNα）治療HBeAg陽性CHB患者HBeAg血清學轉(zhuǎn)化率為32%～36%[2]。干擾素為臨床一線抗病毒藥物，干擾素療程24周是重要的時間節(jié)點，2015年版我國慢性乙肝防治指南指出，HBeAg陽性CHB患者接受PegIFN-ɑ治療24周時若HBsAg＜1500IU/mL，則繼續(xù)單藥治療至48周可獲得較高的HBeAg血清陰轉(zhuǎn)率。臨床醫(yī)師或依據(jù)干擾素24周療程時不同應(yīng)答療效采用應(yīng)答指導治療策略（responsed guided therapy，RGT），為確定下一步治療方案提供參考[3]。2011年EASL 慢性丙型肝炎感染診治指南增加了IL28B宿主基因型對抗病毒治療療效的重要的預測因素。慢性HCV感染與慢性HBV感染有著相似的發(fā)病機制。有國內(nèi)外學者研究認為IL-28B SNP（single nucleotide polymorphism）位點與PegIFN-ɑ治療48周的HBeAg血清學高轉(zhuǎn)換率有關(guān)[4-5]。對于IL28B的SNP與乙型肝炎病程的轉(zhuǎn)歸、HBV感染后肝炎肝硬化、肝癌及IFN抗病毒療效的相關(guān)研究，國內(nèi)外學者均有不同見解，這可能與選擇不同的實驗方法及針對不同的患者種族有一定的關(guān)系，尚需進一步研究明確IL28B的SNP與HBV的相關(guān)性[6]。IL28B的 SNP與24周干擾素療效的相關(guān)性尚未明確。我們參照2010年我國慢性乙型肝炎防治指南診斷標準[7]，選擇初次接受PegIFNα抗病毒治療的HBeAg陽性的CHB患者，依據(jù)24周療程的應(yīng)答療效，結(jié)合臨床基線水平，探討IL28B的 SNP與干擾素治療慢性乙肝的24周應(yīng)答療效的相關(guān)性，為選擇預測IFN的早期應(yīng)答指標提供參考，為選擇后續(xù)抗病毒方案提供參考。

1 資料與方法

1.1 一般資料

樣本量估算：參考文獻結(jié)果[8]，rs12980275基因型AA應(yīng)答率 38.0%，N-AA（AG/GG）應(yīng)答率21.3%；rs12979860基因型CC應(yīng)答率 38.6%，N-CC（CT/TT）應(yīng)答率 21.7%；rs8099917基因型TT應(yīng)答率 38.7%，N-TT（TG/GG）應(yīng)答率 20.5%；檢驗水準取0.05，檢驗效能取0.8，自由度為2，雙側(cè)檢驗，兼顧到不超過15%的脫失和失訪率，故擬納入初治的HBeAg陽性慢性乙型肝炎病例合計需要400例。我們隨機選擇2013年10月～2015年10月于廈門市中醫(yī)院肝病中心就診的接受初次抗病毒治療的HBeAg陽性慢性乙型肝炎患者400例，簽署知情同意書。接受PegIFNα治療，療程中有2例患者出現(xiàn)甲狀腺機能異常停藥，最終統(tǒng)計病例398例。診斷標準：參照2010年中華醫(yī)學會肝病學會發(fā)布的我國慢性乙型肝炎防治指南[7]。HBeAg陽性CHB的診斷標準：（1）HBsAg陽性；（2）；HBeAg陽性、抗HBe陰性；（3）HBV DNA陽性（≥500IU/ mL）；（4）ALT持續(xù)或反復升高（ULN 0-40 IU/L）；（5）肝穿刺活檢顯示肝組織炎癥活動度（分級≥G2或/和肝組織纖維化分期≥S2）[7]。

排除標準：具有下列任何1項者：（1）肝炎肝硬化；（2）血清總膽紅素≥3×ULN或直接膽紅素≥2×ULN；（3）合并自身免疫性疾病：甲狀腺機能亢進癥、甲狀腺炎、紅斑狼瘡、腎炎、風濕性關(guān)節(jié)炎、類風濕性關(guān)節(jié)炎等；（4）合并嚴重心臟??；（5）合并精神疾??；（6）合并糖尿病或糖耐量異常；（7）合并其他較嚴重疾??；（8）合并其他肝炎病毒感染或HIV感染；（9）妊娠，或擬1年內(nèi)妊娠；（10）近6個月內(nèi)曾接受抗病毒治療或免疫調(diào)節(jié)治療；（11）研究者認為依從性差。

1.2 治療方法

PegIFNα-2b每次100μg皮下注射，每周1次；或PegIFNα-2α每次180μg皮下注射，每周1次；療程24周后觀察是否達到應(yīng)答標準。

1.3 研究設(shè)立兩組觀察比較

（1）應(yīng)答組：ALT復常、HBV DNA＜500IU/mL、HBeAg血清轉(zhuǎn)換。（2）非應(yīng)答組：為未達到以上標準。

1.4 統(tǒng)計學分析

2 結(jié)果

所有病例治療前簽署知情同意書，完成肝穿活檢病理檢查，留取外周血檢測IL-28B 3個SNP位點RS8099917、RS12979860、RS12980275的多態(tài)性，及乙肝病毒基因型，血常規(guī)、生化學、乙肝病毒學：HBsAg、HBsAb、HBeAg、HBeAb、HBeAb、HBcAb，HBV DNA定量檢測。

2.1 血常規(guī)、生化學檢測

Beckman Coulter LH-750型全自動血細胞分析儀進行血常規(guī)檢測。Beckman Coulter LX-800型全自動生化分析儀進行肝功能相關(guān)指標檢測。

2.2 HBV血清標志物（HBVM）

HBsAg、HBsAb、HBeAg和HBeAb、HBcAb：采集患者的靜脈血液并分離出血清，按照羅氏Roche cobas e601型電化學發(fā)光分析儀檢測。其中HBsAg定量線性為：0.05 ～ 51200IU/mL。

2.3 HBV DNA定量

采集患者的靜脈血液并分離出血清，按照安普利 Gene Light 9800的操作步驟進行檢測。

2.4 全血標本IL28B基因多態(tài)性檢測及HBV基因分型檢測

2.4.1 核酸提取 實驗儀器：天隆NP968核酸提取儀。實驗耗材：天隆磁珠法核酸提取耗材TLHC003。試劑：天隆RNA/DNA提取試劑盒ZTLJB-Y64（磁珠法）。檢測流程：按照說明書加入蛋白酶K及待測樣品后，由核酸提取儀自動提取核酸樣品（病毒核酸與人基因組由此步共提）。

2.4.2 IL28B基因多態(tài)性檢測 實驗儀器：Biorad C1000 Thermal Cycler Biorad電泳儀；試劑：10mM dNTP混 合 液（Takara）；PFU酶；10*PFU Buffer；引物（生工生物）；DEPC水；瓊脂糖；核酸凝膠電泳Loading Buffer。檢測流程：采用直接測序的方法對標本的基因多態(tài)性及HBV基因型進行檢測，巢PCR擴增的流程：第一輪（配液體系）：10*PFU buffer 2ul；10mM dNTP 0.4μL；正向引物 0.4μL；反向引物 0.4μL；PFU 0.2μL；模板 5μL；DEPC水補齊至總體積為20μL。擴增條件為：95℃10min；（94℃40S，53℃ 40S，72℃ 60S）×35times；72℃10min。第二輪（配液體系）10*buffer 5μL；10mM dNTP 1μL；正向引物 1μL反向引物 1μL；PFU 0.5μL；模板 2μL；水補齊至總體積為50μL。擴增條件為：95℃10min；（94℃40S，53℃40S，72℃60S）×35times；72℃10min。引物信息見表1。

表1 引物信息

陽性PCR產(chǎn)物送測序，IL28B SNP基因型根據(jù)測序峰圖直接判讀基因型。HBV基因分型利用MEGA 5.0 構(gòu)建NJ進化樹進行分型，核酸陰性標本則以免疫學分型結(jié)果為準（見第三部分）。

2.4.3 HBV免疫學分型 ELISA雙抗夾心法。儀器：電熱恒溫培養(yǎng)箱；安圖PHOMO酶標儀。實驗流程：包板：分別包被HBV-16D12、HBV-6H3，每孔包被400ng，4℃包被過夜，洗板1次并甩干。NRA/HIV封閉液37℃封閉2h，洗板一次并甩干。檢測：加入10μL待測樣品和90μL 20% NBS，37℃溫育1h，洗板5次并甩干；加入酶標二抗SF-HRP（1∶2000稀釋），37℃溫育30min，洗板5次并甩干；顯色，終止，讀值。HBV-16D12陽性為B型，HBV-6H3為C型。

2.5 肝穿活檢

入選患者排除肝穿刺禁忌癥，簽署有創(chuàng)檢查知情同意書。超聲定位穿刺點，局部浸潤麻醉，超聲指引下用16G穿刺針采用1秒快速穿刺活檢，取長約2.0cm肝組織送檢。標本10%甲醛固定，石蠟包埋，組織切片，經(jīng)蘇木精紅（HE）染色及網(wǎng)狀纖維染色、Masson染色，制成4μm切片鏡檢，高年資病理醫(yī)師診斷。病理診斷參照2010年中華醫(yī)學會肝病學會發(fā)布的我國慢性乙型肝炎防治指南。

2.6 檢測結(jié)果

上述檢測指標中，治療初期完成肝穿活檢及檢測IL28B的SNP位點及HBV基因型，其余指標分別于治療初期、療程每個月末時檢測。見表2～6。

表2 IL28B的SNP基因型分布

通過表3中的3組數(shù)據(jù)比較，IL28B SNP基因型TT對比N-TT，CC對比N-CC，AA對比N-AA，在PegIFNα 24周應(yīng)答組與無應(yīng)答組的分布差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。

由表4可見，基線HBVDNA應(yīng)答組（6.9±1.3）log10IU/mL，無應(yīng)答組（7.2±1.2）log10IU/mL，兩者對比差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。基線ALT應(yīng)答組（5.9±4.1）×ULN，無應(yīng)答組（4.9±3.6）×ULN，對比差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。基線HBVDNA低水平、基線ALT高水平與高應(yīng)答相關(guān)。

表3 IL28B SNPs與PegIFNα24周應(yīng)答的比較

表5 IL28B單體型與應(yīng)答的關(guān)系

3 討論

慢性乙型肝炎的治療是長期的過程，清除HBV是治療的關(guān)鍵問題。HBV的治療以干擾素（IFN）為首選藥物，IFN分為1型（IFNα和β）、2型（IFNγ）和 3型（IFNλ）[9]。IL28B基 因 編碼3型IFNλ（IFNλ3），與IFNλ1（IL29編碼）及IFNλ2（IL28A 編碼）共同組成IFNλ家族。IL28A、IL28B及IL29基因位于第19號染色體，彼此緊密相鄰。根據(jù)分子結(jié)構(gòu)，3型IFN屬于白介素10超家族成員，但在功能上與1型IFN密切相關(guān)，具有抗病毒免疫調(diào)節(jié)作用。1型和3型IFN分別與細胞表面不同的受體結(jié)合，但進入細胞后的信號傳導通路相同，即通過JAK-STAT信號通路誘發(fā)IFN激活基因表達，這可能是IL28B基因多態(tài)性和IFN抗病毒療效相關(guān)的基礎(chǔ)。干擾素療效個體差異較大，對于HBeAg陽性CHB患者，PegIFN 個體化治療的選擇指征包括HBV基因型（A＞B＞C＞D）、HBV DNA水平（≤109IU/mL）、ALT水平（＞2×ULN）、病毒基因組（野毒株或前C區(qū)PC/核心啟動子BCP）、肝病嚴重程度（代償期）、年齡（較輕）、IL-28 B基因型（AA或CC）。宿主的遺傳背景與機體抗病毒免疫密切相關(guān)，由于遺傳的異質(zhì)性導致臨床表現(xiàn)的復雜性?；蜻z傳研究的根本在于研究探尋基因型（geno-type）與表現(xiàn)型（phenotype）的相關(guān)性。臨床基因診斷的策略：識別遺傳指標信息、臨床評估、臨床診斷、選擇合適的基因檢測、分析得到表型關(guān)聯(lián)的基因變異結(jié)果，得出臨床相關(guān)性分析和遺傳咨詢。Raglow等[10]研究認為肝臟中干擾素刺激基因（ISGs）其IL28B型表達明顯不同，為干擾素的不同治療選擇提供依據(jù)。機體長期感染HBV發(fā)病后，抗病毒免疫狀態(tài)極為復雜，涉及HBV病毒學如HBV的PC/BCP變異、機體免疫動力學，研究提示治療初期ALT高水平與PegIFNα療效密切相關(guān)，而治療初期低HBVDNA水平與機體免疫動力釋放相關(guān)。IL28B基因可通過降低HBV載量及調(diào)控肝臟炎癥來控制HBV感染的結(jié)局[8]。這與本研究觀察結(jié)果一致，治療初期慢性乙肝患者ALT高水平、低HBVDNA水平與干擾素應(yīng)答密切相關(guān)（P＜0.05）。本研究觀察發(fā)現(xiàn)IL28B的SNP基因型AA對比N-AA（P=0.804，OR0.916，95%CI0.460～1.825），CC對比N-CC（P=0.826，OR 0.921，95%CI0.442～1.921），TT對比N-TT （P=0.826，OR0.921，95%CI0.442～1.921），均發(fā)現(xiàn)SNP基因型在應(yīng)答組與無應(yīng)答組中分布無顯著性差異（P＞0.05）。IL28B的SNP單體型在應(yīng)答組與無應(yīng)答組中分布的比較，CT型（P=0.483，OR1.288，95%CI0.635～2.613）， TG型（P=0.944，OR0.974，95%CI0.466～2.034），無顯著性差異（P＞0.05），發(fā)現(xiàn)SNP單體型CT型、TG型與應(yīng)答無顯著相關(guān)。統(tǒng)計以上結(jié)果提示IL28B的SNP與PEG-IFNα 2 4周應(yīng)答無顯著相關(guān)性。然而，IFN治療后HBV下降及肝臟炎癥改善是一個逐步改變且較長時期的過程，IL28B對機體內(nèi)源性IFN的調(diào)控過程較長且機制較為復雜，有學者研究認為延長干擾素療程治療慢性乙肝效果更好[11]，其他學者采取個體化干擾素治療亦獲得更好的應(yīng)答療效[12]，PegIFNα24周的療程應(yīng)答療效并不能充分體現(xiàn)IL28B的SNP與干擾素應(yīng)答可能存在的相關(guān)性，應(yīng)做進一步研究，觀察48周或更長療程，或采用個體化治療觀察干擾素療效，以得出更為完善的最終評價。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)IL28B的SNP與PEGIFNα24周療效無明顯相關(guān)性，并不適合作為預判PegI-FNα的早期應(yīng)答療效指標。IL28B的SNP與 PegIFNα更長時期療程及個體化療程的相關(guān)性有待進一步探討研究。但本研究未對乙肝病毒基因組（野毒株或PC/BCP）做進一步檢測、未檢測IL28B次要基因型rs11881222及rs10853728、未納入肝炎肝硬化患者，可能對統(tǒng)計數(shù)據(jù)造成一定的影響。

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Investigation whether IL28B polymorphisms could affect the response of 24weeks treatment of Peginterferon alpha（PegIFNα）in chronic hepatitis B HBeAg-positive patients

HUANG Lijian XU Zhenxing WANG Guoliang YANG Jiaen
Center of Liver Disease, the TCM Hospital of Xianmen City, Xianmen 361001, China

ObjectiveTo investigate whether IL28B polymorphisms could affect the response of 24weeks treatment of Peginterferon alpha(PegIFNα) in chronic hepatitis B HBeAg-positive patients.MethodsA total of 398 hepatitis HBeAg-positive patients with 24week treatment of PegIFNα were enrolled in the study.Genotype analysis was performed for IL28B rs12980275,rs12979860 and rs8099917 using the direct sequencing method. Response was defined as cases showing normal aminotransferase(ALT) levels,HBV DNA level＜ 500IU/mL and HBeAg seroconversion.ResultsThe patients were infected with hepatitis B virus(HBV) genotype B(52.01%) and C(47.99%) With a total response rate of 42.6%.For the three SNPs,there were not significant differences between the response(R) and non- response(NR) groups in genotype distribution(P＞0.05). IL28B genotype at rs12980275 with R for AA versus N-AA(OR 0.916,95%CI 0.460-1.825, P=0.804), rs12979860 CC versus N-CC(OR 0.921,95%CI 0.442-1.921,P=0.826) and rs8099917 TT versus N-TT(OR 0.921,95%CI 0.442-1.921,P=0.826).ConclusionPolymorphisms in IL28B were not significant differences of response with 24weeks treatment of PegIFNα in HBeAgpositive CHB patients .

Chronic hepatitis B; IL28B; Peginterferon; Single nucleotide polymorphism; Treatment response.

R575.1

A

2095-0616（2016）19-13-05

2016-07-26）

福建省廈門市科技計劃項目（3502Z20134021；廈科聯(lián)[2013]27號）。