王 強(qiáng) 韋 斌何勁松 陳廣琴 廣西中醫(yī)藥大學(xué)附屬瑞康醫(yī)院 530011 南寧市華東路10號(hào)

姜 浩 廣西中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院 530023

尹 瑋 廣西中醫(yī)藥大學(xué)2013級(jí)碩士研究生 530001

駱 虹 廣西中醫(yī)藥大學(xué)2014級(jí)碩士研究生 530001

冠通方對(duì)兔心肌缺血再灌注心肌細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)的影響

王 強(qiáng) 韋 斌*何勁松 陳廣琴 廣西中醫(yī)藥大學(xué)附屬瑞康醫(yī)院 530011 南寧市華東路10號(hào)

姜 浩 廣西中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院 530023

尹 瑋 廣西中醫(yī)藥大學(xué)2013級(jí)碩士研究生 530001

駱 虹 廣西中醫(yī)藥大學(xué)2014級(jí)碩士研究生 530001

目的：觀察冠通方對(duì)兔心肌缺血再灌注后心肌細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)的影響。方法：將48只新西蘭大白兔按隨機(jī)數(shù)字表法隨機(jī)分為假手術(shù)組、模型對(duì)照組、復(fù)方丹參滴丸對(duì)照組、冠通方大劑量組、冠通方中劑量組、冠通方小劑量組，每組各8只，分別灌胃給藥14 d。實(shí)驗(yàn)結(jié)束后取心肌標(biāo)本行透射電鏡觀察心肌細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)。結(jié)果：缺血再灌注模型組心肌細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)受到破壞，肌原纖維斷裂、溶解，肌原纖維排列混亂；線粒體水腫、線粒體內(nèi)嵴斷裂紊亂，線粒體腫脹呈近似圓形。復(fù)方丹參滴丸組，冠通方大、中劑量組心肌細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)形態(tài)較好，肌絲排列整齊，肌節(jié)明暗帶清晰可見(jiàn)，大部分線粒體外膜清晰完整，線粒體內(nèi)嵴排列較規(guī)整，基質(zhì)顆粒較多，部分肌絲出現(xiàn)斷裂，但多數(shù)肌原纖維條紋清晰，核仁明顯。結(jié)論：冠通方大、中劑量組可以明顯減輕缺血再灌注時(shí)心肌細(xì)胞結(jié)構(gòu)的損害，可以有效防止缺血再灌注后心肌細(xì)胞的凋亡，從而達(dá)到保護(hù)心肌細(xì)胞的作用。

冠通方；心肌細(xì)胞；缺血再灌注；超微結(jié)構(gòu)；實(shí)驗(yàn)研究

心肌缺血－再灌注損傷（myocardial ischemia reperfusion injury，MIRI）是指在心肌細(xì)胞缺血的基礎(chǔ)上，恢復(fù)心臟血液再灌注后，心肌細(xì)胞發(fā)生的功能障礙和結(jié)構(gòu)損傷。臨床上，當(dāng)阻塞的動(dòng)脈血管經(jīng)PCI術(shù)后再通，心肌細(xì)胞可重新獲得血液灌注，但在改善心肌血液循環(huán)和血氧供給的同時(shí)常常會(huì)出現(xiàn)缺血再灌注后心肌功能障礙與心肌細(xì)胞的損傷。中醫(yī)中藥可能對(duì)防治心肌缺血再灌注損傷發(fā)揮重要作用。本研究通過(guò)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)觀察中藥冠通方干預(yù)心臟再灌注損傷后心肌細(xì)胞的超微結(jié)構(gòu)病理變化，了解冠通方對(duì)心肌細(xì)胞的影響。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物分組 新西蘭大白兔48只，體重在2.5～3 kg，由廣西醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，生產(chǎn)許可證號(hào)SCXK（桂）2011－0003。兔適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后按隨機(jī)數(shù)字表法隨機(jī)分為A、B、C、D、E、F等6組，每組8只。A組為假手術(shù)組，B組為模型對(duì)照組，C組為陽(yáng)性對(duì)照組（復(fù)方丹參滴丸組），D組為冠通方大劑量組，E組為冠通方中劑量組，F(xiàn)組為冠通方小劑量組。

1.2 造模方法 經(jīng)耳緣靜脈注射戊巴比妥鈉30 mg·kg－1后，將兔背位固定，四肢皮下連接心電圖電極，記錄標(biāo)準(zhǔn)Ⅱ?qū)?lián)心電圖。頸部正中切開(kāi)皮膚，鈍性分離頸前肌，切開(kāi)氣管，插入Y型氣管插管，連接微型人工呼吸機(jī)（潮氣量10～15 ml/kg，頻率40次/分）。沿胸骨左緣3～4肋間隙開(kāi)胸，暴露心臟。采用5－0線結(jié)扎冠狀動(dòng)脈左前降支（LAD）法制備心肌缺血再灌注模型，為避免實(shí)驗(yàn)動(dòng)物心梗面積過(guò)大導(dǎo)致死亡，冠狀動(dòng)脈阻斷點(diǎn)應(yīng)在冠狀動(dòng)脈左前降支發(fā)向下發(fā)出約5－10 mm處選擇結(jié)扎位點(diǎn)，以心電圖出現(xiàn)ST段弓背抬高和結(jié)扎線以下心肌組織顏色變暗、局部節(jié)段性運(yùn)動(dòng)不良為結(jié)扎成功。待結(jié)扎40 min后剪斷手術(shù)線實(shí)現(xiàn)再灌注，灌注時(shí)間為2 h。以缺血區(qū)轉(zhuǎn)紅并反應(yīng)性充血、收縮活動(dòng)逐漸恢復(fù)、ST段恢復(fù)1/2以上為再灌注成功。假手術(shù)組只穿線不結(jié)扎，余操作同上。

1.3 試驗(yàn)藥物及給藥方法 冠通方藥物組成及劑量如下：三七45 g，生曬參100 g，丹參150 g，地龍150 g，全瓜蔞150 g，麥冬150 g，絞股藍(lán)150 g，陳皮100 g。冠通方由廣西中醫(yī)藥大學(xué)制藥廠按上述配方制成顆粒劑（每包含生藥4 g），分裝規(guī)格為每包3.5 g。復(fù)方丹參滴丸由天津天士力制藥股份有限公司生產(chǎn)，國(guó)藥準(zhǔn)字Z10950111，每粒27 mg，批號(hào)101210。根據(jù)人兔臨床用藥劑量換算公式換算成兔用藥量［1］。C組灌胃丹參滴丸54 mg/（kg·d），D組灌胃冠通方3.6 g/（kg·d），E組灌胃冠通方1.8 g/（kg·d），F(xiàn)組灌胃冠通方0.9 g/（kg·d）。兔分籠飼養(yǎng)，自由飲食，于每天早上8點(diǎn)灌胃給藥，假手術(shù)組和模型對(duì)照組予蒸餾水灌胃。各組均給藥14 d，末次給藥1 h后進(jìn)行標(biāo)本采集。

1.4 標(biāo)本處理及檢測(cè) 實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，處死兔子，剪下心臟，取左心室心肌缺血區(qū)心肌切成約2 mm× 1 mm×1 mm的條狀小塊，將心肌組織放入2.5%戊二醛固定過(guò)夜，用0.1 M、pH 7.0的磷酸緩沖液漂洗樣品3次，每次15 min，經(jīng)磷酸緩沖液沖洗后，再用1%鋨酸后固定1h，用梯度濃度（包括50%、70%、80%、90%和95%五種濃度）的乙醇溶液對(duì)樣品進(jìn)行脫水處理，每種濃度處理15 min，再用100%的無(wú)水乙醇處理2次，每次20 min。環(huán)氧樹(shù)脂Epon－812包埋劑包埋，超薄切片機(jī)切片，片厚70 nm，3%醋酸鈾－枸櫞酸鉛雙染色后，用H－7650日立透射電子顯微鏡觀察，主要觀察指標(biāo)：心肌細(xì)胞肌纖維、線粒體等。

2 檢測(cè)結(jié)果

假手術(shù)組心肌細(xì)胞內(nèi)肌原纖維紋理清晰，肌絲結(jié)構(gòu)完整，排列規(guī)則，肌原纖維的明帶和暗帶中粗細(xì)纖維清晰可見(jiàn)；細(xì)胞核呈規(guī)則圓形，細(xì)胞核內(nèi)染色質(zhì)分布均勻，線粒體嵴排列緊密，結(jié)構(gòu)形態(tài)完整，肌漿網(wǎng)無(wú)充盈無(wú)腫脹（見(jiàn)圖1－A）。

模型對(duì)照組心肌細(xì)胞肌原纖維紋理出現(xiàn)紊亂，肌絲結(jié)構(gòu)松散，部分心肌原纖維出現(xiàn)損害，心肌原纖維溶解或撕裂，閏盤結(jié)構(gòu)不完整，肌漿網(wǎng)擴(kuò)張；心肌細(xì)胞內(nèi)線粒體內(nèi)基質(zhì)顆粒減少，線粒體膜部分?jǐn)嗔?，?nèi)質(zhì)網(wǎng)擴(kuò)大，類似空泡樣變。細(xì)胞核外形不規(guī)則，核膜邊緣溶解，或褶皺變形，呈現(xiàn)齒狀或指狀突起，核質(zhì)雜亂，核仁溶解消失（見(jiàn)圖1－B）。

復(fù)方丹參滴丸對(duì)照組心肌細(xì)胞內(nèi)大部分心肌原纖維排列整齊，線粒體形態(tài)完整，大部分線粒體無(wú)明顯腫脹，線粒體內(nèi)嵴的排列規(guī)則，嵴較多，少部分心肌原纖維紊亂（見(jiàn)圖1－C）。

冠通方大劑量組心肌細(xì)胞內(nèi)大部分心肌原纖維排列整齊，線粒體形態(tài)完整，大部分線粒體無(wú)明顯腫脹，線粒體內(nèi)嵴的排列規(guī)則，內(nèi)嵴上基質(zhì)顆粒較多，少部分心肌原纖維紊亂（見(jiàn)圖1－D）。

冠通方中劑量組心肌原纖維和線粒體形態(tài)與冠通方大劑量組的基本結(jié)構(gòu)類似，心肌細(xì)胞內(nèi)大部分心肌原纖維排列整齊，大部分線粒體形態(tài)完整，無(wú)明顯腫脹，線粒體內(nèi)嵴的排列規(guī)則，線粒體內(nèi)基質(zhì)顆粒較多，少部分心肌原纖維紊亂（見(jiàn)圖1－E）。

冠通方小劑量組心肌細(xì)胞內(nèi)少部分心肌線粒體內(nèi)部結(jié)構(gòu)較完整，大部分線粒體內(nèi)嵴排列紊亂，出現(xiàn)嵴斷裂，基質(zhì)顆粒減少，線粒體輕度腫脹呈圓形，細(xì)胞內(nèi)可出現(xiàn)空泡樣變（見(jiàn)圖1－F）。

3 討論

缺血再灌注損傷的發(fā)生可能與鈣超載、氧自由基增多、心肌纖維能量代謝障礙、炎癥反應(yīng)、酸中毒等機(jī)制有關(guān)。心肌缺血缺氧再灌注后，心肌細(xì)胞內(nèi)線粒體內(nèi)嵴受到損傷，并出現(xiàn)線粒體功能障礙，心肌細(xì)胞能量供給異常；同時(shí)心肌細(xì)胞膜通透性增高，膜泵功能失調(diào)，可以導(dǎo)致心肌細(xì)胞內(nèi)發(fā)生結(jié)構(gòu)變化甚至變性、壞死或凋亡。同時(shí)缺血及再灌注后引起大量氧自由基產(chǎn)生，心肌細(xì)胞代謝產(chǎn)物堆積、不能被清除，從而破壞細(xì)胞膜的穩(wěn)定性，導(dǎo)致心肌細(xì)胞損害［2］。

冠通方方中三七、丹參、地龍活血化瘀，消腫止痛；瓜蔞清熱化痰；生曬參能補(bǔ)益脾氣；絞股藍(lán)益氣養(yǎng)陰，消熱解毒；麥冬能清熱養(yǎng)陰生津；陳皮能行氣燥濕化痰。諸藥合用則具有益氣養(yǎng)陰、清熱解毒化痰、行氣活血化瘀通絡(luò)之功［3］。方中君藥三七是廣西的特色藥材之一，現(xiàn)代藥理研究表明三七的主要成分是三七總皂苷（PNS），PNS有良好的抗氧化作用，能抵抗自由基對(duì)心肌缺血再灌注后導(dǎo)致的心肌細(xì)胞損傷［4］。顧國(guó)嶸等［5－6］通過(guò)酶學(xué)、形態(tài)學(xué)、免疫組織化學(xué)等研究表明，PNS能明顯減少缺血再灌流導(dǎo)致的心肌細(xì)胞壞死和凋亡，對(duì)缺血再灌流心肌起到延遲保護(hù)作用。生曬參和絞股藍(lán)都有一定的抗氧化作用。丹參能清除自由基，其成分中的丹參酮類、丹參素、丹酚酸類化合物、原兒茶醛、咖啡酸及迷迭香酸均具有很強(qiáng)的抗氧化作用。王慶高等［7］研究以丹參為主藥的中藥制劑，發(fā)現(xiàn)其可以抑制炎癥反應(yīng)而減少心肌缺血再灌注損傷。丹參有效成分丹參酮ⅡA可抑制細(xì)胞膜上的NADH/NADPH氧化酶的激活，提高SOD的活性，清除氧自由基并抑制脂質(zhì)過(guò)氧化反應(yīng)，保護(hù)血管內(nèi)皮細(xì)胞［8－9］。

圖1 各組兔心肌細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)比較

本研究結(jié)果表明，心肌缺血再灌注可損傷心肌細(xì)胞結(jié)構(gòu)，表現(xiàn)為線粒體不規(guī)則變形、線粒體腫脹、線粒體內(nèi)嵴排列紊亂、基質(zhì)顆粒減少或消失等變化，可見(jiàn)線粒體由正常的橢圓形逐漸變圓形、基質(zhì)顆粒減少。已有研究表明復(fù)方丹參滴丸［10－11］可以減輕心肌缺血再灌注損傷，對(duì)心肌細(xì)胞有保護(hù)作用，本研究結(jié)果與此類似。冠通方大劑量組、冠通方中劑量組心肌超微結(jié)構(gòu)中線粒體內(nèi)嵴排列較整齊、基質(zhì)顆粒無(wú)明顯減少；大部分肌原纖維排列整齊，肌絲無(wú)明顯斷裂，與復(fù)方丹參滴丸作用相似。這一結(jié)果可為臨床應(yīng)用冠通方抗心肌缺血、改善心肌缺血再灌注損傷提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

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（2016－11－15收稿/編輯 劉 強(qiáng)）

R541.4

A

1003-0719（2016）06-0071-03

國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目（項(xiàng)目批準(zhǔn)號(hào)：81160436）

*通信作者，E－mail：120771597＠qq.com