耿新倩，王從容

(上海交通大學附屬第六人民醫(yī)院內(nèi)分泌代謝科，上海市糖尿病研究所，上海市糖尿病重點實驗室，上海市糖尿病臨床醫(yī)學中心，上海 200233)

糖尿病是繼惡性腫瘤、心腦血管病之后的第三大慢性非傳染性疾病，其患病率呈逐年升高趨勢。據(jù)估計，全球糖尿病患病人數(shù)將從2015年的4.15億上升到2040年的6.42億[1]。糖尿病主要由胰島B細胞功能受損和(或)胰島素生物作用缺陷所致，隨病程進展可發(fā)生心血管疾病、視網(wǎng)膜病變等嚴重并發(fā)癥[2]，嚴重影響患者生活質(zhì)量并帶來沉重經(jīng)濟負擔。目前，大量研究主要從分子、代謝產(chǎn)物、免疫等多個方面探究糖尿病發(fā)病機制，但具體機制尚無統(tǒng)一定論，因而尋找新方法深入研究其病理生理機制具有重大意義。

生物力學現(xiàn)已發(fā)展成有助于研究人類疾病的新興領域。研究表明，疾病不僅引起人體生物功能改變，還可導致病變細胞表面形貌和力學特征異常[3,4]。

因此，了解細胞力學性能可以為病因?qū)W研究提供新視角。原子力顯微鏡(atomic force microscopy，AFM)具有皮牛級力學分辨率和納米級空間分辨率，能在近生理狀態(tài)下研究細胞和組織超微結(jié)構[5,6]。通過在納米尺度下觀察樣品形貌特征和測量其楊氏模量等力學參數(shù)[7]，并將其與疾病相關聯(lián)，可為疾病的早期監(jiān)測及病理機制研究提供有力線索。本文主要就AFM在糖尿病及其并發(fā)癥研究中的相關應用作一綜述。

1 AFM的工作原理及檢測特性

AFM是1986年由Binnig等[6]首次提出，主要由壓電掃描器、微懸臂和針尖、光學偏轉(zhuǎn)系統(tǒng)及電反饋系統(tǒng)四個核心部件構成；根據(jù)針尖與樣品相互作用力的不同形式，其工作模式分為3種：接觸模式、非接觸模式和輕敲模式。

AFM最基本的功能是通過探測彈性微懸臂上裝載的納米級針尖與被測樣品間的相互作用力而獲得樣品表面形貌信息，對表面進行整體圖像分析即可得到樣品的高度、寬度、表面粗糙度等參數(shù)[8]。AFM的另一個重要功能是通過測量微懸臂和樣品間作用力隨距離的變化而獲得力-距離曲線。運用合適的模型將記錄的力-距離曲線擬合成相應的力-壓痕曲線，根據(jù)后者可獲得所測樣品區(qū)域的彈性模量及黏附力等信息[9]。AFM綜合高分辨率成像和力-距離曲線測量特點，可得到傳統(tǒng)測量手段無法獲得的參數(shù)，諸如樣品表面粗糙度、高度等形貌參數(shù)及黏彈力等力學性能。

2 AFM在糖尿病研究中的應用

糖尿病與氧化應激緊密相關，外周血紅細胞尤其容易受到氧化應激損害。2010年，Jin等[10]運用AFM測量紅細胞，發(fā)現(xiàn)與年齡匹配的正常人相比，糖尿病患者的紅細胞在形態(tài)學上表面粗糙度增加[(690.2±71.7)vs(1333.5±55.2)nm]，而細胞的峰谷差和細胞表面積/體積比減?。辉诹W性能方面，糖尿病患者紅細胞硬度[(1.53±0.41)×105vs(1.78±0.39)×105N/m2]和黏附力[(420±25)vs(510±63)pN]均增加。另一項針對2型糖尿病的研究亦發(fā)現(xiàn)，2型糖尿病患者的紅細胞膜楊氏模量較健康人增大，說明該病變細胞硬度增大，變形性減小[11]。紅細胞表面積/體積比減小、硬度增加會導致細胞變形能力下降，引起血液黏度增高、阻力增大、組織缺氧等，這可能是2型糖尿病患者心血管疾病的發(fā)病率和死亡率高于非糖尿病者的重要原因。

Zhang等[12]運用單分子力譜技術，通過將胰島素修飾在AFM探針上，研究1型糖尿病酮癥酸中毒患者紅細胞膜上胰島素受體與胰島素的相互作用。與正常人相比，患者紅細胞膜上的胰島素受體與胰島素間結(jié)合率[(17±3)%vs(12±2)%]和結(jié)合力均下降，且結(jié)合后復合物穩(wěn)定性亦降低，揭示胰島素受體功能缺陷。該技術從單分子水平為1型糖尿病酮癥酸中毒致病機制提供了新穎的實驗證據(jù)，具有傳統(tǒng)研究技術無法比擬的優(yōu)越性。

3 AFM在糖尿病并發(fā)癥研究中的應用

3.1 糖尿病心血管疾病

糖尿病是公認的心血管疾病危險因素之一。2014年Benech等[13]首次利用AFM研究糖尿病動物左心室心肌細胞的力學性能，研究者在近生理狀態(tài)下測量從糖尿病小鼠中分離的心肌細胞，發(fā)現(xiàn)糖尿病組心肌細胞表觀彈性模量比正常對照組高112%[(91±14)vs(43±7)kPa，P<0.01]；且糖尿病組心肌細胞的硬度和黏附力均大于對照組。該研究從納米水平表明糖尿病會影響心肌細胞的力學性能。2014年,Akhtar等[14]對大鼠主動脈纖維素微纖絲進行AFM檢測，發(fā)現(xiàn)與正常大鼠相比，糖尿病大鼠的微纖絲長度減小、延展性降低，但微纖絲上典型重復距離數(shù)增大[(57.2±0.6)vs(59.2±0.8)nm]。由此可見高血糖狀態(tài)下血管存在大分子積累損害，并且由于微纖絲在組織中有較長的半衰期，因此,其可能會成為糖尿病病程進展中組織重塑的結(jié)構生物標志物。

3.2 糖尿病腎病

糖尿病腎病是糖尿病微血管病變引起的一種長期并發(fā)癥。有明確證據(jù)表明轉(zhuǎn)化生長因子β1(transforming growth factor beta 1，TGF-β1)是導致早期腎小管損傷的最主要介質(zhì)[15]。2012年Hills等[16]發(fā)現(xiàn)高糖處理HK2細胞可增加其TGF-β1的分泌，且TGF-β1可使細胞最大分離力減少20%，分離能降低53%，即TGF-β1可降低兩個細胞間的黏附力。此研究表明，糖尿病狀態(tài)下TGF-β1誘導上皮細胞間充質(zhì)轉(zhuǎn)化，促使近端小管細胞黏附力和細胞間通訊缺失，并且這些改變出現(xiàn)在明顯腎臟損害之前。2016年,Siamantouras等[15]利用AFM研究糖尿病腎病，亦發(fā)現(xiàn)TGF-β1處理后的HK2細胞黏附力降低，運用赫茲模型根據(jù)力-距離曲線計算出細胞的彈性模量后發(fā)現(xiàn)其彈性模量增加70%，即細胞硬度增大。TGF-β1可能通過影響細胞骨架重組而導致細胞力學性能發(fā)生變化，顯性糖尿病腎病出現(xiàn)之前，腎臟上皮細胞力學性能就已發(fā)生明顯改變，因此，AFM有望成為早期診斷糖尿病腎病的強大工具。

3.3 糖尿病視網(wǎng)膜病變

研究表明，約25%的1型或2型糖尿病患者會發(fā)生視網(wǎng)膜病變，導致視力下降甚至失明[17]。To等[18]對13例糖尿病患者捐贈的眼球進行研究，發(fā)現(xiàn)與正常人相比，糖尿病患者視網(wǎng)膜內(nèi)界膜變厚，硬度增大[(37.9±1.2)vs(24.3±1.2)kPa]。這些變化可能與糖尿病患者視網(wǎng)膜含有較高密度的蛋白和含水量較低有關，使得基底膜易碎，從而發(fā)生視網(wǎng)膜病變。

此外，視網(wǎng)膜微血管內(nèi)皮細胞的激活是糖尿病視網(wǎng)膜病變早期至關重要的步驟。動物實驗表明，糖尿病鼠的視網(wǎng)膜微血管內(nèi)皮細胞的賴氨酰氧化酶(lysyl oxidase，LOX)表達水平增高[19]。2016年,Yang等[20]研究視網(wǎng)膜內(nèi)皮細胞發(fā)現(xiàn)，高糖組內(nèi)皮下基質(zhì)硬度是正常含糖組的2倍，而經(jīng)LOX抑制劑處理后，增加的基質(zhì)硬度水平有所下降。因此，這可能是高糖狀態(tài)下LOX表達上調(diào)、從而使內(nèi)皮下基底膜硬度增加、進而激活內(nèi)皮細胞引起視網(wǎng)膜炎癥、最終發(fā)生糖尿病視網(wǎng)膜病變的分子生物學機制。

3.4 糖尿病神經(jīng)病變

糖尿病神經(jīng)病變亦是糖尿病最常見的并發(fā)癥之一，可累及約50%的1型或2型糖尿病患者[21]。Wang等[22]運用AFM從納米水平研究糖尿病鼠神經(jīng)發(fā)生的細微結(jié)構改變。研究者對鼠坐骨神經(jīng)內(nèi)膜、外膜及尾部肌腱的膠原纖維進行測量，發(fā)現(xiàn)糖尿病鼠的膠原纖維直徑均比對照鼠大；并且糖尿病病程越長，神經(jīng)和肌腱中膠原纖維的變化越明顯。糖尿病時神經(jīng)的這種結(jié)構改變可能與神經(jīng)內(nèi)膜壓力和力學性能變化有關，尚需要更多的AFM研究來進一步證實。

3.5 糖尿病皮膚病變

糖尿病也會造成皮膚損害，約30%～70%的糖尿病患者會發(fā)生皮膚病變[23]。2016年，Argyropoulos等[24]對糖尿病患者(45～62歲)和年齡與之匹配的正常人活檢得到的皮膚進行研究，并使用AFM測量真皮層的納米級形態(tài)和力學性能，發(fā)現(xiàn)糖尿病患者真皮層膠原纖維排列紊亂，粗糙度比正常人增加176%。在力學性能方面，與正常人相比，糖尿病患者膠原纖維的牽引力、抗拉強度分別增加182%和197%，但變形性降低58%。以上數(shù)據(jù)表明，糖尿病患者皮膚真皮層結(jié)構會發(fā)生改變，這些改變可能是發(fā)生糖尿病的早期征象及其內(nèi)部并發(fā)癥[25]的預警信號，對臨床醫(yī)師早期開展糖尿病篩查具有提示作用。

3.6 糖尿病骨骼病變

糖尿病對多器官系統(tǒng)可產(chǎn)生不利影響，糖尿病患者骨折風險亦增加[26]。在一項動物實驗中，Hammond等[27]運用AFM觀察來自脛骨和肌腱的膠原纖維，均發(fā)現(xiàn)糖尿病大鼠的膠原纖維間距比正常大鼠更寬、移位更大，且兩者有顯著性差異(P<0.05)，此變化在肌腱中更明顯。該研究揭示，糖尿病會誘導骨骼中膠原纖維發(fā)生形態(tài)改變，推測可能亦存在相關力學性能改變，從而使糖尿病患者的骨骼質(zhì)量改變，進而增加骨折風險。

4 展 望

綜上所述，利用AFM研究細胞、組織結(jié)構的表面微觀形貌和納米級機械性能，有利于從納米水平了解糖尿病及其并發(fā)癥的發(fā)病機制，輔助疾病的早期診斷，并為疾病的臨床研究及治療提供新依據(jù)和新思路。相信隨著分子生物學技術的不斷完善和進展，AFM在糖尿病的研究中必將發(fā)揮更加重要的作用。

【參考文獻】

[1] Zimmet P, Alberti KG, Magliano DJ,etal. Diabetes mellitus statistics on prevalence and mortality: facts and fallacies[J]. Nat Rev Endocrinol, 2016, 12(10): 616-622. DOI: 10.1038/nrendo.2016.105.

[2] Balakumar P, Arora MK, Ganti SS,etal. Recent advances in pharmacotherapy for diabetic nephropathy: current perspectives and future directions[J]. Pharmacol Res, 2009, 60(1): 24-32. DOI: 10.1016/j.phrs.2009.02.002.

[3] Hayashi K，Iwata M. Stiffness of cancer cells measured with an AFM indentation method[J]. J Mech Behav Biomed Mater, 2015, 49: 105-111. DOI: 10.1016/j.jmbbm.2015.04.030.

[4] Lee GY，Lim CT. Biomechanics approaches to studying human diseases[J]. Trends Biotechnol, 2007, 25(3): 111-118.

[5] Lehenkari PP, Charras GT, Nykanen A,etal. Adapting atomic force microscopy for cell biology[J]. Ultramicroscopy, 2000, 82(1-4): 289-295.

[6] Binnig G, Quate CF, Gerber C. Atomic force microscope[J]. Phys Rev Lett, 1986, 56(9): 930-933. DOI: 10.1103/Phys RevLett.56.930.

[7] Ikai A. A review on atomic force microscopy applied to nano-mechanics of the cell[J]. Adv Biochem Eng Biotechnol, 2010, 119: 47-61. DOI: 10.1007/10_2008_41.

[8] Girasole M, Pompeo G, Cricenti A,etal. Roughness of the plasma membrane as an independent morphological parameter to study RBCs: a quantitative atomic force microscopy investigation[J]. Biochim Biophys Acta, 2007, 1768(5): 1268-1276. DOI:10.1016/j.bbamem.2007.01.014.

[9] Dufrene YF, Pelling AE. Force nanoscopy of cell mechanics and cell adhesion[J]. Nanoscale, 2013, 5(10): 4094-4104. DOI: 10.1039/c3nr00340j.

[10] Jin H, Xing X, Zhao H,etal. Detection of erythrocytes influenced by aging and type 2 diabetes using atomic force microscope[J]. Biochem Biophys Res Commun, 2010, 391(4): 1698-1702. DOI: 10.1016/j.bbrc.2009.12.133.

[11] Pretorius E, Bester J, Vermeulen N,etal. Poorly controlled type 2 diabetes is accompanied by significant morphological and ultrastructural changes in both erythrocytes and in thrombin-generated fibrin: implications for diagnostics[J]. Cardiovasc Diabetol, 2015, 14: 30. DOI: 10.1186/s12933-015-0192-5.

[12] Zhang L, Pi J, Shi Q,etal.Insitusingle molecule detection of insulin receptors on erythrocytes from a type 1 diabetes ketoacidosis patient by atomic force microscopy[J]. Analyst, 2015, 140(21): 7407-7416. DOI: 10.1039/c5an01417d.

[13] Benech JC, Benech N, Zambrana AI,etal. Diabetes increases stiffness of live cardiomyocytes measured by atomic force microscopy nanoindentation[J]. Am J Physiol Cell Physiol, 2014, 307(10): C910-919. DOI: 10.1152/ajpcell.00192.2013.

[14] Akhtar R, Cruickshank JK, Zhao X,etal. Localized micro- and nano-scale remodelling in the diabetic aorta[J]. Acta Biomater, 2014, 10(11): 4843-4851. DOI: 10.1016/j.actbio.2014.07.001.

[15] Siamantouras E, Hills CE, Squires PE,etal. Quantifying cellular mechanics and adhesion in renal tubular injury using single cell force spectroscopy[J]. Nanomedicine, 2016, 12(4): 1013-1021. DOI: 10.1016/j.nano.2015.12.362.

[16] Hills CE, Siamantouras E, Smith SW,etal. TGFβ modulates cell-to-cell communication in early epithelial-to-mesenchymal transition[J]. Diabetologia, 2012, 55(3): 812-824. DOI: 10.1007/s00125-011-2409-9.

[17] Lu CH, Lin ST, Chou HC,etal. Proteomic analysis of retinopathy-related plasma biomarkers in diabetic patients[J]. Arch Biochem Biophys, 2013, 529(2): 146-156. DOI: 10.1016/j.abb.2012.11.004.

[18] To M, Goz A, Camenzind L,etal. Diabetes-induced morpholo-gical, biomechanical, and compositional changes in ocular basement membranes[J]. Exp Eye Res, 2013, 116: 298-307. DOI: 10.1016/j.exer.2013.09.011.

[19] Chronopoulos A, Tang A, Beglova E,etal. High glucose increases lysyl oxidase expression and activity in retinal endothelial cells: mechanism for compromised extracellular matrix barrier function[J]. Diabetes, 2010, 59(12): 3159-3166. DOI: 10.2337/db10-0365.

[20] Yang X, Scott HA, Monickaraj F,etal. Basement membrane stiffening promotes retinal endothelial activation associated with diabetes[J]. FASEB J, 2016, 30(2): 601-611. DOI: 10.1096/fj.15-277962.

[21] Pasnoor M, Dimachkie MM, Kluding P,etal. Diabetic neuropathy part 1: overview and symmetric phenotypes[J]. Neurol Clin, 2013, 31(2): 425-445. DOI: 10.1016/j.ncl.2013.02.004.

[22] Wang H, Layton BE, Sastry AM. Nerve collagens from diabetic and nondiabetic Sprague-Dawley and biobreeding rats: an atomic force microscopy study[J]. Diabetes Metab Res Rev, 2003, 19(4): 288-298. DOI:10.1002/dmrr.372.

[23] Makrantonaki E, Jiang D, Hossini AM,etal. Diabetes mellitus and the skin[J]. Rev Endocr Metab Disord, 2016, 17(3): 269-282. DOI:10.1007/s11154-016-9373-0.

[24] Argyropoulos AJ, Robichaud P, Balimunkwe RM,etal. Alterations of dermal connective tissue collagen in diabetes: molecular basis of aged-appearing skin[J]. PLoS One, 2016, 11(4): e0153806. DOI: 10.1371/journal.pone.0153806.

[25] Shemer A, Bergman R, Linn S,etal. Diabetic dermopathy and internal complications in diabetes mellitus[J]. Int J Dermatol, 1998, 37(2): 113-115.

[26] Napoli N, Chandran M, Pierroz DD,etal. Mechanisms of diabetes mellitus-induced bone fragility[J]. Nat Rev Endocrinol, 2017, 13(4): 208-219. DOI: 10.1038/nrendo.2016.153.

[27] Hammond MA, Gallant MA, Burr DB,etal. Nanoscale changes in collagen are reflected in physical and mechanical properties of bone at the microscale in diabetic rats[J]. Bone, 2014, 60: 26-32. DOI: 10.1016/j.bone.2013.11.015.