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馬鈴薯松散型胚性愈傷組織的誘導

2017-01-11 19:59史滟滪楊靜慧劉婷梁發(fā)輝
天津農業(yè)科學 2016年12期
關鍵詞:激素培養(yǎng)基

史滟滪++楊靜慧++劉婷++梁發(fā)輝++劉艷軍

摘 要:為了建立馬鈴薯松散型胚性愈傷組織體系,用于脫毒繁殖和誘變育種,試驗采用馬鈴薯塊莖為外植體,在含有不同濃度2,4-D,BA和MS的培養(yǎng)基上進行松軟型、松散型和胚性愈傷組織的誘導。結果顯示,在1/4 MS+1.0 mg·L-1 2,4-D+15 g·L-1蔗糖的培養(yǎng)基上可以誘導出松軟型馬鈴薯愈傷組織;在MS+0.5 mg·L-1 BA+0.25 mg·L-1 2,4-D+30 g·L-1蔗糖的培養(yǎng)基上,繼代3~5次,即可獲得松散型愈傷組織;在MS+1.0 mg·L-1 BA+1.0 mg·L-1 2,4-D+30 g·L-1蔗糖的培養(yǎng)基上,繼代5~8次,即可獲得松散型胚性愈傷組織。而且上述類型的愈傷組織生長迅速,結構特點突出。

關鍵詞:激素;培養(yǎng)基;繼代;脫毒培養(yǎng)

中圖分類號:S532 文獻標識碼:A DOI 編碼:10.3969/j.issn.1006-6500.2016.12.005

馬鈴薯是一種在我國具有高產量、高效益的適合廣大農作物地區(qū)耕作的糧食和經濟作物。近年來,我國廣大地區(qū)對馬鈴薯的栽培與育種方面的研究已取得了較多的突破,尤其是在馬鈴薯的組織培養(yǎng)方面取得了突出的成績[1-4]。馬鈴薯的脫毒培養(yǎng)已經被廣泛應用于馬鈴薯的種薯生產中,使用馬鈴薯脫毒種薯比沒脫毒的一般可增產30%~50%[5-10]。

目前,馬鈴薯脫毒培養(yǎng)主要依賴于莖尖脫毒技術,而采用松散型胚性愈傷組織進行組織脫毒的報道極少。用松散型胚性愈傷組織進行脫毒培養(yǎng)的方法可以獲得高效、優(yōu)質的無毒材料。

本研究旨在采用這一脫毒新途徑建立馬鈴薯無毒苗培養(yǎng)體系,為生產上獲得優(yōu)質無毒的馬鈴薯種源;本研究獲得的松散型胚性愈傷組織還可以用于體細胞誘變育種研究,可為馬鈴薯的育種拓寬途徑、奠定基礎。

1 材料和方法

1.1 試驗材料

本研究使用的馬鈴薯是購自天津市蔬菜市場的菜用馬鈴薯品種。

1.2 試驗方法

松軟型愈傷組織的培養(yǎng)方法:將馬鈴薯塊莖外植體接種到1/2,1/4 MS培養(yǎng)基中,其中分別加入0.25,0.5,1.0,2.0 mg·L-1的2,4-D,在接種10 d后在外植體傷口部位開始長出愈傷組織,經過大約40 d培養(yǎng)選擇生長迅速的、結構松軟的愈傷組織進行下一步培養(yǎng)。

松散型愈傷組織的培養(yǎng)方法:將所獲得的馬鈴薯松軟型愈傷組織,轉移到含有不同激素的松散型愈傷組織誘導培養(yǎng)基上,其中分別加入0.25,0.5,1.0,2.0 mg·L-1的生長素2,4-D和0.25,0.5,1.0,2.0 mg·L-1的細胞分裂素BA。經過3~5次繼代培養(yǎng)后(每10 d繼代一次),選擇結構松散的、生長迅速的愈傷組織進行下一步培養(yǎng)。

松散型胚性愈傷組織的培養(yǎng)方法:將上述獲得的松散型愈傷放入超凈臺中,再用解剖刀切成直徑3 mm的小塊,轉移到松散型胚性愈傷組織誘導培養(yǎng)基上。其中含有0.25,0.5,1.0,2.0 mg·L-1的生長素2,4-D和0.25,0.5,1.0,2.0 mg·L-1BA,或僅含有1.0,2.0 mg·L-1 BA及僅含有1.0 mg·L-1 2,4-D。經過5~8次繼代培養(yǎng)后(每20 d繼代一次),愈傷組織從外觀上出現(xiàn)了較大的變化,其中一些愈傷組織表面出現(xiàn)瘤狀顆粒,結構松散、質地緊密,在顯微鏡下可以看到愈傷組織細胞個體較小、細胞質濃度增大、細胞核較大,細胞處于旺盛的分裂狀態(tài),即為松散型胚性愈傷組織。

以上處理均為每個處理6個重復,每處理放置8塊外植體,培養(yǎng)基均為MS培養(yǎng)基,添加7.0 g·L-1瓊脂粉和30 g·L-1蔗糖,pH值調到5.8。1/2 MS培養(yǎng)基為無機鹽采用1/2,蔗糖15 g·L-1,瓊脂粉7 g·L-1,pH值為5.8;1/4 MS培養(yǎng)基為無機鹽采用1/4,其余同1/2 MS的用量。

2 結果與分析

2.1 生長素和MS倍數(shù)對馬鈴薯塊莖松軟型愈傷組織形成的影響

通過不同濃度的生長素和MS總濃度的改變,比較愈傷組織的誘導率和生長速度以及質地的變化,結果如表1所示。從表1可以看出,所有處理都能誘導出愈傷組織,說明馬鈴薯是一種容易誘導產生愈傷組織的植物,但從愈傷組織生長及質地情況來看,不同培養(yǎng)基差異較大。其中,MS的倍數(shù)對愈傷組織質地影響較大,當用1/4 MS培養(yǎng)基培養(yǎng)時,愈傷組織為軟愈傷;而用1/2 MS培養(yǎng)基培養(yǎng)時,愈傷組織都為較硬的愈傷;不同2,4-D激素濃度也影響著愈傷組織的生長速度,在1/2 MS處理組中,增加2,4-D質量濃度0.25 ~2.0 mg·L-1時,愈傷組織生長速度會逐漸增加;但在1/4 MS處理組中,當其濃度超過1.0 mg·L-1時,愈傷組織生長速度出現(xiàn)下降。所以,在本試驗中,當2,4-D的濃度為1.0 mg·L-1時,培養(yǎng)的愈傷組織是松軟型愈傷組織,且生長速度較快。因此,馬鈴薯誘導松軟型愈傷組織的最佳培養(yǎng)基配方為:1/4 MS+1.0 mg·L-1 2,4-D+15 g·L-1蔗糖。

2.2 激素對馬鈴薯塊莖松散型愈傷組織形成的影響

通過不同濃度的BA和2,4-D激素組合,比較愈傷組織的質地、顏色和生長速度以及結構的變化,結果如表2所示。從表2可以看出,在不同處理中,誘導出的愈傷組織多數(shù)為緊密型,其中,采用較低的2,4-D濃度培養(yǎng)時(0.25 mg·L-1),隨著BA濃度的增加,愈傷組織的質地逐漸變硬,愈傷組織結構也從松軟變得松散,但進而變得緊密,說明BA使用濃度不宜過大,否則會導致愈傷組織致密、硬化;當BA濃度為0.5 mg·L-1時,愈傷組織基本為松散型愈傷。在BA濃度不變時,增加2,4-D的用量,愈傷組織結構基本為緊密型,雖然愈傷組織質地從軟變硬,但基本都是一些生長速度較快的細胞緊密結合在一起,造成愈傷組織團結構緊密。因此,適當選擇2,4-D的濃度是獲得松散型愈傷組織的關鍵。

本試驗還發(fā)現(xiàn),隨著2,4-D濃度的增加,愈傷組織生長速度加快,雖然愈傷組織生長速度對于愈傷組織誘導有利,但過快則不能獲得理想的愈傷組織結構。綜上原因,對于誘導馬鈴薯松散型愈傷組織最理想的培養(yǎng)基為:MS+0.5 mg·L-1 BA+0.25 mg·L-1 2,4-D+30 g·L-1蔗糖。雖然培養(yǎng)基對于誘導馬鈴薯松散型愈傷組織十分必要,但繼代次數(shù)與繼代時間也很重要,在繼代轉移時將質地較硬的愈傷組織選擇下來也非常重要。

2.3 激素對馬鈴薯松散型胚性愈傷組織形成的影響

通過不同濃度的BA和2,4-D激素組合,比較愈傷組織的胚性、生長速度及其結構的變化,結果如表3所示。從表3可以看出,只加入BA或2,4-D激素時愈傷組織不能胚性化,單獨使用BA只能使得愈傷組織結構緊密,而單獨使用2,4-D只能使愈傷組織結構為松散型;當使用BA或2,4-D激素濃度為1.0 mg·L-1時,生長速度較快,而當激素濃度為2.0 mg·L-1時,生長速度有所下降。當加入一定濃度的BA和2,4-D激素組合時,愈傷組織部分或全部胚性化,愈傷組織結構松散型,生長速度隨激素濃度的增加而增加;但當2種激素組合的濃度達到2.0 mg·L-1時,愈傷組織結構變?yōu)榫o密型,生長速度及胚性都有所降低。

3 討 論

2,4-D在愈傷組織誘導過程中起決定性作用,其在一定濃度范圍內,濃度的增加有利于胚性愈傷組織的誘導 [11-14],但過高或過低的2, 4-D 濃度均不利于胚性愈傷組織的形成和分化再生 [15-18]??偟膩砜?,誘導效果最好的是使用2,4-D或配合其他分裂素一起誘導,關于2,4-D的使用濃度主要根據(jù)植物的特性而定。另外,外植體的種類與生長勢、培養(yǎng)溫度、培養(yǎng)基的滲透壓以及附加其他生長素等都會影響2,4-D的使用濃度。

松散型愈傷組織在繼代培養(yǎng)時進行正確的選擇是很關鍵的。在進行愈傷組織誘導過程中,除了要考慮培養(yǎng)基成分與培養(yǎng)條件,對不同愈傷組織的取舍也非常關鍵。在誘導初期選擇較為堅硬的愈傷組織進行培養(yǎng),然后對生長較快的愈傷組織進行繼續(xù)培養(yǎng),還應及早篩除一些質地很硬但并不松散的愈傷組織,否則會影響對松散型愈傷組織的正確選擇。

影響愈傷組織胚性化的因素既有內因,也有外因。內因主要是遺傳問題,不能改變,而外因則是可以選擇的。因此,要想獲得愈傷組織的胚性化就必須找到適合的培養(yǎng)條件,在這些因素中,激素是很重要的影響因子,分裂素對愈傷組織胚性化作用較大。此外,培養(yǎng)溫度、營養(yǎng)、滲透壓、濕度等逆境條件也會對愈傷組織胚性產生一定的影響??傊谶M行愈傷組織胚性化誘導中,正確選擇培養(yǎng)條件是試驗成功的關鍵。

4 結 論

通過對馬鈴薯松散型胚性愈傷組織誘導過程中試驗,得到了一套完整的誘導方法:采用馬鈴薯塊莖為外植體,在1/4 MS+1.0 mg·L-1 2,4-D+15 g·L-1蔗糖的培養(yǎng)基上誘導出松軟型愈傷組織;移入MS+0.5 mg·L-1 BA+0.25 mg·L-1 2,4-D+30 g·L-1蔗糖的培養(yǎng)基上,繼代3~5次,獲得松散型愈傷組織;再移入MS+1.0 mg·L-1 BA+1.0 mg·L-1 2,4-D+30 g·L-1蔗糖的培養(yǎng)基上,繼代5~8次后,即可獲得馬鈴薯松散型胚性愈傷組織。

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