王華欣，劉宇，趙靜虎，劉通，周金玲，岳山，何泊寧，劉珊珊，張世勛，王天，劉增祿，朱戰(zhàn)波

（黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)動物科技學(xué)院，大慶 163319）

牛產(chǎn)氣莢膜梭菌黑龍江分離株的分型鑒定

王華欣，劉宇，趙靜虎，劉通，周金玲，岳山，何泊寧，劉珊珊，張世勛，王天，劉增祿，朱戰(zhàn)波

（黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)動物科技學(xué)院，大慶 163319）

為了對三株未知型牛源產(chǎn)氣莢膜梭菌（Clostridium Perfringens，Cl.perfringens）進行基因分型鑒定，將三株未知型菌株進行厭氧培養(yǎng)、純化，觀察培養(yǎng)特性，進行革蘭氏染色鏡檢以及生化管鑒定，根據(jù)產(chǎn)氣莢膜梭菌α、β、ε和ι毒素基因以及產(chǎn)氣莢膜梭菌16S rRNA保守基因分別合成5對引物，建立PCR方法。經(jīng)培養(yǎng)特性、革蘭氏染色鏡檢、生化特性以及16S rRNA保守基因細菌PCR鑒定均符合產(chǎn)氣莢膜梭菌，PCR結(jié)果表明，三株產(chǎn)氣莢膜梭菌均為A型。

產(chǎn)氣莢膜梭菌；16S rRNA；PCR；基因分型

產(chǎn)氣莢膜梭菌是人和動物胃腸道中的常在菌，也普遍存在于土壤和污水中[1-3]。該菌可引起各種家畜以及人類多種疾病的發(fā)生，主要有創(chuàng)傷性感染、惡性水腫，還會引起豬、馬還有反芻動物等的腸毒血癥，羔羊痢疾，綿羊猝狙；反芻動物感染還有可能引發(fā)猝死癥，尤其是牛猝死癥比較常見；對于犬、貓和人還會引起腹瀉等癥狀[4]。產(chǎn)氣莢膜梭菌所產(chǎn)生的毒素種類較多，有研究報道僅外毒素就多達18種[5-6]。產(chǎn)氣莢膜梭菌根據(jù)其產(chǎn)生四種主要致死性毒素（α、β、ε和ι）的能力不同而被分為A、B、C、D、E五種類型[7]，各型的產(chǎn)氣莢膜梭菌均能引起牛發(fā)病，其中尤以A、C、D型菌感染居多。其中，A型菌是人食物中毒和人畜氣性壞疽的最常見病原。

國外報道的由產(chǎn)氣莢膜梭菌引起的牛病主要以C、D型菌導(dǎo)致的牛壞死性腸炎或腸原性毒血癥較多；國內(nèi)由A型產(chǎn)氣莢膜梭菌引起的成年?！扳腊Y”為主[8]，也有C、D型菌致病，B型菌主要引起犢牛腸毒血癥或壞死性腸炎，E型菌也可致犢牛腸毒血癥，但很少發(fā)生。20世紀90年代以來，規(guī)模化養(yǎng)殖得到普及，該菌引起的疾病傳播也日趨嚴重，牛的發(fā)病數(shù)量急劇增多，發(fā)病地區(qū)也不斷擴大[9]。目前，由該菌引起的疾病已廣泛分布于全國各地，對我國畜牧行業(yè)的發(fā)展形成了很大的困擾和嚴重的阻礙[10]。

1 材料

1.1 菌株

菌種為實驗從猝死牛腸道分離鑒定獲得的致病菌株。

1.2 主要試劑

厭氧肉肝湯（FT）培養(yǎng)基（購自青島高科園海博生物技術(shù)有限公司），Taq DNA聚合酶、DNA Maker購自TaKaRa公司，質(zhì)粒DNA提取試劑盒購自axygen科技有限公司。

2 方法

2.1 引物設(shè)計

根據(jù)產(chǎn)氣莢膜梭菌的四種主要毒素（αβει）基因的序列，參照Yoo（1997），Marchesi（1998）等[11-12]文獻合成PCR引物?；蜷L度分別為402、236、541、317和1 387 bp。引物序列分如下：

cpa-F cpa-R cpb-F cpb-R etx-F etx-R itx-F itx-R 63f 1 387r 5′-GTTGATAGCGCAGGACATGTTAAG-3′5′-CATGTAGTCATCTGTTCCAGCATC-3′5′-ACTATACAGACAGATCATTCAACC-3′5′-TTAGGAGCAGTTAGAACTACAGAC-3′5′-ACTGCAACTACTACTCATACTGTG-3′5′-CTGGTGCCTTAATAGAAAGACTCC-3′5′-GCGATGAAAAGCCTACACCACTAC-3′5′-GGTATATCCTCCACGCATATAGTC-3′5′-CAGGCCTAACACATGCAAGTC-3′5′-GGGCGGWGTGTACAAGGC-3′

2.2 產(chǎn)氣莢膜梭菌的培養(yǎng)

取超低溫冰箱保存的S-1401、HXL-1501、BQL-1303三種牛源性產(chǎn)氣莢模梭菌凍干保存的菌種，接種于液體FT培養(yǎng)基中，上部加入1 mL液體石蠟以隔絕氧氣，放置于37℃恒溫培養(yǎng)箱中，培養(yǎng)12 h后，觀察細菌的生長情況。

2.3 產(chǎn)氣莢膜梭菌的純化與鏡檢

將培養(yǎng)好的菌液進行血瓊脂板純化，于顯微鏡下觀察其運動性，并進行革蘭氏染色。

2.4 產(chǎn)氣莢膜梭菌的生化特性鑒定

生化鑒定主要包括葡萄糖、麥芽糖、乳糖、蔗糖、果糖、靛基質(zhì)、甘露醇、水楊苷、硝酸鹽、水解明膠、硫化氫生化管11項生化指標鑒定試驗。將鑒定管置37℃恒溫箱中培養(yǎng)，培養(yǎng)24 h觀察結(jié)果。

2.5 質(zhì)粒DNA的提取

細菌培養(yǎng)液體培養(yǎng)物經(jīng)離心后取其沉淀，后續(xù)按質(zhì)粒DNA提取試劑盒進行。

2.6 四種主要毒素（αβει）基因的擴增

擴增體系：DNA聚合酶12.5 μL，滅菌水，10.5 μL，質(zhì)粒DNA1 μL，上下游引物各0.5 μL。擴增條件：94℃變性1 min，55℃退火1 min，72℃延伸1 min（30個循環(huán)）；72℃延伸5 min。

3 結(jié)果

3.1 產(chǎn)氣莢膜梭菌的復(fù)蘇培養(yǎng)

三株產(chǎn)氣莢膜梭菌在FT培養(yǎng)基中培養(yǎng)12 h后即變渾濁，同時可見有大量的氣泡產(chǎn)生。

3.2 產(chǎn)氣莢膜梭菌的純化

產(chǎn)氣莢膜梭菌在牛血瓊脂平板上厭氧培養(yǎng)12 h后，均形成邊緣光滑整齊、灰黃色的圓形菌落，且在菌落周圍可見明顯雙環(huán)溶血現(xiàn)象，內(nèi)環(huán)為完全溶血，外圍為不完全溶血環(huán)。

3.3 產(chǎn)氣莢膜梭菌的生理生化鑒定結(jié)果

顯微鏡下官產(chǎn)產(chǎn)氣莢膜梭菌無鞭毛、沒有運動性。革蘭氏染色為陽性菌，菌體呈直桿狀，兩端鈍圓，單獨或成對存在。生化鑒定除靛基、甘露醇、水解明膠外均為陽性結(jié)果，符合產(chǎn)氣莢膜梭菌生化特性。

3.4 PCR鑒定結(jié)果

三株產(chǎn)氣莢膜梭菌分離株經(jīng)16S rRNA病原菌PCR擴增，1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，結(jié)果表明在1 387 bp的16S rRNA被有效擴增（圖1），大小正確。血清型PCR和測序結(jié)果結(jié)果均表明三株產(chǎn)氣莢膜梭菌分離株均為A型，對應(yīng)條帶大小為別為402 bp。

圖1 牛產(chǎn)氣莢膜梭菌分離株16S rRNA病原菌檢測Fig.1 Cattle clostridium perfringens 16S rRNA pathogen detection

圖2 牛產(chǎn)氣莢膜梭菌分離株α毒素基因檢測結(jié)果Fig.2 Identification of serotype of clostridium perfringens isolates

4 討論

近年來有很多關(guān)于A型產(chǎn)氣莢膜梭菌引起畜禽感染的報道，通常認為一些動物的壞死性腸炎、下痢與A型菌株的感染有關(guān)，“牛猝死癥”的研究發(fā)現(xiàn)A型產(chǎn)氣莢膜梭菌是其中的主要病原之一。有研究人員曾用ELISA分型以及多重PCR分型方法對牛舍空氣中分離出的產(chǎn)氣莢膜梭菌進行研究，研究表明，A型菌的比例高達88%[13]。本病在黑龍江省內(nèi)牛感染A型B型D型產(chǎn)氣莢膜梭菌均有報道[14-15]。另外，黑龍江省內(nèi)仔豬感染C型產(chǎn)氣莢膜梭菌引起梭菌性腸炎，致死率較高。綿羊感染C型產(chǎn)氣莢膜梭菌猝擊也有報道。

實驗所用三株毒株來自于黑龍江省不同地區(qū)猝死的肉牛，對其進行培養(yǎng)特性觀察，革蘭氏染色鏡檢、生化管鑒定以及16S rRNA病原菌檢測，各項檢測結(jié)果均與產(chǎn)氣莢膜梭菌的特性相符。在產(chǎn)氣莢膜梭菌基因組中，α、β、ε和ι四種毒素基因比較保守，且在產(chǎn)氣莢膜梭菌不同血清型菌株中存在差異。研究根據(jù)genbank中登載的產(chǎn)氣莢膜梭菌毒素基因序列，并參考有關(guān)文獻設(shè)計合成特異性引物，PCR鑒定結(jié)果未發(fā)現(xiàn)B、C、D、E型的目的條帶，16S rRNA測序結(jié)果顯示與A型產(chǎn)氣莢膜梭菌具有很高的同源性。三株牛源產(chǎn)氣莢膜梭菌分離株均為A型，與國內(nèi)的一些牛產(chǎn)氣莢膜梭菌流行病學(xué)調(diào)查結(jié)果相符，國內(nèi)由產(chǎn)氣莢膜梭菌引起的牛病以A型為主[10-15]。

［1］Lebrun M，Mainil J G，Linden A.Cattle enterotoxaemia and Clostridium perfringens：description，diagnosis and prophylaxis［J］.Veterinary Record：Journal of the British Veterinary Association，2010，167（1）：13-22.

［2］Matches J R，Liston J，Curran D.Clostridium perfringens in the environment［J］.Applied Microbiology，1974，28（4）：655-660.

［3］Manteca C，Daube G，Pirson V，et al.Bacterial intestinal flora associated with enterotoxaemia in Belgian Blue calves［J］.Veterinary Microbiology，2001，81（1）：21-32.

［4］Ochi S，Oda M，Matsuda H，et al.Clostridium perfringens α-toxin activates the sphingomyelin metabolism system in sheep erythrocytes［J］.Journal of Biological Chemistry，2004，279（13）：12181-12189.

［5］Songer J G.Clostridial enteric diseases of domestic animals.［J］.ClinicalMicrobiologyReviews，1996，9（9）：216-234.

［6］Keyburn A L，Boyce J D，Vaz P，et al.NetB，a new toxin that is associated with avian necrotic enteritis caused by Clostridium perfringens［J］.Plos Pathogens，2008，4（2）：2033-2037.

［7］Uzal F A，Vidal J E，Mcclane B A，et al.Clostridium Perfringens Toxins Involved in Mammalian Veterinary Diseases.［J］.Open Toxinology Journal，2011（2）：24-42.

［8］施遠翔.喀什地區(qū)疏附縣牛猝死癥病原分離與鑒定［D］.新疆：新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)，2006.

［9］侯安祖，盧中華.家畜魏氏梭菌病的診斷和防制［J］.中國獸醫(yī)雜志，1998（10）：12-13.

［10］張紅英.分泌抗A型魏氏梭菌腸毒素單克隆抗體雜交瘤細胞株的建立和初步應(yīng)用［D］.鄭州：河南農(nóng)業(yè)大學(xué)，2004.

［11］蘭道亮，王永，張誠民，等.藏綿羊腸道乳酸菌的分離鑒定及系統(tǒng)進化分析［J］.西南民族大學(xué)學(xué)報：自然科學(xué)版，2014，40（4）：481-484.

［12］Marchesi J R，Sato T，Weightman A J，et al.Design and evaluation of useful bacterium-specific PCR primers that amplify genes coding for bacterial 16S rRNA［J］.Applied &Environmental Microbiology，1998，64（2）：795-799.

［13］曹宏偉，李冬野，劉哲，等.金黃色葡萄球菌wood46株eno基因的克隆及原核表達［J］.黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)學(xué)報，2014，26（4）：46-49.

［14］邵紅，王鐵林，王久星，等.牛腸毒素性產(chǎn)氣莢膜梭菌的分離及鑒定［J］.黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)學(xué)報，2005，17（3）：66-69.

［15］倪宏波，石星明，樸范澤，等.牛產(chǎn)氣莢膜梭菌腸毒血癥的診斷［J］.中國獸醫(yī)雜志，2006，42（6）：53-54.

Typing Identification of Cattle Clostridium Perfringens Isolate in Heilongjiang Province

Wang Huaxin，Liu Yu，Zhao Jinghu，Liu Tong，Zhou Jinling，Yue Shan，He Boning，Liu Shanshan，Zhang Shixun，Wang Tian，Liu Zenglu，Zhu Zhanbo
（College of Animal Science and Technology，Heilongjiang Bayi Agricultural University，Daqing 163319）

Three cattle clostridium perfringens strains which types were unknown were anaerobic cultured，purified and observed culture characteristics，gram stain microscopy and biochemical tube identification were usedto identify their genotypings.PCR method was established based on the clostridium perfringens α，β，ε and ι toxin gene and clostridium perfringens 16SrRNA conserved genes，compounded five pairs primer.Results showed that culture characteristics，gram stain microscopy，biochemical properties，16S rRNA conservative germs PCR identification accorded with clostridium perfringens.The result of PCR indicated that all three clostridium perfringens strains were type A.

clostridium perfringens;16S rRNA;PCR;genotyping

S855.1+2

A

1002-2090（2016）06-0089-03

10.3969/j.issn.1002-2090.2016.06.018

2016-08-10

科技部科技支撐計劃課題（2014BAD13B03-1）；省農(nóng)墾總局課題（HNK135-04-03）。

王華欣（1991-），女，黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)動物科技學(xué)院2014級碩士研究生。

朱戰(zhàn)波，教授，博士研究生導(dǎo)師，E-mail：zhanbozhu@163.com。