錢(qián)海豐，陳 思，金瑜劍

(1.浙江工業(yè)大學(xué) 環(huán)境學(xué)院，浙江 杭州 310014;2.浙江工業(yè)大學(xué) 海洋學(xué)院，浙江 杭州 310014； 3.浙江工業(yè)大學(xué) 生物工程學(xué)院，浙江 杭州 310014)

藻類(lèi)在除草劑生物毒性安全評(píng)估中的應(yīng)用

錢(qián)海豐1,2，陳 思2，金瑜劍3

(1.浙江工業(yè)大學(xué) 環(huán)境學(xué)院，浙江 杭州 310014;2.浙江工業(yè)大學(xué) 海洋學(xué)院，浙江 杭州 310014； 3.浙江工業(yè)大學(xué) 生物工程學(xué)院，浙江 杭州 310014)

農(nóng)藥殘留對(duì)生態(tài)系統(tǒng)的干擾和危害是全球性環(huán)境問(wèn)題.除草劑的使用量占農(nóng)藥的50%左右，其經(jīng)過(guò)雨水沖刷、地表徑流和地下水滲透等過(guò)程進(jìn)入水體，危害水生生態(tài)系統(tǒng)中藻類(lèi)的生長(zhǎng).作為初級(jí)生產(chǎn)者，藻類(lèi)相比于其他水生生物，對(duì)污染物更加敏感，加之其個(gè)體小、繁殖快，在短時(shí)間內(nèi)可獲得除草劑對(duì)藻類(lèi)種群水平的毒性效應(yīng)，因此常作為水質(zhì)檢測(cè)和水生毒性評(píng)估的模式生物.綜述了除草劑對(duì)藻類(lèi)生長(zhǎng)、生理生化、基因轉(zhuǎn)錄及蛋白表達(dá)等水平的研究進(jìn)展，揭示除草劑對(duì)藻類(lèi)毒性效應(yīng)的分子機(jī)理，為除草劑安全創(chuàng)制和使用提供理論依據(jù)，并且對(duì)組學(xué)技術(shù)在除草劑毒理機(jī)制研究上的前景作了展望.

除草劑；藻類(lèi)；組學(xué)

除草劑廣泛應(yīng)用于農(nóng)業(yè)和城市景觀管理，其用量約占農(nóng)藥50%左右[1].在使用過(guò)程中，除草劑中的很大一部分通過(guò)多種途徑進(jìn)入水生生態(tài)系統(tǒng)[2]，對(duì)水環(huán)境造成污染，并干擾包括藻類(lèi)在內(nèi)的水生生物的正常生長(zhǎng)[3-4].作為初級(jí)生產(chǎn)者，藻類(lèi)完成地球上90%的光合作用，為魚(yú)類(lèi)、兩棲類(lèi)和鳥(niǎo)類(lèi)等動(dòng)物提供氧氣和食物，在水生生態(tài)系統(tǒng)中具有至關(guān)重要的地位.因此，藻類(lèi)的組成和數(shù)量反映了水生態(tài)系統(tǒng)健康與否；對(duì)藻類(lèi)的危害將影響整個(gè)水生生態(tài)鏈，甚至通過(guò)食物鏈影響人類(lèi)健康.同時(shí)，藻類(lèi)多為單細(xì)胞生物[5]，個(gè)體小，繁殖快，易培養(yǎng)，且對(duì)各種外來(lái)物質(zhì)較為敏感，所以常作為水質(zhì)檢測(cè)和水生毒性評(píng)估的模式生物，在水生態(tài)系統(tǒng)保護(hù)、安全評(píng)估等方面均具有重要地位.就藻類(lèi)在除草劑生物毒性評(píng)估中的應(yīng)用，我們進(jìn)行綜述，從生理生長(zhǎng)、細(xì)胞結(jié)構(gòu)、分子水平等多個(gè)層次闡述了藻類(lèi)在除草劑毒理機(jī)制研究中的進(jìn)展，為綠色除草劑創(chuàng)制和除草劑的安全使用提供理論依據(jù).

1 除草劑對(duì)藻類(lèi)生理生化的影響

1.1 除草劑對(duì)藻類(lèi)生長(zhǎng)的影響

由于除草劑創(chuàng)制的初始靶標(biāo)多為光合作用生物，其在水生生態(tài)系統(tǒng)中首先影響藻類(lèi)和高等水生植物，其次為水生動(dòng)物.因此，藻類(lèi)生長(zhǎng)是除草劑生物毒性最敏感的指標(biāo).由于不同除草劑化學(xué)結(jié)構(gòu)和理化性質(zhì)不同，對(duì)藻類(lèi)的毒性存在較明顯差異.一些常用除草劑對(duì)小球藻的半致死質(zhì)量濃度(LC50)多在0.2×104～8.91×104μg/L[6].如草胺磷對(duì)斜生柵藻96 h的LC50=12 mg/L，而草丁膦質(zhì)量濃度在高達(dá)10～20 mg/L時(shí)，才對(duì)小球藻生長(zhǎng)產(chǎn)生明顯抑制效應(yīng)[7].藻類(lèi)對(duì)光合抑制型除草劑較為敏感，如百草枯在質(zhì)量濃度低至0.01 mg/L即可抑制小球藻[8]和藍(lán)藻的生長(zhǎng)[9]；而稍高質(zhì)量濃度的百草枯(0.03 mg/L)可明顯影響水生植物的生長(zhǎng)[10].另一常用光合抑制型除草劑阿特拉津?qū)Φ畺旁?2 h的LC50=43 μg/L，0.3 mg/L阿特拉津處理銅綠微囊藻96 h后，抑制率可高達(dá)78.6%[11].Yue等[12]研究表明：磺酰脲類(lèi)除草劑(如芐嘧磺隆)對(duì)淡水藻也存在非常明顯的毒性效應(yīng)，可在較低質(zhì)量濃度下對(duì)柵藻和小球藻產(chǎn)生抑制作用，其LC50為0.015～6.2 mg/L.一般而言，除草劑的抑制效果具有時(shí)間和質(zhì)量濃度效應(yīng)；而更高質(zhì)量濃度的除草劑在水體長(zhǎng)期殘留，會(huì)對(duì)水生動(dòng)物產(chǎn)生致畸或內(nèi)分泌干擾效應(yīng)，如干擾蛙類(lèi)的性腺發(fā)育[13]及斑馬魚(yú)的胚胎發(fā)育情況[14].由此可見(jiàn)，藻類(lèi)對(duì)除草劑的敏感性高于絕大多數(shù)水生高等植物或動(dòng)物，因此適合作為水質(zhì)檢測(cè)和水生毒性評(píng)估的模式生物.

1.2 除草劑對(duì)藻類(lèi)營(yíng)養(yǎng)吸收以及代謝途徑的影響

藻類(lèi)受除草劑脅迫后，不僅生長(zhǎng)受到影響，其營(yíng)養(yǎng)吸收以及次級(jí)代謝過(guò)程也將受到干擾[15].氮(N)、磷(P)即是藻類(lèi)生長(zhǎng)的必需營(yíng)養(yǎng)元素，同時(shí)也限制了藻類(lèi)的生長(zhǎng)[16].除草劑在水體中的殘留，可影響藻類(lèi)對(duì)水體N和P的吸收利用.研究表明：銅綠微囊藻在阿特拉津處理96 h后，N和P吸收顯著下降，進(jìn)而抑制葉綠素a和藻膽蛋白的合成；并且可直接影響次生代謝物如微囊藻毒素的合成.類(lèi)似現(xiàn)象在磺酰脲類(lèi)除草劑和其它有機(jī)污染物處理中也有發(fā)現(xiàn)[17].

光合作用是藻類(lèi)最重要的生理代謝過(guò)程之一，藻類(lèi)光合活性也是重要的環(huán)境監(jiān)測(cè)指標(biāo).一些除草劑通過(guò)破壞或抑制藻類(lèi)光合色素的合成來(lái)影響光合作用，特別是光合抑制型除草劑，它對(duì)藻的作用位點(diǎn)與其對(duì)高等植物的比較接近.研究表明：百草枯會(huì)導(dǎo)致小球藻葉綠素a、葉綠素b和總?cè)~綠素含量顯著性下降，抑制電子傳遞和二氧化碳固定[8].另一光合抑制型除草劑阿特拉津則可抑制銅綠微囊藻葉綠素a、藻紅蛋白(PE)、藻藍(lán)蛋白(PC)以及別藻藍(lán)蛋白(APC)的合成.Endo等[18]也利用葉綠素a熒光顯微成像技術(shù)分析了敵草隆對(duì)藻類(lèi)光合活性的影響，并認(rèn)為除草劑對(duì)未成熟藻造成的光合損傷大于對(duì)成熟藻細(xì)胞.除了通過(guò)抑制植物的光合作用，除草劑也可干擾靶標(biāo)生物呼吸作用、能量代謝，抑制脂肪酸生物合成等途徑來(lái)產(chǎn)生除草效應(yīng)，同時(shí)也會(huì)對(duì)非靶標(biāo)生物藻類(lèi)的抗氧化系統(tǒng)造成影響.大量研究發(fā)現(xiàn)：除草劑(如草丁膦、禾草靈酸)會(huì)直接或間接觸發(fā)活性氧類(lèi)物質(zhì)(Reactive oxygen species, ROS)，誘發(fā)藻類(lèi)的強(qiáng)氧化損傷，并由此引起脂質(zhì)膜氧化，增加丙二醛(MDA)的含量.如百草枯打破藻類(lèi)電子傳遞平衡，阻斷NADPH的形成，造成ROS的大量產(chǎn)生[19-20]，進(jìn)而影響藻類(lèi)的正常代謝.所以ROS和MDA可作為藻氧化損傷的生物標(biāo)志物.

在除草劑或其它逆境脅迫下，藻細(xì)胞抗氧化能力降低，使ROS的產(chǎn)生和清除動(dòng)態(tài)失衡，多余的ROS將對(duì)藻體造成不同程度的損傷.為消除或降低這種傷害，藻體內(nèi)的抗氧化系統(tǒng)被激活，誘導(dǎo)抗氧化酶活性增加[20-21].研究表明：64.3 μg/L的百草枯通過(guò)促進(jìn)萊茵衣藻ROS大量生成，同時(shí)也誘導(dǎo)超氧化物歧化酶(SOD)、過(guò)氧化氫酶(CAT)和過(guò)氧化物酶(POD)等活性，但藻細(xì)胞量和生長(zhǎng)率依然下降[22].阿特拉津也能誘導(dǎo)銅綠微囊藻細(xì)胞內(nèi)CAT和POD活性升高.但是MDA水平持續(xù)升高，表明阿特拉津誘導(dǎo)的抗氧化酶活性并沒(méi)有在短期內(nèi)完全去除ROS，造成脂質(zhì)過(guò)氧化損傷，細(xì)胞生理代謝受到影響，以至藻類(lèi)的生長(zhǎng)受到抑制.類(lèi)似現(xiàn)象在研究除草劑氟草煙(furoxypyr)對(duì)萊茵衣藻的作用中也有發(fā)現(xiàn)[23]，表明藻類(lèi)雖有一套完整的抗氧化酶產(chǎn)生體系，但當(dāng)環(huán)境中除草劑質(zhì)量濃度過(guò)高時(shí)，藻類(lèi)仍然會(huì)收到氧化損傷.

2 除草劑對(duì)藻類(lèi)細(xì)胞結(jié)構(gòu)和基因表達(dá)的影響

2.1 除草劑對(duì)藻類(lèi)亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)的影響

藻類(lèi)個(gè)體小、結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單，多為單細(xì)胞生物.除草劑可通過(guò)對(duì)藻體亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)(尤其是細(xì)胞器空間結(jié)構(gòu))的破壞，干擾藻類(lèi)的正常代謝.葉綠體是藻類(lèi)進(jìn)行光合作用的場(chǎng)所，占藻細(xì)胞體積的60%；其類(lèi)囊體是形成高能化合物(ATP)的場(chǎng)所，也是光合作用正常進(jìn)行必不可少的細(xì)胞器[24].有研究證實(shí)，廣譜性除草劑草甘膦[25]改變?cè)孱?lèi)葉綠體類(lèi)囊體片層結(jié)構(gòu)，使其結(jié)構(gòu)疏松，破壞葉綠體的完整性[7].對(duì)葉綠體結(jié)構(gòu)的破壞很可能是除草劑降低藻類(lèi)光合活性的主因.禾草靈除了改變銅綠微囊藻類(lèi)囊體之外，也可破壞氣泡等其他組織的超微結(jié)構(gòu)[26]；而2,4-D(2,4-二氯苯氧乙酸)則會(huì)造成斜生柵藻葉綠體萎縮，細(xì)胞壁變形[27].此外，除草劑處理也會(huì)造成藻細(xì)胞核結(jié)構(gòu)變化，并出現(xiàn)淀粉粒增加的現(xiàn)象.以上研究說(shuō)明藻類(lèi)亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)，特別是功能細(xì)胞器形態(tài)結(jié)構(gòu)的變化，也是污染物毒性的重要指標(biāo).

2.2 除草劑對(duì)藻類(lèi)基因轉(zhuǎn)錄的影響

為更深層次揭示除草劑的毒理機(jī)制，研究人員利用藻類(lèi)基因組相對(duì)簡(jiǎn)單，遺傳背景清晰等特點(diǎn)，從基因轉(zhuǎn)錄或表達(dá)水平來(lái)評(píng)估除草劑的生態(tài)風(fēng)險(xiǎn).對(duì)單細(xì)胞藻類(lèi)而言，光合作用是其生長(zhǎng)代謝最重要、最復(fù)雜的代謝過(guò)程.所以，對(duì)基因轉(zhuǎn)錄水平的影響更多集中在光合作用相關(guān)基因上，如編碼PSII反應(yīng)中心蛋白psb各亞基基因、編碼PSI反應(yīng)中心蛋白psa各亞基基因、編碼負(fù)責(zé)CO2固定Rubisco酶的基因rbcS和rbcL.它們作為光反應(yīng)和暗反應(yīng)的關(guān)鍵基因，可以結(jié)合多種電子傳遞輔因子的蛋白作為內(nèi)在天線分子，捕捉能量，并把光能轉(zhuǎn)化為化學(xué)能，決定藻類(lèi)的生長(zhǎng).多種除草劑都會(huì)對(duì)這些基因的轉(zhuǎn)錄表達(dá)產(chǎn)生影響，它們誘導(dǎo)或抑制psaB，psbA和rbcL等基因的轉(zhuǎn)錄，從而改變編碼蛋白的豐度，擾亂電子在光合系統(tǒng)中的正常傳遞.如百草枯處理可導(dǎo)致psaB和rbcL轉(zhuǎn)錄表達(dá)顯著下降，阻止PSI正常電子傳遞，抑制CO2的固定，阻礙光合作用暗反應(yīng)的進(jìn)行，抑制細(xì)胞生長(zhǎng)或分化[28].而草丁膦對(duì)光合作用基因的影響與之不同，它對(duì)藻內(nèi)psaB基因的表達(dá)有一個(gè)先誘導(dǎo)過(guò)程，隨后對(duì)其產(chǎn)生明顯的抑制效應(yīng).這可能是草丁膦并非光合抑制型除草劑，對(duì)光合作用相關(guān)基因的影響是間接的，因而需要較長(zhǎng)時(shí)間處理才會(huì)影響光合電子傳遞；且草丁膦類(lèi)除草劑毒性較小，藻細(xì)胞可通過(guò)提高光合作用相關(guān)蛋白的表達(dá)予以緩解，這也是細(xì)胞對(duì)外加環(huán)境脅迫的應(yīng)激反應(yīng)，借此維持細(xì)胞正常的光合作用[29].

除草劑對(duì)藻類(lèi)其他代謝途徑的影響也可通過(guò)干擾基因表達(dá)調(diào)控來(lái)實(shí)現(xiàn).以微囊藻毒素的合成為例：微囊藻毒素合成肽涉及到很多基因簇，主要包括mcyABC(縮氨酸合成酶)和mcyDE(混合聚酮縮氨酸合成酶)兩個(gè)操縱子[30]，其中mcyA，mcyD，mcyH是銅綠微囊藻毒素合成相關(guān)基因.研究證實(shí)，阿特拉津通過(guò)抑制銅綠微囊藻N和P相關(guān)基因的表達(dá)，影響藻細(xì)胞對(duì)N和P的吸收，進(jìn)而抑制微囊藻毒素基因mcyA，mcyD，mcyH的表達(dá)，減少藻毒素合成[11].有趣的是，除草劑還可以改變?cè)孱?lèi)生物鐘基因的表達(dá)節(jié)律來(lái)影響藻類(lèi)生理生化反應(yīng).目前，藍(lán)藻被證實(shí)是具有晝夜節(jié)律且最簡(jiǎn)單的生物，可通過(guò)生物鐘感受外界環(huán)境的周期性變化，調(diào)節(jié)自身生理活動(dòng).研究表明，藍(lán)藻細(xì)胞中大多數(shù)的基因都受到生物鐘基因調(diào)控，呈晝夜節(jié)律表達(dá)，從而控制多種生理代謝過(guò)程，如DNA復(fù)制和修復(fù)、能量轉(zhuǎn)換、膜運(yùn)輸和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、細(xì)胞生長(zhǎng)和死亡等多種生理功能[31-32].QIAN等[33]首次從生物鐘角度闡述除草劑對(duì)銅綠微囊藻的作用機(jī)理，并檢測(cè)其生物鐘和代謝相關(guān)基因表達(dá)以及微囊藻毒素釋放的晝夜節(jié)律變化，銅綠微囊藻光合作用基因的節(jié)律性表達(dá)可被阿特拉津干擾，從而抑制藻類(lèi)的光合作用[11].對(duì)銅綠微囊藻生物鐘及代謝活動(dòng)節(jié)律的研究，進(jìn)一步理解其生理代謝和生長(zhǎng)繁殖規(guī)律，對(duì)研究和預(yù)防水華的發(fā)生具有重要的意義[34-35].

3 組學(xué)技術(shù)在除草劑生物效應(yīng)評(píng)估中的應(yīng)用

組學(xué)的誕生使毒理學(xué)研究進(jìn)入新的時(shí)期，然而這些技術(shù)主要應(yīng)用于高等植物以及動(dòng)物的研究中[36]，在藻類(lèi)的毒理研究中應(yīng)用較少，部分研究主要集中在對(duì)重金屬毒理機(jī)制的分析上.借助于對(duì)差異表達(dá)蛋白質(zhì)的分離[37]，及生物同源性分析[38]，蛋白組學(xué)在藻類(lèi)毒理學(xué)中的應(yīng)用逐漸被重視.Xie等運(yùn)用蛋白組學(xué)技術(shù)揭示了鋁通過(guò)改變?nèi)呛种冈宓墓夂献饔谩喖?xì)胞結(jié)構(gòu)、蛋白表達(dá)等影響藻類(lèi)生長(zhǎng)的毒性機(jī)制[39].另外，蛋白組學(xué)也為闡明納米材料暴露以及有毒污染物對(duì)藻類(lèi)的生理影響提供更精確的證據(jù)[40].代謝組學(xué)在藻類(lèi)中的應(yīng)用也越來(lái)越普遍，藻類(lèi)的代謝產(chǎn)物反應(yīng)了藻類(lèi)自身新陳代謝情況，不僅影響藻類(lèi)生長(zhǎng)、細(xì)胞結(jié)構(gòu)，還可能干擾生存環(huán)境中其他生物[41-42].利用代謝組學(xué)研究環(huán)境因素對(duì)藻類(lèi)的影響、水華爆發(fā)成因及水體微生物種群演變逐漸成為當(dāng)前研究熱點(diǎn).如Lindahl等[43]利用代謝組技術(shù)研究了碳濃度變化對(duì)藻類(lèi)代謝物的變化.

Fan等[44]利用轉(zhuǎn)錄組學(xué)更全面的揭示了藻類(lèi)固碳過(guò)程中的基因表達(dá).然而，與陸生植物相比,藻類(lèi)基因組學(xué)研究尚未大規(guī)模展開(kāi)，僅在全基因組序列鑒定[45]和藻類(lèi)共培養(yǎng)方面有所應(yīng)用[46].為更確切直觀的在DNA序列水平了解藻類(lèi)基因組信息，獲得更重要的功能基因信息. Valledor等利用蛋白組學(xué)、代謝組學(xué)和qPCR等多種技術(shù)對(duì)Chlamydomonasreinhardtii在冷刺激壓力下的代謝變化，且分析了油脂代謝和糖代謝[47].同時(shí)借助于蛋白質(zhì)組學(xué)和代謝組學(xué)等組學(xué)技術(shù)，可為揭示藻類(lèi)應(yīng)對(duì)環(huán)境脅迫的分子調(diào)控機(jī)制提供重要信息[48].

4 結(jié) 論

研究除草劑脅迫對(duì)藻類(lèi)在不同生物學(xué)層面的影響及內(nèi)在機(jī)制，不僅可深入了解除草劑對(duì)水生生物的毒性效應(yīng)，也進(jìn)一步闡明除草劑對(duì)生態(tài)系統(tǒng)結(jié)構(gòu)和功能的整體影響，對(duì)于揭示農(nóng)藥在生態(tài)系統(tǒng)中的遷移和轉(zhuǎn)化規(guī)律，維護(hù)生態(tài)系統(tǒng)的健康有重要的現(xiàn)實(shí)意義.近年來(lái)，藻類(lèi)在除草劑安全性評(píng)估中的相關(guān)研究，包括了生理生長(zhǎng)、細(xì)胞結(jié)構(gòu)、光合作用、基因表達(dá)以及組學(xué)在毒理學(xué)研究中的最新應(yīng)用.但目前，多數(shù)工作僅停留在單一物質(zhì)的毒性效應(yīng)和毒理機(jī)制上，而對(duì)于環(huán)境因子(如光照、溫度等)變化對(duì)毒性的影響，以及模擬環(huán)境中多種污染物交互作用的研究還很有限.隨著農(nóng)業(yè)技術(shù)的發(fā)展，除草劑的需求量日益增長(zhǎng)，也陸續(xù)涌現(xiàn)了許多高效低毒的新型除草劑，而這些除草劑對(duì)植物作用機(jī)理以及水體生態(tài)系統(tǒng)的毒性風(fēng)險(xiǎn)尚不明確.此外，新型材料(如納米材料)的大量使用，使除草劑在環(huán)境中的遷移轉(zhuǎn)化過(guò)程更趨復(fù)雜.而與其他化合物的協(xié)同或拮抗作用也必將改變除草劑原有的毒性效應(yīng).這種聯(lián)合作用及所隱藏的復(fù)雜機(jī)理，難以藉由單一除草劑的毒理研究可以反映.因此，對(duì)除草劑的生態(tài)安全性評(píng)估仍需進(jìn)一步完善，亟待包括毒理學(xué)、生態(tài)學(xué)在內(nèi)的諸多相關(guān)領(lǐng)域科研工作者的努力與合作.

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Application of algae in evaluating the biological toxicity of herbicide

QIAN Haifeng1,2, CHEN Si2, JIN Yujian3

(1.College of Environment, Zhejiang University of Technology, Hangzhou 310014, China；2.Ocean College, Zhejiang University of Technology, Hangzhou 310014, China；3.College of Biotechnology and Bioengineering, Zhejiang University of Technology, Hangzhou 310014, China)

Herbicide residue made great impact on global environmental and ecological balance. In recent years, herbicide was widely used, and occupied approximately 50 percent of the usage of pesticides. In addition, herbicide enters aquatic system through storm, runoff and groundwater infiltration, which influences the growth of aquatic organisms. As primary producers, algae are more sensitive to pollutants than other aquatic organisms. Therefore, algae are the common species to be regarded as the model aquatic organisms to evaluate the toxicity of the herbicide. In this study, we reviewed the advance of herbicide toxicology focused on algal growth, physiology and biochemistry, gene transcription and protein expression levels, which is beneficial to new herbicide discovery and usage. Finally, the prospect of omics technologies used in herbicide toxicological research is summarized.

herbicide; alga; omics

(責(zé)任編輯：劉 巖)

2016-04-11

國(guó)家自然科學(xué)基金面上項(xiàng)目(21577128)；浙江省杰出青年基金資助項(xiàng)目(LR14B070001)

錢(qián)海豐(1973-)，男，浙江上虞人，教授，博士生導(dǎo)師，研究方向?yàn)榄h(huán)境毒理學(xué)，E-mail: hfqian@zjut.edu.cn.

X915.5

A

1006-4303(2017)01-0032-05