周小青，謝彥彤，梁宏潔，王可，李亞楠，孔晉亮

(1廣西醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院，南寧530021；2廣西醫(yī)科大學(xué))

銅綠假單胞菌臨床分離株基因型分析

周小青1，謝彥彤2，梁宏潔1，王可1，李亞楠1，孔晉亮1

(1廣西醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院，南寧530021；2廣西醫(yī)科大學(xué))

目的 分析某院各科室長期持續(xù)感染的銅綠假單胞菌(PA)分離株的基因型，探討PA的基因變異情況。方法 從某院各科室住院患者送檢的標(biāo)本中分離PA，對(duì)感染持續(xù)時(shí)間大于30天的菌株采用隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)性DNA(RAPD)基因分型技術(shù)獲得RAPD指紋圖譜，并進(jìn)行同源性聚類分析，通過相似性系數(shù)了解PA之間的親緣關(guān)系；對(duì)比PA的RAPD型別，判斷是否存在爆發(fā)流行及同一患者連續(xù)感染的PA基因是否發(fā)生變異。結(jié)果 共收集PA 293株，其中感染持續(xù)時(shí)間大于30天的菌株117株，擴(kuò)增出19種基因型條帶，分別為A～S型，分型率100%；基因型相似系數(shù)范圍為0.64～0.93，基因型A和G、基因型B和R、基因型D和E、基因型M和P的相似系數(shù)均為0.93，說明它們之間具有高度的同源性。重癥醫(yī)學(xué)科及燒傷整形外科各發(fā)生一起在不同患者之間檢出相同RAPD型別PA菌株的情況，其余患者RAPD型別各不相同。4例患者連續(xù)感染的PA指紋圖譜發(fā)生改變。結(jié)論 某院各科室長期持續(xù)感染的PA分離株存在多種基因型，提示PA在感染過程中可發(fā)生基因變異，存在基因多態(tài)性。

銅綠假單胞菌，基因型；隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)性DNA；基因分型技術(shù)

銅綠假單胞菌(PA)是廣泛存在于土壤、水和醫(yī)院環(huán)境中的條件致病菌，是導(dǎo)致醫(yī)院內(nèi)嚴(yán)重顱腦損傷、大面積燒傷、重癥肺炎、腫瘤、糖尿病等免疫力低下患者感染的主要病原菌，感染者主要表現(xiàn)為下呼吸道癥狀[1,2]。本研究采用隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)性DNA(RAPD)基因分型技術(shù)對(duì)PA基因分型進(jìn)行檢測，以了解PA感染狀況及其基因變異情況，為PA感染的分子流行病學(xué)分析及其治療提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料 菌株： 收集廣西醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院2013年12月～2014年4月臨床分離的PA，主要為各科室住院患者送檢的痰及肺泡灌洗液、創(chuàng)面分泌物、尿液、血液、腹腔引流液等標(biāo)本，按常規(guī)方法分離并培養(yǎng)，質(zhì)控菌株為PA ATCC27853，均經(jīng)法國梅里埃公司API細(xì)菌鑒定系統(tǒng)鑒定。將培養(yǎng)菌株保存在-80 ℃超低溫冰箱備用。選取感染PA持續(xù)時(shí)間大于30天的患者標(biāo)本中分離的117株菌株作為本次研究的實(shí)驗(yàn)菌株，其中深部晨痰和肺泡灌洗液81株(69.2%)、創(chuàng)面分泌物21株(17.9%)、深靜脈導(dǎo)管5株(4.3%)、尿液5株(4.3%)、血液4株(3.4%)、腹腔引流液1株(0.8%)。117株P(guān)A來自23例患者，其中男15例(65.2%)、女8例(34.8%)，年齡70 d～92歲[(54.9±23.8)歲]，住院時(shí)間均>30天；來自重癥醫(yī)學(xué)科10例(43.5%)，燒傷整形外科5例(21.7%)，中醫(yī)科5例(21.7%)；原發(fā)病為顱腦損傷10例(43.5%)，大面積燒傷5例(21.7%)，重癥肺炎4例(17.4%)，腫瘤2例(8.7%)，脊髓損傷并四肢癱1例(4.3%)，原發(fā)性腎病綜合征(腎炎型)1例(4.3%)；靜脈使用廣譜抗生素>2周20例(86.9%)、長期靜脈使用或口服糖皮質(zhì)激素[相當(dāng)于潑尼松0.5 mg /(kg·d)]3例(13.0%)，接受侵入性操作(包括氣管插管或切開、中心靜脈置管、深部吸痰、外科手術(shù))19 例(82.6%)、長期機(jī)械通氣15例(65.2%)；合并糖尿病6 例(26.1%)，低蛋白血癥(血清白蛋白<35 g/L)20例(86.9%)。主要試劑及儀器：隨機(jī)引物272(5′-AGCGGGCCAA-3′)[3,4]、Premix TaqTM(TaKaRa TaqTMVersion 2.0 plus dye)和DL 5000 DNA Marker均由Takara公司提供，GoldViewⅠ型核酸染色劑(Solarbio?公司)、DEPC水(Sangon公司)、50×TAE(Sangon公司)、西班牙瓊脂糖(BIOWEST)、LB瓊脂、LB肉湯。PCR儀(BIO-RAD S1000TMThermal Cycler)、全自動(dòng)凝膠成像系統(tǒng)(BIO-RAD，Gel Doc XR+)、普通型電泳電源(BIO-RAD，PowerPacTMUniversal)、超微量核酸濃度測定儀(美國Thermo Nanodrop ND-2000)。

1.2 基因分型及結(jié)果判斷 將PA菌株從-80 ℃超低溫冰箱內(nèi)取出，在LB瓊脂培養(yǎng)皿上分區(qū)劃線，于37 ℃孵育24 h，挑取單個(gè)菌落接種于2 mL LB肉湯，置于37 ℃恒溫?fù)u床上180 r/min培養(yǎng)16 h。采用煮沸法提取細(xì)菌基因組DNA，將1.5 mL菌液5 000 r/min離心5 min后去掉上清；在沉淀中加入無菌生理鹽水混勻，重復(fù)以上步驟2～3次；在沉淀中加入DEPC水混勻，沸水中煮沸10 min，14 000 r/min離心后取上清即為細(xì)菌DNA。采用超微量核酸濃度測定儀檢測DNA濃度及純度，將DNA濃度稀釋至100 ng/μL備用。每個(gè)菌株獨(dú)立提取3次DNA，實(shí)驗(yàn)獨(dú)立重復(fù)3次。以提取的DNA為模板進(jìn)行PCR反應(yīng)，反應(yīng)體系總體積為20 μL，其中Premix 10 μL、DNA模板2 μL、引物(10 μmol/L)4 μL、DEPC水4 μL。反應(yīng)條件： 98 ℃預(yù)變性2 min，98 ℃ 變性10 s，40 ℃退火5 min，72 ℃延伸5 min，2個(gè)循環(huán)；98 ℃ 變性10 s，40 ℃退火30 s，72 ℃延伸5 min，共40個(gè)循環(huán)；最后72 ℃充分延伸10 min。取PCR產(chǎn)物6 μL，置于含GoldViewⅠ型核酸染色劑的2%瓊脂糖凝膠上電泳(5 V/cm)25 min，電泳完畢用全自動(dòng)凝膠成像系統(tǒng)拍照。采用RAPD基因分型技術(shù)獲得受試菌株的RAPD指紋圖譜并進(jìn)行同源聚類分析。首先確定各反應(yīng)條帶在RAPD指紋圖譜上的相對(duì)位置，在同一分子量水平上，有條帶記作“1”，無條帶記作“0”。將所有菌株的反應(yīng)條帶均轉(zhuǎn)換為含有“0”和“1”組成的數(shù)據(jù)矩陣，利用NTedit軟件直接錄入數(shù)據(jù)，文件另存為*.NTS格式文件。將*.NTS文件導(dǎo)入NTSYS pc 2.10軟件計(jì)算相似系數(shù)，并用UPGMA法進(jìn)行同源性聚類分析。 根據(jù)各科室檢出PA的RAPD型別是否相同判斷是否存在PA爆發(fā)流行及同一患者連續(xù)感染的PA是否發(fā)生變異，通過相似性系數(shù)的聚類分析樹狀圖了解PA之間的親緣關(guān)系。如同一科室或不同科室來自不同患者的PA顯示相同的RAPD型別，判定為PA醫(yī)院感染局部爆發(fā)流行；如同一科室或不同科室來自不同患者的RAPD型別各不相同，判定為PA醫(yī)院散發(fā)感染。

2 結(jié)果

117株P(guān)A擴(kuò)增出A～S共19種基因型(圖1)，各基因型的條帶數(shù)目為2～9條，片段為300～3 000 bp，重復(fù)實(shí)驗(yàn)的分型結(jié)果基本一致。其中F型37株(31.6%)，為院內(nèi)主要流行型別；其次為H型29株(24.8%)，O型7株(6.0%)，C型和I型各6株(5.1%)，E型5株(4.3%)，其余型別為1～3株不等。重癥醫(yī)學(xué)科有8例患者感染相同RAPD型別PA菌株，燒傷整形外科有3例患者感染相同RAPD型別PA菌株，說明我院2013年12月～2014年4月期間發(fā)生二起PA爆發(fā)流行；除上述二起情況外，其余患者RAPD型別各不相同，表明各個(gè)科室之間無交叉感染現(xiàn)象出現(xiàn)，均為PA的醫(yī)院散發(fā)感染。4例患者連續(xù)感染的PA指紋圖譜發(fā)生改變(圖2)，19例患者不同時(shí)間段PA的RAPD指紋圖譜未發(fā)生改變?；蛐拖嗨葡禂?shù)范圍為0.64～0.93，基因型A和G、基因型B和R、基因型D和E、基因型M和P相似系數(shù)最大，均為0.93，說明它們之間具有高度的同源性，見圖3。

注：Marker 為DNA分子量標(biāo)志物；A～S為117株P(guān)A臨床分離株擴(kuò)增出的19種基因型條帶。

圖1 PA的RAPD分型指紋圖譜

注：M 為DNA分子量標(biāo)志物。

圖2 4例患者連續(xù)感染的PA RAPD指紋圖譜

圖3 19種PA基因型的聚類分析樹狀圖

3 討論

PA的傳統(tǒng)分型方法主要有血清學(xué)分型、噬菌體分型、 菌素綠膿素分型和耐藥分型等基于微生物某一特征表達(dá)或缺失的表型分型方法， 而迫于生存環(huán)境的選擇性壓力，這些表型可發(fā)生改變而導(dǎo)致分型結(jié)果失真[5]。近年來隨著分子生物學(xué)的空前發(fā)展給病原菌分型提供了新的技術(shù)手段，相對(duì)于傳統(tǒng)的分型方法，其具有分型能力強(qiáng)、適用范圍廣、穩(wěn)定性好等特點(diǎn)[6]。RAPD基因分型技術(shù)是1990年由Williams等[7]建立的揭示基因組多態(tài)性的分型方法，其擴(kuò)增出的多態(tài)性DNA指紋圖譜既可表現(xiàn)種系發(fā)育的聯(lián)系，又可反映不同克隆間的差異，故可從基因水平對(duì)微生物進(jìn)行分型。RAPD基因分型技術(shù)較其他分子生物學(xué)技術(shù)如脈沖場凝膠電泳(PFGE)更簡捷、廉價(jià)、快速，更適用于大量樣本的篩選，且區(qū)分能力與PFGE等方法相同[3]。由于RAPD基因分型所需引物為隨機(jī)多態(tài)核苷酸序列(通常為10個(gè)堿基對(duì))，具有通用性，不需要預(yù)先知道基因組的任何序列信息，是目前發(fā)展中國家進(jìn)行PA基因分型最常使用的方法。

本研究利用RAPD基因分型技術(shù)將117株P(guān)A分為19種基因型，PA呈現(xiàn)出較為明顯的多態(tài)性(16%)，與Nanvazadeh等[8]報(bào)道的多態(tài)性結(jié)果(18%)較為一致。醫(yī)院感染PA基因型呈現(xiàn)明顯多態(tài)性與患者免疫力低下、易感染外界環(huán)境中各種基因型的菌株有關(guān)，這些菌株可能為某些物品的流通或探視人員來往頻繁，將外界環(huán)境中不同基因型的菌株帶入醫(yī)院病房內(nèi)，也可能為患者在醫(yī)院外自身感染的細(xì)菌。因此，應(yīng)加強(qiáng)病房管理，減少人員探訪，做好病房內(nèi)的消毒隔離工作。

回顧病史資料發(fā)現(xiàn)，重癥醫(yī)學(xué)科是PA檢出率最高的臨床科室，其次為燒傷整形外科和中醫(yī)科，且感染患者以下呼吸道感染最為多見。這些患者的原發(fā)病主要是嚴(yán)重顱腦損傷和大面積燒傷，共同特點(diǎn)是住院時(shí)間較長、基礎(chǔ)疾病重、免疫力低下、需要頻繁的護(hù)理及侵入性治療操作。PA黏附力極強(qiáng)，易在各類醫(yī)用材料和器械上黏附而成為貯菌源，同時(shí)PA廣泛存在于自然環(huán)境中，可造成免疫力低下患者感染，甚至引起患者之間的交叉感染。因此，積極治療患者原發(fā)病和下呼吸道感染，妥善處理患者呼吸道分泌物及醫(yī)療廢物，嚴(yán)格醫(yī)療器械消毒、醫(yī)護(hù)人員手消毒以及病房環(huán)境消毒對(duì)避免PA感染尤為重要。

同一病區(qū)或不同病區(qū)2例以上患者分離出相同基因型的PA，可確定為醫(yī)院感染PA局部爆發(fā)流行[9]。本研究中重癥醫(yī)學(xué)科及燒傷整形外科各發(fā)生一起PA爆發(fā)流行，國內(nèi)其他研究也發(fā)現(xiàn)PA存在醫(yī)院內(nèi)爆發(fā)流行現(xiàn)象[10～12]。除上述二起爆發(fā)流行外，其余各個(gè)科室之間無交叉感染現(xiàn)象出現(xiàn)，均為PA的醫(yī)院散發(fā)感染，應(yīng)屬于患者自身感染的細(xì)菌，院內(nèi)感染的可能性小。Vaez等[13]和Wolska等[14]的研究均表明，大多數(shù)患者具有獨(dú)一無二的RAPD指紋圖譜，說明感染起源于患者自身占多數(shù)，但在作者調(diào)查的醫(yī)院也存在患者之間的交叉感染，這與本文研究結(jié)果較一致。另外，本文通過對(duì)同一患者不同時(shí)間送檢標(biāo)本的檢測發(fā)現(xiàn)，19例個(gè)體不同時(shí)間段PA的RAPD 指紋圖譜沒有發(fā)生改變，而另4例連續(xù)感染PA的指紋圖譜發(fā)生改變，這種不同的指紋圖譜是否為不同分型PA感染同一個(gè)體，或是環(huán)境選擇性壓力導(dǎo)致細(xì)菌基因突變，尚有待進(jìn)一步研究。

綜上所述，醫(yī)院各科室長期持續(xù)感染的PA分離株存在多種基因型，提示PA在感染過程中發(fā)生基因變異，存在基因多態(tài)性；對(duì)有PA感染危險(xiǎn)因素的住院患者進(jìn)行PA的RAPD基因分型檢查，對(duì)預(yù)防和控制院內(nèi)PA感染和爆發(fā)流行具有較好的實(shí)用價(jià)值。

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Genotyping of Pseudomonas aeruginosa clinical isolates

ZHOUXiaoqing1,XIEYantong,LIANGHongjie,WANGKe,LIYanan,KONGJinliang

(1TheFirstAffiliatedHospitalofGuangxiMedicalUniversity,Nanning530021,China)

Objective To analyze the genotypes of Pseudomonas aeruginosa (PA) isolated from inpatients with long-term and continuous infection in various departments of hospital, the and to explore the genetic variation of PA. Methods The strains of PA were collected from specimens of various departments of inpatients, and then we amplified the strains in which the infection lasted for more than 30 days, obtained the RAPD fingerprinting by random amplified polymorphic DNA (RAPD) genotyping technique, analyzed homology by homology clustering, and understood the genetic relationship between PA through the similarity coefficient. At the same time, we compared the RAPD type to determine whether there was an epidemic outbreak and whether there was a variation between the strains from the same patients with continuous infection. Results A total of 293 strains of PA were collected, including 117 strains in which the infection duration was longer than 30 days, and then 19 genotypes were amplified with A-S type, and the classification rate is 100%. The similarity coefficient ranged from 0.64 to 0.93, the similarity coefficient of genotypes A and G, genotypes B and R, genotypes D and E, genotypes M and P was 0.93, indicating a high degree of homology between them. In the intensive care unit and burn plastic surgery, the same RAPD type was detected in different patients, the rest of the patients had different RAPD types. The PA fingerprints of 4 patients who suffered continuous infection changed. Conclusion There are many genotypes in PA isolates from patients in various departments of the hospital, which suggests that PA gene mutation occurs in the process of infection, and there is a genetic polymorphism.

Pseudomonas aeruginosa; random amplified polymorphic DNA; genotypes

國家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(81260663/81460003)；廣西自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(2013GXNSFAA019166)。

周小青(1982-)，女，主治醫(yī)師，研究方向?yàn)榉尾扛腥拘约膊　-mail： 82990421@qq.com

簡介：孔晉亮(1971-)，男，主任醫(yī)師，研究方向?yàn)楹粑到y(tǒng)感染性疾病、胸部腫瘤、胸膜疾病。E-mail： kjl071@163.com

10.3969/j.issn.1002-266X.2016.44.005

R37

A

1002-266X(2016)44-0016-04

2016-07-16)