胡傳欽 周麗萍 林德菊 余勤★

·綜述·

轉(zhuǎn)錄因子在誘導(dǎo)多能干細(xì)胞神經(jīng)分化中的作用研究

胡傳欽 周麗萍 林德菊 余勤★

2006年，Takahashi等[1]通過逆轉(zhuǎn)錄病毒為載體，將四種轉(zhuǎn)錄因子（Oct3/4、Soχ2、Klf4和c-Myc）轉(zhuǎn)染至小鼠成纖維細(xì)胞中，得到一種具有多能特性的細(xì)胞，被稱為誘導(dǎo)多能干細(xì)胞（iPSCs）。iPSCs在許多方面與胚胎干細(xì)胞相似度較高，諸如DNA甲基化、基因表達(dá)譜、表面抗原、表觀遺傳狀態(tài)及端粒酶活性等方面，并且具有向三胚層分化的特點(diǎn)[2]，因此，Yamanaka憑借iPSCs的成果獲得了2012年諾貝爾醫(yī)學(xué)或生理學(xué)獎(jiǎng)。目前，科學(xué)家們已經(jīng)利用iPSCs獲得了胰島細(xì)胞、干細(xì)胞、神經(jīng)細(xì)胞等不同類型的細(xì)胞，而且成功利用iPSCs培養(yǎng)出了小鼠成熟個(gè)體，證明iPSCs具有與ESCs一樣的全能性。同時(shí)，iPSCs又具有獨(dú)特的優(yōu)越性，其成功地規(guī)避了倫理道德問題，消除潛在的免疫排斥反應(yīng)，給細(xì)胞移植技術(shù)提供了可靠的原材料。

近年來，以阿爾茨海默病、帕金森病為代表或以中樞神經(jīng)系統(tǒng)功能障礙為主的神經(jīng)系統(tǒng)疾病越來越引起人們的關(guān)注，干細(xì)胞通過自我增殖和分化成神經(jīng)元細(xì)胞以替代已凋亡的神經(jīng)細(xì)胞成為臨床研究的熱點(diǎn)。研究證明，iPSCs在特定的細(xì)胞因子作用下能分化成神經(jīng)細(xì)胞[3]。蘇肖英等[4]發(fā)現(xiàn)神經(jīng)生長(zhǎng)因子（NGFs）顯著促使神經(jīng)干細(xì)胞（NSCs）分化為神經(jīng)元并促進(jìn)相關(guān)信號(hào)因子磷酸化，從而促使NSCs向神經(jīng)細(xì)胞分化。Atsukod等[5]發(fā)現(xiàn)一些生長(zhǎng)因子在視神經(jīng)退化過程中具有不同的表達(dá)變化?？梢娂?xì)胞因子在神經(jīng)細(xì)胞的生長(zhǎng)、增殖和凋亡過程中都扮演著不可或缺的角色。本文就iPSCs向神經(jīng)細(xì)胞分化過程中發(fā)揮主要作用的細(xì)胞因子做一綜述。

1 bHLH基因家族

堿性螺旋-環(huán)-螺旋基因家族（bHLH）能編碼多種轉(zhuǎn)錄蛋白因子，通過這些蛋白，細(xì)胞能夠向不同方向分化。bHLH家族基因上游富含堿性氨基酸可與相應(yīng)的基因片段結(jié)合，在基因的轉(zhuǎn)錄方面具有調(diào)控作用。

1.1 Hes1因子 Hes因子是bHLH轉(zhuǎn)錄抑制因子的一種，其與動(dòng)物神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育有關(guān)。迄今為止，研究者共發(fā)現(xiàn)了七種Hes基因，其中Hes1在成神經(jīng)分化過程中具有重要作用。Hes1基因編碼的Hes1蛋白具有一個(gè)特殊的保守bHLH結(jié)構(gòu)域，能與一些正調(diào)控的轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合。例如與促進(jìn)神經(jīng)元分化的Ascl1結(jié)合，抑制Ascl1的表達(dá)而發(fā)揮負(fù)向調(diào)控作用，其在細(xì)胞內(nèi)的高表達(dá)能使神經(jīng)祖細(xì)胞保持未分化狀態(tài)；而適當(dāng)表達(dá)則可以控制神經(jīng)干細(xì)胞進(jìn)行不同功能的分化。Hes1蛋白在不同的部位具有差異性表達(dá)，例如成年小鼠海馬中的齒狀回和CA3區(qū)的表達(dá)不同。Akihiro等[6]在研究黃芩苷對(duì)人iPSCs向神經(jīng)元方向分化的過程中發(fā)現(xiàn)，其能促進(jìn)iPSCs向神經(jīng)元分化和抑制向膠質(zhì)細(xì)胞分化，減少細(xì)胞中Hes1蛋白的表達(dá)水平，當(dāng)Hes1蛋白含量降低后，對(duì)iPSCs的抑制作用隨之減弱，最后促進(jìn)iPSCs向神經(jīng)方向分化。

1.2 Neurogenin（Ngn）基因 Ngn同樣是bHLH家族基因中的一員，主要在神經(jīng)前體細(xì)胞中表達(dá)，控制著神經(jīng)前體細(xì)胞的發(fā)育。Ngn基因家族主要包括Ngn1、Ngn2，具均能在神經(jīng)系統(tǒng)中得到表達(dá)，而且人類和其他哺乳動(dòng)物不完全相同。在哺乳動(dòng)物大腦皮質(zhì)發(fā)育過程中，Ngn1和Ngn2的表達(dá)具有差異性，表達(dá)部位和時(shí)期也不相同。Ngn與神經(jīng)元的分化成熟密切相關(guān)，在神經(jīng)發(fā)生的早期和晚期都需要Ngn1的表達(dá)，而Ngn2只在早期是必需的。Ngn1和Ngn2能與bHLH蛋白形成二聚體，通過堿性區(qū)域與帶電的DNA序列結(jié)合，啟動(dòng)組織特異性表達(dá)。Ngn1基因編碼的蛋白影響神經(jīng)細(xì)胞的分化過程，而且在不同種類動(dòng)物中具有不同的表達(dá)方式，其表達(dá)的特異性受到增殖的神經(jīng)祖細(xì)胞的限制。同時(shí)，Ngn1的表達(dá)伴隨著NSCs分化為神經(jīng)元的增加而增加，而當(dāng)細(xì)胞中β-catenin基因受到抑制時(shí)，Ngn1的表達(dá)會(huì)有所減少。同時(shí)研究發(fā)現(xiàn)，Ngn2基因在調(diào)控星形膠質(zhì)細(xì)胞分化為神經(jīng)元方面具有重要作用，主要通過促進(jìn)神經(jīng)蛋白的表達(dá)來實(shí)現(xiàn)，屬于bHLH家族的激活型基因。

2 神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子（NTF）

NTF作為一種多肽，能促進(jìn)神經(jīng)細(xì)胞存活、生長(zhǎng)、分化，并且與受體結(jié)合。其家族成員包括神經(jīng)生長(zhǎng)因子、腦源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子、神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子3/4等。近年來，又發(fā)現(xiàn)了睫狀神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子家族（CNTF）、成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子（IGF）和表皮生長(zhǎng)因子（EGF）等。神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子是一種小分子堿性蛋白，在成熟神經(jīng)系統(tǒng)中，在神經(jīng)元的死亡、突觸的可塑性、神經(jīng)遞質(zhì)傳遞和神經(jīng)再生等方面均有影響。

2.1 神經(jīng)生長(zhǎng)因子（NGF） NGF是發(fā)現(xiàn)于神經(jīng)家族生長(zhǎng)發(fā)育早期，對(duì)神經(jīng)元的生長(zhǎng)、發(fā)育、繁殖具有促進(jìn)作用的。

NGF細(xì)胞內(nèi)，與效應(yīng)細(xì)胞的膜受體結(jié)合，沿軸逆向轉(zhuǎn)運(yùn)，經(jīng)軸突至細(xì)胞核，引起生物學(xué)效應(yīng)。在神經(jīng)性疾病的研究中，NGF在疾病的發(fā)生、發(fā)展和預(yù)后中都有重要的作用。在神經(jīng)干細(xì)胞的誘導(dǎo)分化上，NGF處理后的干細(xì)胞激活細(xì)胞內(nèi)的PI3K/Akt信號(hào)通路，使PI3K激酶被激活，促使Akt轉(zhuǎn)位于質(zhì)膜上，轉(zhuǎn)位于質(zhì)膜上的Akt通過其308位蘇氨酸和473位絲氨酸的磷酸化而被激活[7]，這些研究成果證明，NGF能調(diào)控細(xì)胞內(nèi)神經(jīng)分化和決定細(xì)胞的命運(yùn)。

2.2 血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（EGF） EGF作為一種同源二聚體糖蛋白，在結(jié)構(gòu)上具有高度的保守性，在細(xì)胞分泌、血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖和增加血管通透性過程中具有重要作用。其作用于神經(jīng)EGF受體，參與神經(jīng)軸突的生長(zhǎng)，影響神經(jīng)細(xì)胞的分化，維持神經(jīng)細(xì)胞的存活，并且保護(hù)神經(jīng)元。在體外，EGF能夠促進(jìn)人胚胎干細(xì)胞神經(jīng)分化，通過激活Notch信號(hào)通路而發(fā)揮促神經(jīng)干細(xì)胞增殖作用。研究發(fā)現(xiàn)EGF對(duì)海馬等腦組織內(nèi)神經(jīng)發(fā)生區(qū)的神經(jīng)干細(xì)胞有促生長(zhǎng)、提高存活率和趨化作用[8]。

3 其他家族影響因子

3.1 Nanog影響因子 Nanog基因是原始生殖細(xì)胞及胚胎干細(xì)胞表達(dá)的重要轉(zhuǎn)錄因子，維持干細(xì)胞全能型和增殖分化。研究發(fā)現(xiàn)胚胎發(fā)育的早期，Nanog不表達(dá)于早期卵裂階段，而是在桑椹胚階段先表達(dá)[9]。而且，Nanog基因在胚胎干細(xì)胞內(nèi)高表達(dá)，誘導(dǎo)胚胎干細(xì)胞分化以后，Nanog的表達(dá)則會(huì)出現(xiàn)下調(diào)情況，表明維持胚胎干細(xì)胞的全能型與Nanog基因的表達(dá)有密切關(guān)系。自Takahashi等[1]通過病毒載體感染成纖維細(xì)胞而得到iPSCs后，發(fā)現(xiàn)其具有和胚胎干細(xì)胞類似的特性，比如增殖、多能性、表面標(biāo)記和向三胚層分化等方面。有研究者將小鼠iPSCs移植至小鼠體內(nèi)的囊胚腔，最后得到了具有繁殖能力的新成熟個(gè)體[10]。Liang等[11]發(fā)現(xiàn)在胚胎發(fā)育的早期，受到Nanog啟動(dòng)子轉(zhuǎn)換信號(hào)Nodal/Smad2的調(diào)節(jié)，Nanog基因能夠維持外胚層多能性的穩(wěn)定。由于iPSCs與胚胎干細(xì)胞的相似性，誘導(dǎo)iPSCs的分化表達(dá)后，Nanog基因會(huì)隨著分化成熟度而降低表達(dá)。

3.2 Sox2影響因子 20世紀(jì)90年代，科學(xué)家在研究決定性別的SRY基因是發(fā)現(xiàn)了一段保守的核苷酸序列，隨后學(xué)術(shù)界將與其相關(guān)的一類相似基因命名為Sox基因。隨著研究的深入，科學(xué)家發(fā)現(xiàn)Sox擁有多種亞族基因，這些基因在個(gè)體發(fā)育過程中發(fā)揮著重要作用，在性別決定和胚胎、神經(jīng)系統(tǒng)、循環(huán)系統(tǒng)的發(fā)育均有影響。其編碼的蛋白質(zhì)具有結(jié)合DNA的能力，是一類重要的轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子。Sox基因家族種類眾多，例如Sox4基因是B淋巴細(xì)胞增殖的重要因素，Sox1在胚胎期能調(diào)控感覺神經(jīng)元的發(fā)育。在神經(jīng)系統(tǒng)中，和神經(jīng)系統(tǒng)增殖分化有關(guān)的為Sox2。作為Sox轉(zhuǎn)錄因子家族成員之一，Sox2在細(xì)胞神經(jīng)發(fā)育早期對(duì)維持自我更新及多向分化潛能具有關(guān)鍵性的調(diào)節(jié)作用，對(duì)其自身的分化命運(yùn)具有重要的調(diào)控作用。Peretz等[12]發(fā)現(xiàn)小鼠后腦神經(jīng)干細(xì)胞池中，Sox2具有重要的調(diào)控作用。在小鼠后腦發(fā)育初期，Sox2+細(xì)胞的表達(dá)具有統(tǒng)一性；但是隨著發(fā)育過程的不斷進(jìn)行，部分細(xì)胞會(huì)呈現(xiàn)一種動(dòng)態(tài)的Sox2高表達(dá)，并且這些細(xì)胞的表面抗體（HBs）會(huì)受到抑制。研究還發(fā)現(xiàn)后腦區(qū)域中，Sox2調(diào)控神經(jīng)干細(xì)胞或神經(jīng)祖細(xì)胞分化過程中，一些細(xì)胞因子（如Pax6、FGF3、PLZF1、Id1等）在不同細(xì)胞、組織中表達(dá)發(fā)育順序相一致，而且在不同的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中具有相同的趨勢(shì)[13-14]。

3.3 Oct4影響因子 Oct4基因是POU轉(zhuǎn)錄因子家族中的一員，主要表達(dá)于胚胎干細(xì)胞、生殖干細(xì)胞中，其在維持胚胎干細(xì)胞的多能性和自我更新方面發(fā)揮著關(guān)鍵作用。目前，Oct4基因發(fā)現(xiàn)較早，是一種高度保守的基因，在人和小鼠方面研究較多，有維持胚胎干細(xì)胞多能性和自我更新的作用。Zhou等[15]發(fā)現(xiàn)Oct4轉(zhuǎn)錄因子在誘導(dǎo)神經(jīng)前體細(xì)胞重編程為iPSCs過程中，能提高重編程的有效率。同時(shí)在重編程過程中，穩(wěn)定的β-catenin蛋白的表達(dá)，可以使Oct4與細(xì)胞凋亡因子Survivin結(jié)合，從而加強(qiáng)重編程后iPSCs的存活率。Han等[16]發(fā)現(xiàn)利用轉(zhuǎn)錄因子Oct4等誘導(dǎo)的iPSCs能夠在體外成功分化為神經(jīng)干細(xì)胞，并且移植誘導(dǎo)后的神經(jīng)干細(xì)胞至PD大鼠的腦紋狀體能是大鼠的體外回旋功能試驗(yàn)得到提高，并且在體內(nèi)能夠分化為神經(jīng)元等細(xì)胞，說明Oct4轉(zhuǎn)錄因子參與誘導(dǎo)iPSCs向神經(jīng)方向分化。

4 iPSCs成神經(jīng)誘導(dǎo)分化的前景和展望

iPSCs在干細(xì)胞和生物學(xué)的研究領(lǐng)域具有里程碑式的意義，近年來取得一系列重大突破，使iPSCs臨床應(yīng)用又向前推進(jìn)了一步。在iPSCs的神經(jīng)分化方面，科學(xué)家們研究了不同細(xì)胞因子對(duì)iPSCs分化為神經(jīng)細(xì)胞過程中的作用，為臨床研究奠定了理論基礎(chǔ)。目前已知的能對(duì)干細(xì)胞向神經(jīng)分化的細(xì)胞因子種類仍然有限，相信隨著研究的不斷深入，iPSCs在神經(jīng)系統(tǒng)疾病的臨床治療中將會(huì)展現(xiàn)不可估量的應(yīng)用前景。

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國(guó)家自然科學(xué)基金（31570994），浙江省自然科學(xué)基金（LY15C100001）

310053 浙江中醫(yī)藥大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院

*通信作者