周玉龍，吳丹丹，周金玲，樸范澤

（黑龍江八一農墾大學動物科技學院，預防獸醫(yī)重點實驗室，大慶 163319）

牛呼吸道綜合癥多重PCR檢測方法的建立

周玉龍，吳丹丹，周金玲，樸范澤

（黑龍江八一農墾大學動物科技學院，預防獸醫(yī)重點實驗室，大慶 163319）

為了建立針對BRDC常見的主要病原牛黏膜病病毒（BVDV）、牛副流感病毒3型（BPIV-3）和牛呼吸道合胞體病毒（BRSV）的一步法多重RTPCR，引入了新型的具有反轉錄酶和DNA聚合酶活性的rTth DNA聚合酶，通過對退火溫度和引物濃度的優(yōu)化，敏感性和特異性的檢測，最終確定最佳退火溫度為54.5℃，最佳引物濃度為0.6 uM。對BPIV-3、BRSV和BVDV的最小檢測量分別為162、16和21個TCID50/0.1 mL。與牛傳染性鼻氣管炎病毒、冠狀病毒、腺病毒，以及多殺性巴氏桿菌、肺炎鏈球菌、化膿隱秘桿菌、溶血性曼氏桿菌等沒有交叉反應。建立起的mRT-PCR檢測方法可用于鼻腔分泌物的檢測，為進一步mRT-PCR試劑盒的組裝奠定了基礎。

牛呼吸道綜合癥；病毒；mRT-PCR

牛呼吸道綜合癥（bovine respiratory disease complex，BRDC）是多因素的，環(huán)境條件與多種病毒和細菌性病原的共同作用使牛產生嚴重的呼吸道疾病。應激因素像溫度、飼養(yǎng)密度、灰塵、濕度和長途運輸等[1-2]，能夠導致機體免疫力下降，繼而感染機會性病毒或者細菌性病原。國內外研究表明牛黏膜病病毒（bovine viral diarrhea virus，BVDV）、牛副流感病毒3型（bovine parainfluenza virus-3，BPIV3）和牛呼吸道合胞體病毒（bovine respiratory syncytial virus，BRSV）是與BRDC相關的常見病原，這些病毒常常作為BRDC的原發(fā)性病原。一般認為這些病毒能導致牛免疫系統抑制和破壞呼吸道上皮，使常見的機會性的二級病原更容易感染，像溶血性曼氏桿菌、多殺性巴氏桿菌、昏睡嗜血桿菌、化膿隱秘桿菌和牛支原體等，從而導致臨床上呈現BRDC[3-4]。

BRDC在世界范圍內普遍存在，據報道因牛呼吸道疾病造成死亡的病例占到46%～67%。同時，因感染疾病造成的牛生長發(fā)育遲緩和產奶量下降等間接損失更是不可估計[5]。多年來在臨床診療工作中發(fā)現，在黑龍江省BRDC有上升的趨勢，尤其是發(fā)生BPIV3、BRSV和BVDV單獨或混合感染時，患病牛病程可達30 d左右，臨床獸醫(yī)由于無法確診，盲目長期應用抗生素類藥，但是效果不顯著，導致治療成本增加，僅治療費用最高達200元·頭-1，因此急需有效的檢測手段進行確診。

傳統的單重或者多重PCR方法需要經反轉錄和PCR兩個過程操作復雜耗時，同時增加了檢測過程中污染的幾率，為了克服上述困難，研究引入了具有RNA反轉錄酶活性和DNA聚合酶活性的新型耐熱性DNA多聚酶開發(fā)一種敏感性高、特異性強、使用方便快捷的一步法BVDV、BRSV和BPIV3三重反轉錄PCR試劑盒，增加了該方法的臨床可應用性。以便能夠及時確診采取有效的防控措施，最大程度上減少經濟損失，保障養(yǎng)牛業(yè)的順利發(fā)展。

1 材料

1.1 菌毒株及細胞株

BRSV NMK-7株、BPIV-3 BN-1株和牛腺病毒7型（BAdV-7 Fukuroi株）由日本動物衛(wèi)生研究所惠贈；牛呼吸道合胞體病毒HJ株、BPIV3 HJ株，BVDV HJ-1株GenBank登錄號JX065783、牛傳染性鼻氣管炎病毒DQ株和牛冠狀病毒DQ、化膿隱秘桿菌、牛多殺性巴氏桿菌、牛溶血性曼氏桿菌和牛肺炎鏈球菌等由黑龍江八一農墾大學傳染病研究室分離鑒定保存[6-9]。MDBK細胞、非洲綠猴腎細胞（Vero）和HRT-18細胞購自中國科學院上海細胞庫，由黑龍江八一農墾大學傳染病研究室保存。

1.2 主要試劑

RNA提取試劑盒（Qiagen）、DNA提取試劑盒（TIANGEN）、一步法RT-PCR試劑盒（TOYOBO），胰大豆蛋白肉湯培養(yǎng)基TSB（BD）、血液營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基按常規(guī)方法配制。

1.3 臨床樣本

采集自2012年5月～2015年7月黑龍江省大慶市、哈爾濱市和齊齊哈爾市的周邊地區(qū)。具有呼吸道癥狀的肉牛和奶牛鼻腔拭子，總計35份。

1.4 引物的設計與合成

根據GenBank上發(fā)表的BRSV和BPIV3的N基因序列，以及BVDV 5′UTR基因序列，經DNAStar軟件比對分析，利用Oligo6.0在保守區(qū)設計特異性引物各2對，由上海生工生物工程技術服務有限公司合成，引物序列見表1。

表1 引物序列Table 1 Primer sequence

2 方法

2.1 試驗用病毒液制備

BRSV HJ株、BPIV3 HJ株、BVDV HJ-1、牛冠狀病毒DQ和IBRV DQ株等試驗用病毒株按照常規(guī)方法接種敏感細胞以后，待60%～70%的細胞出現CPE以后收集細胞，反復動融3次后分成3等份-80℃儲存?zhèn)溆谩?/p>

2.2 試驗用細菌液的制備

將化膿隱秘桿菌、牛多殺性巴氏桿菌、牛溶血性曼氏桿菌和牛肺炎鏈球菌分別接種加入5%新生牛血清的TSB培養(yǎng)基，37℃搖床培養(yǎng)12 h，收集菌體；IBRV接種MDBK細胞，60%～70%的細胞出現CPE時收集細胞，按照TIANamp Genomic DNA Kit說明書步驟制備上述細菌和病毒的基因組，-80℃儲存?zhèn)溆谩?/p>

2.3 基因組RNA和DNA的制備

使用Rneasy plus Mini kit制備BRSV、BPIV3、BVDV和BCV等試驗用病毒核酸，以及制備臨床樣本核酸，具體方法按照說明書操作。

使用TIANamp Genomic DNA Kit制備化膿隱秘桿菌、牛多殺性巴氏桿菌、牛溶血性曼氏桿菌、牛肺炎鏈球菌和IBRV等試驗用細菌和病毒的核酸，具體方法按照說明書操作。

2.4 單一病毒一步法RT-PCR反應條件的優(yōu)化

先對BVDV、BPIV3和BRSV三種病毒分別進行一步法RT-PCR反應條件優(yōu)化，包括退火溫度（54.5、56.2、57.3、58.8、60.1、61.4℃和62.8℃），引物濃度（終濃度0.1、0.2、0.4、0.6、0.8和1.0 μM），然后根據最佳的退火溫度和引物濃度進行PCR反應體系組合，檢測BVDV、BPIV3和BRSV的復合樣本，確定最佳復合引物條件。優(yōu)化時先固定其他因素，逐個分析變量，最終篩選出最佳條件。反應液組成見表2。

表2 一步法RT-PCR反應液組成Table 2 Composition of one-step RT-PCR reaction liquid

一步法RT-PCR反應條件：變性90℃30 s；反轉錄60℃30 min；變性94℃1 min；預變性94℃30 s、退火54.5～62.8℃30 s、延伸72℃1 min，反應進行40個循環(huán)；延伸72℃7 min。取10 uL PCR擴增產物于15 g·L-1瓊脂糖凝膠中進行電泳鑒定。

2.5 敏感性實驗

分別把BRSV HJ株（104.0TCID50/0.1 mL）、BPIV3 HJ株（107.1TCID50/0.1 mL）和BVDV HJ-1株（105.3TCID50/0.1 mL）的細胞培養(yǎng)物原液進行1∶5、1∶52、1∶53、1∶54、1∶55、1∶56和1∶57倍連續(xù)稀釋，每一個稀釋度進行3個重復，使用多重PCR反應擴增。另外，把BRSV HJ株、BPIV3 HJ株和BVDV HJ-1株的細胞培養(yǎng)物混合，起始濃度均配成1×105TCID50/0.1 mL，同樣進行10倍系列稀釋，檢測多重PCR的敏感性。比較單病原與多病原之間是否有干擾抑制現象。

2.6 特異性實驗

使用常見的牛呼吸道病原體IBRV、BCV、化膿隱秘桿菌、牛多殺性巴氏桿菌、牛溶血性曼氏桿菌和牛肺炎鏈球菌等基因組為模板，利用上述最優(yōu)的PCR條件進行擴增，用來評價該方法的特異性。

2.7 臨床樣本檢測

把采集的65份臨床樣本用本研究中的一步法三重RT-PCR方法檢測，同時使用已發(fā)表的兩步法單重PCR方法進行檢測[10-12]。評價這兩種方法的符合率，以及這三種病原在目前呼吸道病牛中的流行病學情況。

3 實驗結果

3.1 最佳退火溫度優(yōu)化

為了確定最佳退火溫度，首先將引物濃度確定為常規(guī)濃度0.4 μM，分別對BVDV、BPIV3和BRSV的退火溫度進行優(yōu)化，結果見圖1?？梢姴煌嘶饻囟葘PIV3的擴增效率影響不大，對BRSV擴增效率僅在62.8℃時明顯下降，對BVDV的基因擴增效率影響較大，退火溫度在54.5℃和56.2℃時擴增效率相對較高，因此綜合考慮選擇54.5℃為最佳退火溫度。

3.2 最佳引物濃度優(yōu)化

把BPIV3、BRSV和BVDV的引物分別配制成濃度10 μM的混合液，使每個體系終濃度分別為0.05、0.1、0.2、0.4、0.6和0.8 μM，在最佳退火溫度為54.5℃條件下進行PCR擴增，結果見圖2。綜合BPIV3、BRSV和BVDV的擴增效率可見0.6 μM是最佳引物濃度。

圖1 一步法RT-PCR最佳退火溫度優(yōu)化結果Fig.1 Results of one-step RT-PCR optimum annealing temperature optimization

圖2 一步法RT-PCR最佳引物濃度優(yōu)化結果Fig.2 Results of one-step RT-PCR best primer concentration optimization

3.3 特異性實驗結果

為了評價引物的特異性我們選擇了牛常見呼吸道病毒IBRV、BCV和BADV，以及常見細菌多殺性巴氏桿菌、曼氏桿菌、化膿隱秘桿菌、肺炎鏈球菌、葡萄球菌和大腸桿菌，以及BPIV3 775株、AD、HJ株和BN-1株，BRSV NMK-7株和HJ株，BVDVHJ-1株和HJ-2株。特異性實驗結果見圖3?？梢妼嶒灲⒌姆椒軌蛴行U增出4個株BPIV3，2株BRSV和2株BVDV，而與IBRV、BCV、BADV、多殺性巴氏桿菌、曼氏桿菌、化膿隱秘桿菌、肺炎鏈球菌、葡萄球菌和大腸桿菌無交叉反應。

圖3 一步法RT-PCR特異性實驗結果Fig.3 Results of one-step RT-PCR specific experimental

3.4 敏感性實驗結果

通過對BRSV HJ株、BPIV3 HJ株和BVDV HJ-1株的細胞培養(yǎng)物原液進行1∶5系列稀釋后進行三重RT-PCR擴增，結果見圖4。結果本方法BPIV3、BRSV和BVDV的最小檢測量分別為162、16和21個TCID50/0.1mL。

3.5 臨床樣本檢測結果

采集自2012年5月～2015年7月黑龍江省大慶市、哈爾濱市和齊齊哈爾市的周邊地區(qū)。具有呼吸道癥狀的肉牛和奶牛鼻腔拭子，總計35份，檢測結果見表3。

圖4 一步法RT-PCR敏感性實驗結果Fig.4 Results of one-step RT-PCR sensitivity experiment

表3 臨床樣本檢測結果Table 3 Results of clinical samples test

4 討論

BRDC是舍飼牛最重要的疾病[1]。mRT-PCR是針對BRDC的一種快速和有效的診斷方法，可以用于檢測和區(qū)分BPI3、BRSV和BVDV?？捎糜谡{查BRDC爆發(fā)的病原因素和流行病學研究。對于推薦適當的處理和管理策略，減少相關疾病的發(fā)病率和死亡率，進而對提高了生產效益具有重要意義。

mRT-PCR與傳統的單重特異性RT-PCR相比，在多病原檢測方面有諸多優(yōu)點，包括高敏感性和特異性、低成本、所需樣本更少、檢測快速、若有自動化實驗條件適合于高通量檢測。BRDC臨床樣本通常發(fā)生共感染[13-14]，因此，確保非優(yōu)勢靶病毒能被檢測到很重要。

盡管實驗是使用單個混合樣本建立和優(yōu)化的，但是為了能夠保證mRT-PCR能夠檢測到BRDC中共同感染的病原，對含有多個靶病毒的混合物的敏感性進行了檢測，結果與檢測單個混合樣本時的敏感性沒有變化。而且通過對臨床樣本的檢測結果也表明一步法mRT-PCR與傳統的兩步法RT-PCR檢測敏感性差異不大見表3。同樣在檢測BRDC熒光定量mRT-PCR方法中檢測共感染樣本和檢測單個病原樣本的效率是一致的[15]。實驗中最好使用經過濾處理配制的RNase-free水，DEPC處理過的水DEPC殘留會抑制PCR反應的進行。RNA樣品的添加量也不益過高2.5 μg以下，過多的添加量是反應效率下降。診斷方法的不斷改進使得流行病學研究更容易，便于更好的理解這些病毒在疾病過程中的作用。另外，診斷方法的敏感性越高也便于調查健康牛對于這些病院的攜帶率[16]。

總之，mRT-PCR方法是一種敏感和特異的檢測技術，能夠檢測牛的三種主要病毒性病原體，而且可以同時檢測者三種病原。雖然mRT-PCR實驗一般認為成本較高，但是考慮到在短時間之內能夠檢測到多種病原，減少了勞動時間，效率更高，能產生不同的診斷信息。另外，養(yǎng)殖場也會獲益，由于快速診斷的結果能夠指導其有針對性地處理措施，使用合適的疫苗或者快速改進管理程序等措施的實施。

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Establishment of Multiple PCR Detection Method of Bovine Respiratory Disease Complex

Zhou Yulong，Wu Dandan，Zhou Jinling，Piao Fanze
（Preventive Veterinary key Laboratory，College of Animal Science and Veterinary Medicine，Heilongjiang Bayi Agriculture University，Daqing 163319）

Bovine respiratory syncytial virus，bovine viral diarrhoea virus and bovine parainfluenza virus 3 were three of the major viruses associated with BRDC.In this study，one-step multiple RT-PCR（mRT-PCR）was established for detecting these three pathogens.The rTth DNA polymerase，a new type of reverse transcriptase with the activity of DNA polymerase，was used in the study. Through the optimization of annealing temperature and concentration of primers，sensitivity and specificity of detection，finally the optimum annealing temperature was 54.5℃，the best primer concentration was 0.6 uM.The BPIV-3，BRSV and BVDV were minimum detectable quantity 162，16，and 21 respectively TCID50/0.1 mL.Without crossing reaction to infectious bovine rhinotracheitis virus，coronavirus，adenovirus，andpasteurellamultocida，streptococcuspneumoniae，arcanobacteriumpyogenes，Mannheimia haemolytica，etc.For clinical validation，the established mRT-PCR could be used to the detection of nasal secretions in clinical samples from cattle.The study laid further a solid foundation for the mRT-PCR kit assembly.

bovine respiratory disease complex;virus;mRT-PCR

S855.3

A

1002-2090（2016）06-0097-05

10.3969/j.issn.1002-2090.2016.06.020

2015-07-20

黑龍江省教育廳項目（12531471）。

周玉龍（1980-），男，副教授，黑龍江八一農墾大學畢業(yè)，現主要從事家畜傳染病診斷與防治方面的研究工作。