郭亞楠， 王君， 李佳垚， 王秋萍， 劉欣竹

臨床研究

腹瀉病嬰幼兒艱難梭菌定植與感染情況分析

郭亞楠， 王君， 李佳垚， 王秋萍， 劉欣竹

目的 了解腹瀉病嬰幼兒艱難梭菌定植與感染情況并探討其檢測方法。方法 收集2014～2015年兒科消化門診腹瀉嬰幼兒的臨床資料及糞便，通過厭氧培養(yǎng)、毒素A和B PCR擴增法和酶聯(lián)免疫法檢測糞便中艱難梭菌和毒素。結(jié)果 65份標(biāo)本中，厭氧培養(yǎng)陽性19例(29.23%)，19例經(jīng)PCR擴增，A/B毒素陽性5例(7.69%)；酶聯(lián)免疫法檢測抗原陽性22例(33.85%)，與厭氧培養(yǎng)比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，毒素A/B陽性5例(7.69%)與PCR擴增法比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。結(jié)論 嬰幼兒有較高的艱難梭菌定植率，其中多為非產(chǎn)毒株，并不致??；酶聯(lián)免疫法檢測艱難梭菌抗原和毒素可以用于臨床篩檢。

腹瀉； 艱難梭菌； 嬰幼兒

艱難梭菌又稱難辨梭狀芽孢桿菌，是一種厭氧、革蘭染色陽性條件致病菌[1]。它分為產(chǎn)毒株和非產(chǎn)毒株，產(chǎn)毒株可產(chǎn)生A/B毒素，引起腸道炎癥；非產(chǎn)毒株在宿主體內(nèi)定植并不致病[2]。艱難梭菌感染是大量應(yīng)用抗生素后，腸道菌群紊亂，艱難梭菌過度繁殖并釋放毒素，引起的以腸道癥狀為主要表現(xiàn)的感染性疾病，是腸道菌群嚴(yán)重失調(diào)表現(xiàn)之一[3]。艱難梭菌定植是宿主體內(nèi)有艱難梭菌的存在，但并不致病[4]。

嬰幼兒處于腸道菌群的形成時期，缺少成人腸道中有益菌群；并且免疫系統(tǒng)未發(fā)育成熟，容易感染艱難梭菌。據(jù)報道嬰幼兒有較高的艱難梭菌定植率，約35%的兒童攜帶有艱難梭菌，1%～84%的新生兒和健康嬰幼兒體內(nèi)有艱難梭菌定植[5]。但是發(fā)現(xiàn)多數(shù)艱難梭菌陽性的嬰幼兒并無臨床癥狀，是否與嬰幼兒體內(nèi)艱難梭菌產(chǎn)毒情況有關(guān)呢？為了解腹瀉病嬰幼兒艱難梭菌定植與感染情況，筆者采用三種檢測方法對腹瀉嬰幼兒的艱難梭菌定植和產(chǎn)毒情況進行調(diào)查，同時對其檢測方法進行了探討，現(xiàn)將結(jié)果報道如下。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選擇2014年1月至2015年12月在中日友好醫(yī)院兒科消化門診的腹瀉患兒，通過詢問病史，查閱病歷資料收集患兒信息，并收集符合篩選標(biāo)準(zhǔn)患兒的糞便標(biāo)本-80 ℃保存。1.2 診斷標(biāo)準(zhǔn) 以大便性狀為稀便或水樣便，每日>3次為腹瀉診斷標(biāo)準(zhǔn)。

1.3 納入標(biāo)準(zhǔn) (1)符合腹瀉診斷標(biāo)準(zhǔn)；(2)年齡<3歲；(3)病程超過3 d；(4)腹瀉前1個月內(nèi)有抗生素應(yīng)用史。

1.4 排除標(biāo)準(zhǔn) (1)明確診斷為細(xì)菌性痢疾、偽膜性腸炎、克羅恩病及其他原因引起的膿血便病例；(2)腹瀉合并休克、重度脫水、劇烈嘔吐而不能進食和嚴(yán)重感染病例；(3)依從性差，難以完成治療者。

1.5 試劑與儀器 CCFA艱難梭菌選擇培養(yǎng)基；QIAamp糞便DNA提取試劑盒(德國Qiagen公司)；OneTaq?熱啟動2X Master Mix(美國 NEB公司)；艱難梭菌抗原/毒素聯(lián)合快速檢測試劑盒(美國 Techlab公司)；PCR擴增儀(美國GeneAmp公司)；低溫冰凍離心機(美國 Thermo公司)；電泳裝置(北京六一儀器)；超微量分光光度計(美國 Thermo公司)。

1.6 實驗方法

1.6.1 艱難梭菌培養(yǎng) 糞便標(biāo)本與無水乙醇以1∶1體積混合，震蕩，室溫靜置1 h。將處理好的糞便標(biāo)本接種于新鮮配制的由環(huán)絲氨酸、頭孢西丁、果糖和蛋白質(zhì)瓊脂組成的CCFA艱難梭菌選擇培養(yǎng)基上，置于厭氧袋中，35 ℃培養(yǎng)48 h。

1.6.2 艱難梭菌毒素A/B聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)檢測 對于艱難梭菌培養(yǎng)陽性的標(biāo)本，按照試劑盒操作說明提取糞便中細(xì)菌基因組的DNA，PCR檢測毒素A和毒素B的基因，引物見表1。PCR擴增條件分別為毒素A：起始模板變性94 ℃ 10 min，模板變性94 ℃ 50 s，退火54 ℃ 40 s，延伸72 ℃ 50 s共37個循環(huán)，終延伸72 ℃ 3 min。毒素B：起始模板變性94 ℃ 10 min，模板變性94.5 ℃ 30 s，退火55 ℃ 30 s，延伸72 ℃ 30 s共32個循環(huán)，終延伸72 ℃ 3 min。最后瓊脂糖凝膠電泳對PCR產(chǎn)物進行檢測。

表1 PCR擴增毒素A和毒素B基因所需引物序列

1.6.3 艱難梭菌抗原和毒素聯(lián)合快速檢測 按照艱難梭菌抗原/毒素聯(lián)合快速檢測試劑盒操作說明，對所收集的標(biāo)本進行艱難梭菌抗原和毒素檢測。

1.7 統(tǒng)計學(xué)方法 應(yīng)用SPSS 16.0統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)分析，計數(shù)資料采用χ2檢驗，診斷方法的一致性采用Kappa分析，Kappa值在0.4～0.75為中高度一致，>0.75為極好的一致性，P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 患兒艱難梭菌培養(yǎng) 共收集腹瀉嬰幼兒65例，其中艱難梭菌培養(yǎng)陽性19例(29.23%)、陰性46例(70.77%)，兩組一般資料比較見表2。

表2 腹瀉嬰幼兒艱難梭菌培養(yǎng)患兒的一般臨床資料[n(%)]

注：與艱難梭菌培養(yǎng)陰性組比較，aχ2=37.10，29.25,16.86，P<0.05。

表2結(jié)果表明，艱難梭菌培養(yǎng)陽性組的喂養(yǎng)方式、抗生素應(yīng)用時間及抗生素應(yīng)用種類與艱難梭菌培養(yǎng)陰性組比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。

2.2 艱難梭菌毒素A/B PCR檢測 檢測19例艱難梭菌培養(yǎng)陽性糞便中的毒素A和毒素B，其中毒素A陽性3例，毒素B陽性2例，毒素A/B的檢出率為26.32%。

2.3 患兒艱難梭菌抗原和毒素聯(lián)合快速檢測 見表3。

表3 檢測艱難梭菌方法

表3結(jié)果表明，快速試劑盒抗原的艱難梭菌檢出率與厭氧培養(yǎng)比較，Kappa值是0.571，一致性較好，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.706)；毒素PCR擴增檢測毒素A/B陽性率與快速試劑盒抗原/毒素檢測比較，Kappa值是1，有極好的一致性，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P=1)。

3 討論

艱難梭菌是一種產(chǎn)芽孢的格蘭陽性桿菌，是引起抗生素相關(guān)腹瀉的常見病原菌。由于廣譜抗生素在兒科的廣泛應(yīng)用，兒童艱難梭菌感染的發(fā)病率不斷增高，已成為醫(yī)院感染最重要的病原菌，引起了人們的廣泛關(guān)注[6]。本研究發(fā)現(xiàn)非母乳喂養(yǎng)患兒艱難梭菌檢出率明顯高于母乳喂養(yǎng)，與國內(nèi)外報道一致。母乳中含有豐富的分泌性IgA和其他抗體，可以和病原菌結(jié)合，防止感染；另外，母乳喂養(yǎng)的嬰兒腸道內(nèi)雙歧桿菌和乳酸桿菌等有益菌群含量豐富，這些益生菌可形成競爭阻力，抑制艱難梭菌[7]。長時間多種抗生素聯(lián)合應(yīng)用也是艱難梭菌感染的危險因素，大量應(yīng)用廣譜抗生素可以破壞腸道菌群平衡，腸道內(nèi)正常定植菌減少，艱難梭菌乘機大量繁殖。據(jù)報道兒童一個月內(nèi)使用3種以上抗生素發(fā)展為嚴(yán)重的艱難梭菌感染概率明顯增加[8]。

嬰幼兒有較高的艱難梭菌定植率，其中大多數(shù)為非產(chǎn)毒株，并不引起腸道炎癥。據(jù)報道嬰幼兒艱難梭菌定植率約為35%，剛出生的1周的新生兒就有艱難梭菌定植，0～1月、1～6月、6～12月和3歲以上的兒童艱難梭菌定植率分別為37%、30%的、14%和0～8%[6]。本研究中厭氧培養(yǎng)+毒素A/B PCR擴增艱難梭菌檢出率為29.2%，產(chǎn)毒株為7.69%；快速試劑盒檢測艱難梭菌檢出率為33.8%，產(chǎn)毒株為7.69%，同國內(nèi)外文獻報道一致?？梢妺胗變浩D難梭菌攜帶者以非產(chǎn)毒株為主，多數(shù)無臨床表現(xiàn)。目前對于兒童艱難梭菌定植率高的原因尚無定論，Jangi等[9]認(rèn)為嬰幼兒處于腸道菌群的形成時期，缺少成人腸道中擬桿菌和厚壁菌等有益菌群，這些菌群可形成“定植阻力”，抑制艱難梭菌的定植。Fallani等[10]發(fā)現(xiàn)母乳喂養(yǎng)與配方奶喂養(yǎng)的嬰兒相比較，其體內(nèi)雙歧桿菌等優(yōu)勢菌群占優(yōu)勢，類桿菌數(shù)量較少且艱難梭菌檢出率明顯較低。再次，小兒免疫系統(tǒng)未發(fā)育成熟，腸內(nèi)相應(yīng)受體缺乏，艱難梭菌毒素缺乏作用靶位，不能引起相應(yīng)的炎癥反應(yīng)，可能與艱難梭菌在兒童中高定植率有關(guān)[11]。

檢測艱難梭菌的方法主要包括厭氧培養(yǎng)、組織細(xì)胞培養(yǎng)、細(xì)胞毒素試驗、酶聯(lián)免疫法和PCR等。艱難梭菌的厭氧培養(yǎng)通常用環(huán)絲氨酸-頭孢西丁-果糖瓊脂選擇培養(yǎng)基，需要嚴(yán)格的厭氧環(huán)境，花費時間長，通常需要3～4 d才能得到結(jié)果[12]。PCR的法分別檢測A、B毒素，操作比較繁瑣，所需時間長[13]。艱難梭菌在繁殖過程中可產(chǎn)生谷氨酸脫氫酶(GDH)和毒素，用于ELISA法檢測糞便中GDH和毒素，簡單快速。本研究選用厭氧培養(yǎng)后PCR擴增及快速酶聯(lián)免疫熒光法試劑盒進行檢測，結(jié)果顯示兩種方法有較高的一致性。

綜上所述，嬰幼兒雖然有較高的艱難梭菌攜帶率，其中大多數(shù)為非產(chǎn)毒株，并不引起腸道炎癥。酶聯(lián)免疫法檢測GDH抗原和毒素，與厭氧培養(yǎng)+毒素PCR擴增法相比有較好的一致性，并且操作簡單可以作為艱難梭菌感染的篩選。

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(本文編輯：李志文)

The analysis of clostridium difficile colonization and infection in infants with diarrhea

GUO Yanan,WANG Jun,LI Jiayao，WANG Qiuping，LIU Xinzhu.

China-Japan Friendship Hospital, Beijing 100029，China

Objective To investigate clostridium difficile bacteria colonization and infection in infants with diarrhea and discuss the testing methods.Methods The cases and feces of infants with diarrhea were collected in pediatric digestive outpatient from 2014 to 2015.We detected clostridium difficile bacteria and toxins in the feces by anaerobic culture,toxin A and B PCR amplification method,and enzyme-linked immunosorbent assay.Results Of 65 specimens,19 cases(29.2%) were positive for anaerobic culture.The A/B toxin were positive in 5 cases(6.2%) in the 19 cases by PCR amplification.Antigen was positive in 22 cases(33.8%) by enzyme-linked immunoassay detection,and there was no statistically significant difference when compared with anaerobic culture.Toxin A/B was positive in 5 cases(6.2%), and there was no statistically significant difference when compared with PCR amplification method.Conclusion Infants have higher clostridium difficile colonization rate,and the majority does not produce toxins and does not cause diseases.Enzyme-linked immunoassay detection for clostridium difficile antigen and toxins can be used for clinical screening.

Diarrhea； Clostridium difficile； Infants

100029 北京，中日友好醫(yī)院兒科(郭亞楠，王君，王秋萍，劉欣竹)；100073 北京，北京協(xié)和醫(yī)院檢驗科(李佳垚)

郭亞楠(1989-)，男，碩士研究生。研究方向：中醫(yī)藥治療兒科疾病

王君，E-mail：junw20042003@qq.com

10.3969/j.issn.1674-3865.2016.06.019

R723.11

A

1674-3865(2016)06-0607-03

2016-06-23)