高旦華 蔡漢炯 蔣紅芳 何夢(mèng)甜 夏菁 馮曉燕

Ⅱ型神經(jīng)纖維瘤病的分子遺傳學(xué)研究進(jìn)展

高旦華 蔡漢炯 蔣紅芳 何夢(mèng)甜 夏菁 馮曉燕

Ⅱ型神經(jīng)纖維瘤?。∟F2）為NF2相關(guān)的常染色體顯性遺傳病，發(fā)病率約為1：210000，臨床表現(xiàn)多樣，早期診斷困難，治療復(fù)雜，預(yù)后效果差[1]。所以，在深入闡明其病理生理的基礎(chǔ)上，需要對(duì)其分子機(jī)制進(jìn)一步研究，開(kāi)展基因診斷和基因治療也將成為未來(lái)的研究熱點(diǎn)。1993年，Rouleau、Troffater同時(shí)克隆出了抑癌基因NF2，該基因編碼的蛋白質(zhì)Merlin主要分布于神經(jīng)系統(tǒng)和視網(wǎng)膜細(xì)胞的膜褶皺、細(xì)胞突觸和軸突上，通過(guò)調(diào)節(jié)細(xì)胞之間的接觸和細(xì)胞內(nèi)信號(hào)傳導(dǎo)來(lái)調(diào)節(jié)細(xì)胞的生長(zhǎng)速度和運(yùn)動(dòng)能力，主要表現(xiàn)為抑制細(xì)胞異常增殖，增加有絲分裂中G0/G1期比例，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。自NF2基因被發(fā)現(xiàn)，關(guān)于Merlin的研究已經(jīng)有了重要突破，但是關(guān)于其作用機(jī)制尚不明確[2]。本文在簡(jiǎn)單介紹NF2的臨床癥狀及遺傳特點(diǎn)的基礎(chǔ)上，主要圍繞Merlin展開(kāi)，對(duì)Ⅱ型神經(jīng)纖維瘤病的分子致病機(jī)制及最新研究進(jìn)展進(jìn)行總結(jié)，以期為臨床上的診斷提供啟示。

1 Ⅱ型神經(jīng)纖維瘤病的臨床癥狀

Ⅱ型神經(jīng)纖維瘤病屬于神經(jīng)皮膚綜合癥疾病之一，主要累及中樞神經(jīng)系統(tǒng)，以雙側(cè)聽(tīng)神經(jīng)瘤為顯著臨床特征[3]，常伴顱內(nèi)和脊髓的腦膜瘤、室管膜瘤、神經(jīng)膠質(zhì)瘤、遲發(fā)性晶狀體混濁、神經(jīng)末梢纖維瘤以及皮膚的神經(jīng)鞘膜瘤等[4]。該疾病患者通常在20～40歲之間出現(xiàn)臨床癥狀，而18%的患者以前已經(jīng)發(fā)病，最終發(fā)展至NF2的患者約90%表現(xiàn)為雙側(cè)聽(tīng)神經(jīng)瘤，一些成人NF2患者合并有單側(cè)感音神經(jīng)性耳聾（SNHL），更甚者是對(duì)稱或非對(duì)稱的雙側(cè)SNHL，呈現(xiàn)漸進(jìn)性聽(tīng)力下降，偶爾會(huì)發(fā)生突發(fā)性SNHL，可伴隨耳鳴、平衡失調(diào)和頭疼[5]。假如顱神經(jīng)上有神經(jīng)鞘瘤，或者顱神經(jīng)被巨大的聽(tīng)神經(jīng)瘤壓迫，最終會(huì)出現(xiàn)面部麻木、無(wú)力、吞咽困難及聲音嘶啞等癥狀。一般在聽(tīng)力下降之前，患者身上已經(jīng)存在皮膚和脊髓腫瘤，該癥狀在年齡＜15歲的患者中較為常見(jiàn)，在所有NF2患者中占70%～85%；80%～90%的NF2患者會(huì)發(fā)生無(wú)癥狀的脊髓腫瘤，25%～30%的患者會(huì)出現(xiàn)臨床表現(xiàn)，比如壓迫脊髓癥。

2 Ⅱ型神經(jīng)纖維瘤病的遺傳突變與表型

Ⅱ型神經(jīng)纖維瘤病是由抑癌基因NF2突變導(dǎo)致的、常染色體顯性遺傳的多腫瘤綜合征[5]。約50%的NF2病理表現(xiàn)為家族遺傳病史，另外50%的病例未發(fā)現(xiàn)明確的家族史，這類(lèi)患者可能是非遺傳因素導(dǎo)致的新的基因突變。該基因位于22號(hào)染色體一區(qū)二帶（22q12），含有17個(gè)外顯子。

NF2基因符合Knudson的腫瘤“兩次打擊學(xué)說(shuō)”（two-hit theory），即腫瘤只有在NF2基因的兩個(gè)等位基因都失活的情況下才會(huì)發(fā)生[4]。NF2的基因突變率約為6.5×10-6，迄今已確定＞200多種的NF2基因突變，包含插入和小基因缺失引起的閱讀框移位，點(diǎn)突變導(dǎo)致新終止密碼的形成，點(diǎn)突變改變的交接點(diǎn)，從而導(dǎo)致基因產(chǎn)物的異常；另外剪切位點(diǎn)突變也十分常見(jiàn)，比如外顯子跳躍、異常的成熟前終止密碼子[5]。查詢?nèi)祟?lèi)基因突變數(shù)據(jù)庫(kù)，發(fā)現(xiàn)Ⅱ型神經(jīng)纖維瘤病的致病突變包括：27.1%的無(wú)義突變和錯(cuò)義突變，26%的小片段缺失，24.5%的剪切突變，12.5%為大片段缺失，6.3%的小片段缺失，剩下的是一些罕見(jiàn)突變，如大片段的缺失[6]。

神經(jīng)纖維瘤?、蛐偷牟∷缆手饕苫蛐秃捅硇蜎Q定，其中錯(cuò)義突變引起的病死率比無(wú)義突變和移碼突變低，可能的原因是無(wú)義突變或移碼突變會(huì)導(dǎo)致蛋白質(zhì)截短，導(dǎo)致嚴(yán)重的臨床表現(xiàn)[7]。但是，錯(cuò)義突變和大片段的缺失使得蛋白產(chǎn)物不能形成，只會(huì)形成輕微的臨床表現(xiàn)。另外，疾病的嚴(yán)重程度還與剪接處的突變有關(guān)，突變位于第1～5個(gè)外顯子比位于第11～15個(gè)外顯子更為嚴(yán)重。

3 Merlin的結(jié)構(gòu)與功能

Merlin是NF2基因編碼的抑癌蛋白，包含595個(gè)氨基酸，在脊椎動(dòng)物中分子大小為70kDa，與紅細(xì)胞膜蛋白4.1超家族中的埃茲蛋白（Ezrin）、根蛋白（Radixin）和膜突蛋白（Moesin）非常相似。已知在人類(lèi)中存在10中亞型，主要為Ⅰ型和Ⅱ型：亞型Ⅰ含595個(gè)氨基酸殘基，由外顯子1～15和17拼接成；亞型Ⅱ含590個(gè)氨基酸，由外顯子1～15和16拼接而成[8]。該蛋白由3個(gè)部分組成：N端的FERM結(jié)構(gòu)域、中間的α螺旋和極性親水的C端[9]。只有在首尾自我聯(lián)合時(shí)才能抑制腫瘤的活性，而在兩種亞型中，只有亞型Ⅰ能夠形成首尾結(jié)構(gòu)[10]。

在功能方面，Merlin是一個(gè)細(xì)胞膜-細(xì)胞質(zhì)骨架蛋白，位于細(xì)胞膜和細(xì)胞骨架接口處，能夠調(diào)控細(xì)胞外信號(hào)介導(dǎo)的細(xì)胞遷移、細(xì)胞骨架重塑和細(xì)胞增殖[11]。研究表明，Merlin蛋白在調(diào)控細(xì)胞遷移和維持細(xì)胞正常形態(tài)上發(fā)揮著重要的作用，其功能的異常和缺失會(huì)影響體內(nèi)的某些促有絲分裂途徑、細(xì)胞骨架的形成和細(xì)胞粘附作用的大幅改變，最終導(dǎo)致腫瘤的發(fā)生[12]。

4 Merlin的相關(guān)蛋白

Merlin蛋白可以和許多跨膜或細(xì)胞內(nèi)蛋白相互作用，包括TRBP（一種反式作用因子）、eIF3c、PIKE、CD44、CD43、HA受體、FAT（鈣粘結(jié)蛋白）、整聯(lián)蛋白β1、layilin、DCC、NHE-RF/EBP50、樁蛋白、肌球蛋白、βⅡ膜收縮蛋白、微管蛋白、SCHIP蛋白、calpain蛋白、HRS（一種肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子）、NGB、Grb2、RhoGDI和CRM1/B輸出蛋白等[13]，是這些蛋白之間的錨定分子。下面詳細(xì)介紹幾個(gè)重要的相關(guān)蛋白。

TRBP是干擾素誘導(dǎo)的雙鏈RNA依賴性蛋白激酶（PKR）的調(diào)節(jié)蛋白，具有癌蛋白活性，能夠與核糖體發(fā)生相互作用，該蛋白的過(guò)量表達(dá)會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞的增殖加快[14]。Merlin與TRBP發(fā)生相互作用的區(qū)域是C末端殘基的288-595位，TRBP的過(guò)度表達(dá)使得細(xì)胞過(guò)度增殖，而Merlin能夠抑制TRBP的功能，從而抑制腫瘤的形成[15]。

eIF3c是真核轉(zhuǎn)錄起始因子，是啟動(dòng)蛋白質(zhì)翻譯所必須的。有研究指出，在腦膜瘤細(xì)胞中，Merlin和eIF3c的表達(dá)呈反向關(guān)系：Merlin通過(guò)與eIF3c結(jié)合，抑制其介導(dǎo)的蛋白質(zhì)翻譯過(guò)程[16]。另外，Lee等證明：當(dāng)細(xì)胞周期蛋白D1的表達(dá)過(guò)度時(shí)，Merlin對(duì)細(xì)胞增殖的抑制作用會(huì)減弱[17]。因?yàn)榧?xì)胞周期蛋白D1是一種翻譯控制蛋白，所以推測(cè)Merlin抑制信號(hào)的傳遞最終會(huì)作用于eIF3c，進(jìn)而控制蛋白質(zhì)翻譯的程度。

PIKE（phosphoinositide 3kinase enhancer）是一種能增強(qiáng)磷酸肌醇3激酶（PI3激酶）活性的GTP酶。之前有研究表明，PIKE可以與Merlin的N端發(fā)生相互作用，細(xì)胞中Merlin含量的增加能夠降低磷酸肌醇激酶的含量，抑制PI3激酶信號(hào)肽的活性，控制細(xì)胞增殖速度[18]。

5 Merlin的相關(guān)機(jī)制

5.1 Merlin的磷酸化 Merlin與ERM蛋白具有序列同源性，有3個(gè)結(jié)構(gòu)域：N末端的FERM結(jié)構(gòu)域、中間的α螺旋結(jié)構(gòu)域、C末端的FERM結(jié)構(gòu)域[11]。通過(guò)FERM結(jié)構(gòu)域Merlin蛋白可以結(jié)合大量的膜蛋白[19]。Akt導(dǎo)致Merlin在230位蘇氨酸殘基（T230）與315位絲氨酸殘基（S315-Merlin）上發(fā)生磷酸化[20]；PKA介導(dǎo)第10位蘇氨酸發(fā)生磷酸化（T10-Merlin），從而影響細(xì)胞骨架actin[21]；PKA和PAK1/2使得Merlin在第518位蘇氨酸（S518-Merlin）處發(fā)生磷酸化，并且不使蛋白發(fā)生降解[20]，但是該處的磷酸化使得Merlin的腫瘤抑制功能消失了[22]。

磷酸化是Merlin構(gòu)像和腫瘤抑制活性的一個(gè)關(guān)鍵調(diào)節(jié)點(diǎn)，磷酸化的發(fā)生阻礙了Merlin蛋白C端和N端的相互作用，導(dǎo)致其首尾結(jié)構(gòu)由有活性的“關(guān)閉”狀態(tài)轉(zhuǎn)變?yōu)闊o(wú)活性的“開(kāi)放”狀態(tài)，失去了對(duì)腫瘤的抑制作用[10]。Paola AG等[23]發(fā)現(xiàn)Merlin的在不同部位的磷酸化產(chǎn)生的影響并不相同：T230和S315會(huì)引發(fā)自身蛋白的降解，S518會(huì)使其喪失腫瘤抑制功能。

Merlin也可以通過(guò)與PAK1的PBD結(jié)構(gòu)域結(jié)合反饋性的抑制PAK1的活性[24]。肌球蛋白可以磷酸化MYPT1-PP1，同時(shí)低磷酸化Merlin使其活化。在神經(jīng)鞘瘤和腦膜瘤細(xì)胞中，Merlin蛋白還受到一種鈣離子依賴性半胱氨酸蛋白酶calpain的調(diào)控，其活化可以使蛋白Merlin裂解失活[11]。還有一些研究結(jié)果表明，大部分NF2家族性腫瘤綜合征患者都有N末端的FERM結(jié)構(gòu)域缺失[19]。

5.2 Hippo信號(hào)通路 Hippo信號(hào)通路，又名Salvador/Warts/Hippo（SWH）信號(hào)通路，通過(guò)調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖與促進(jìn)凋亡對(duì)器官大小和組織再生進(jìn)行控制，與腫瘤的發(fā)生發(fā)展有著直接的關(guān)系[25]。研究發(fā)現(xiàn)，該信號(hào)通路在進(jìn)化過(guò)程中高度保守，在果蠅和哺乳動(dòng)物中該信號(hào)通路上的許多相關(guān)蛋白高度同源。最近在果蠅中發(fā)現(xiàn)，Merlin蛋白定位于Hoppi信號(hào)通路的上游區(qū)域，對(duì)該通路起著調(diào)控作用[26]。相關(guān)研究表明，Merlin蛋白和Expanded蛋白調(diào)控Hippo通路的功能部分重疊，它們的突變可以增加細(xì)胞的分裂，減少凋亡[26]。無(wú)論在果蠅屬還是哺乳動(dòng)物中，Merlin蛋白都能激活Hippo通路，抑制腫瘤的形成。

5.3 PI3K/Akt/mTOR信號(hào)通路 PI3K/Akt/mTOR信號(hào)通路是細(xì)胞內(nèi)一個(gè)重要的調(diào)節(jié)細(xì)胞周期的信號(hào)通路，其與細(xì)胞分裂周期、增殖、癌癥和壽命直接相關(guān)。PI3K位于細(xì)胞膜上，能夠激活磷酸化和AKT[27]。AKT能夠激活CREB[28]、抑制p27[29]、使FOXO定位于細(xì)胞質(zhì)內(nèi)[29]、激活PtdIns-3ps[30]、激活會(huì)影響p70或4EBP1轉(zhuǎn)錄水平的mTOR[29]。之前的研究表明，許多因子，比如EGF[31]、shh[28]、IGF-1[28]、insulin[29]和CaM[30]，都會(huì)增強(qiáng)PI3K/AKT信號(hào)通路，而PTEN[32]、GSK3B[28]和HB9[31]會(huì)抑制該信號(hào)通路。

在許多腫瘤細(xì)胞中，該信號(hào)通路過(guò)度活躍，導(dǎo)致細(xì)胞凋亡減少、細(xì)胞過(guò)度增殖。已經(jīng)有研究證明，正常的Merlin蛋白直接結(jié)合于PIKE-L（磷酸激酶3激酶增強(qiáng)子）上，抑制其對(duì)PI3K（磷脂酰肌醇3激酶）的激活作用，使得PI3K/Akt的信號(hào)傳導(dǎo)被減弱，同時(shí)Akt可以反饋磷酸化的Merlin蛋白，促進(jìn)Merlin發(fā)生泛素化而降解。另一方面，Akt的磷酸化作用增強(qiáng)了Merlin和磷酸肌醇類(lèi)的親和性，使得Merlin預(yù)凋亡作用被抑制。而且，Akt的磷酸化作用和表皮生長(zhǎng)因子都會(huì)導(dǎo)致Merlin在細(xì)胞膜邊緣的聚集，促進(jìn)細(xì)胞的遷移[33]。5.4 MAPK/ERK信號(hào)通路 MAPK/ERK信號(hào)通路，又名Ras-Raf-MEK-ERK信號(hào)通路，主要是將細(xì)胞表面受體上的信號(hào)傳遞至細(xì)胞核中的DNA，由一系列的蛋白質(zhì)組成，比如MAPK（絲裂原激活蛋白激酶，最初命名為胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶，及ERK），蛋白質(zhì)之間的相互作用通過(guò)給相鄰蛋白增添一個(gè)磷酸集團(tuán)，磷酸化和去磷酸化代表蛋白的“開(kāi)關(guān)”[34]。當(dāng)信號(hào)通路中的某一蛋白質(zhì)發(fā)生突變時(shí)，該蛋白即處于激活或失活狀態(tài)，這是許多癌癥發(fā)展的由來(lái)。Ammoun等[35]研究表明，ERK活性和Merlin的調(diào)節(jié)作用緊密相關(guān)，在Merlin缺失的神經(jīng)鞘瘤中ERK的活性嚴(yán)重失調(diào)，所以當(dāng)Merlin的表達(dá)失調(diào)時(shí)，細(xì)胞表面的信號(hào)不能傳導(dǎo)至細(xì)胞核，細(xì)胞與細(xì)胞之間的信息傳遞紊亂，引起細(xì)胞的異常增殖，接觸抑制現(xiàn)象減弱。

6 結(jié)語(yǔ)

現(xiàn)階段，Ⅱ型神經(jīng)纖維瘤病診斷水平還停留在臨床、影像學(xué)及病理學(xué)診斷，為了提高診斷效率，基因診斷將成為必然趨勢(shì)。Merlin作為一個(gè)能和多種蛋白質(zhì)和信號(hào)肽發(fā)生相互作用的抑癌蛋白，其功能異常或缺失會(huì)影響體內(nèi)細(xì)胞的增殖，導(dǎo)致癌癥的發(fā)生。然而，人們尚不清楚哪條信號(hào)通路是Merlin影響神經(jīng)纖維瘤病Ⅱ型發(fā)生的關(guān)鍵。不過(guò)，隨著科研水平的不斷提高，科研人員將不斷加強(qiáng)NF2的分子生物學(xué)研究，深入了解該疾病的分子致病機(jī)制，一方面可以針對(duì)相應(yīng)機(jī)制中的蛋白開(kāi)發(fā)新藥，如PDK1抑制劑、Merlin代替物等，改善神經(jīng)纖維瘤?、蛐突颊叩闹委熜Ч?；另一方面能夠?qū)易逍圆±峁┲笇?dǎo)，比如產(chǎn)前診斷、計(jì)劃生育咨詢等，以及在基因水平進(jìn)行檢測(cè)，比如分子標(biāo)記物S518-Merlin。

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