■ 左然濤 李 敏 李 廣 吳反修 常亞青 范文濤

（1.大連海洋大學(xué)農(nóng)業(yè)部北方海水增養(yǎng)殖重點實驗室，遼寧大連116023；2.全國水產(chǎn)技術(shù)推廣站中國水產(chǎn)學(xué)會，北京100122；3.亞太興牧科技有限公司，北京100193）

中間球海膽（Strongylocentrotus intermedius）原產(chǎn)于日本北海道和俄羅斯遠東沿海，由于其性腺色澤好、味甜，在國際市場廣受歡迎。1989年，大連海洋大學(xué)將其引入中國，現(xiàn)已成為我國北方重要的海水養(yǎng)殖品種。海帶、裙帶菜、石莼是海膽?zhàn)B殖的主要餌料來源。但是，鮮活生物餌料供應(yīng)極不穩(wěn)定，尤其是每年夏季高溫季節(jié)，只能以干品替代，且高溫期極易腐爛變質(zhì)，這嚴(yán)重降低了海膽的成活率、攝食量和生長速率。配合飼料因其原料來源廣泛、營養(yǎng)搭配均衡、飼料利用率高成為海膽?zhàn)B殖產(chǎn)業(yè)獲得突破性發(fā)展的關(guān)鍵。目前，配合飼料在北方球海膽（S.droebachiensis）、加州紅海膽（S.franciscanus）、Evechinus chloroticus和中間球海膽（S.intermedius）親膽中已有報道，結(jié)果表明配合飼料在降低餌料系數(shù)，提高海膽性腺指數(shù)和營養(yǎng)品質(zhì)方面具有生物餌料無可比擬的優(yōu)勢。

精氨酸對水產(chǎn)動物免疫促進作用的研究已有較多報道，其中精氨酸代謝產(chǎn)生的一氧化氮（NO）被認(rèn)為在免疫信號轉(zhuǎn)導(dǎo)過程中發(fā)揮著重要作用。此外，陸生動物中的研究表明飼料中添加精氨酸能夠提高性腺發(fā)育和產(chǎn)仔數(shù)量。但是，目前精氨酸價格昂貴，不適合規(guī)?；暳仙a(chǎn)使用。N-氨甲酰谷氨酸（NCG）由于價格低廉且具有精氨酸相似的生理功效成為較為理想的精氨酸替代物。陸生動物中的研究表明，NCG可有效激活氨甲酰磷酸合成酶，提高動物體內(nèi)精氨酸的合成速率，從而提高斷奶仔豬的生長速率，改善母豬的繁殖性能以及公豬的精液質(zhì)量。但NCG對水產(chǎn)動物生理影響的研究鮮見報道。因此，本研究以中間球海膽為研究對象，探討了飼料中添加NCG對海膽生長、性腺發(fā)育、消化酶活力和免疫性能的影響，以期為海膽促熟期間配合飼料中NCG的添加提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 飼料配制

以海藻粉和豆粕為主要蛋白源，魚油和豆油為主要脂肪源，通過梯度添加NCG配制6種等氮（粗蛋白，21%；粗脂肪，4%）的試驗飼料，使飼料NCG水平依次為0%、0.04%、0.08%、0.12%、0.16%、1.00%（配方見表1）。所有粉狀原料粉碎后過100目篩，并按照配比將飼料干粉進行充分混合，然后將魚油、豆油和卵磷脂的混合物均勻添加至上述干粉飼料中。隨后，向加過油的原料中添加30%自來水并利用混勻機充分混合均勻。利用制粒機制粒（3 mm×3 mm）。制作好的飼料于40℃烘箱烘干，冷卻后用雙層塑料袋包裝，儲存于陰涼干燥處備用。

表1 飼料配方(%飼料干物質(zhì))

1.2 試驗動物

本試驗所需的2齡中間球海膽購自大連旅順龍王塘某養(yǎng)殖場，試驗開始前將其放置于1 000 L的水槽中進行暫養(yǎng)，每天換水和投喂配合飼料1次（17∶00），換水比例為總體積的50%。經(jīng)過2周馴化，將大小均勻、健康無病的海膽[初始體重：(62.0±1.4)g]分養(yǎng)至21個網(wǎng)籠（直徑15 cm，高20 cm）中，試驗網(wǎng)籠掛放在1 000 L藍色玻璃鋼水槽中，每個網(wǎng)籠投放20只海膽。每種飼料分別隨機投喂三個網(wǎng)籠的海膽，另有三個網(wǎng)籠投喂海帶作為對照。

ATLAS軟件的設(shè)計采用了先進的面向?qū)ο蟮脑O(shè)計模式，使用多態(tài)、虛擬繼承與模板技術(shù)，在保證程序性能的前提下最大限度降低了程序模塊之間的耦合性，具有非常高的可擴展性并且易維護。

1.3 養(yǎng)殖管理

Nfi和Nft——分別是攝食生長試驗初期和末期試驗海膽的數(shù)目；

1.4 消化酶活力測定

支氣管熱成形術(shù)(bronchial thermoplasty, BT)通過射頻消融支氣管平滑肌(airway smooth muscle, ASM)用于支氣管哮喘的治療，但主要針對難治性支氣管哮喘，目前已在國內(nèi)外進行了一些試驗研究，并取得了初步的臨床效果，現(xiàn)綜述如下。

1.5 免疫相關(guān)酶活力測定

海膽體腔液免疫相關(guān)酶活力采用南京建成試劑盒進行測定。超氧化物歧化酶（SOD）活力定義為每毫升體腔液中SOD抑制率達50%時多對應(yīng)的SOD量為一個SOD活力單位（U）；過氧化氫酶（CAT）活力定義為每毫升體腔液每秒鐘分解1 μmol的H2O2的量為一個活力單位；谷胱甘肽-S轉(zhuǎn)移酶（GST）活力定義為每毫升體腔液在37℃反應(yīng)1 min，使反應(yīng)體系中GSH濃度降低1 μmol/l為一個酶活力單位；堿性磷酸酶（AKP）的活力定義為每毫升體腔液在37℃條件下15 min產(chǎn)生1 mg酚為一個活力單位。

1.6 計算和統(tǒng)計方法

持續(xù)長度是該模型的一個基本參數(shù).持續(xù)長度與自由旋轉(zhuǎn)鏈的處理方法有異曲同工之妙,因為二者都采用了后鍵依次在前一鍵上投影并依此前推至所需鍵的計算方法.自由旋轉(zhuǎn)鏈因為需要所有鍵之間進行兩兩點乘,因此其平均范圍廣,需要大量樣本的統(tǒng)計平均方可采用投影法進行平均處理.持續(xù)長度涉及的是各個鍵在第一個鍵方向上投影,一旦鍵的方向與第一個鍵相反,它在z軸方向的投影就是負(fù)值.經(jīng)平均處理后,負(fù)值就不再出現(xiàn),代之以收斂于0的投影值.因此,持續(xù)長度的計算同樣應(yīng)該是大量連接單元的統(tǒng)計平均值.

將-80℃保存的腸道在冰上解凍，按重量（g）∶體積（ml）=1∶9比例加入生理鹽水，冰水浴條件下機械勻漿，冷凍離心（4 ℃，2 500 r/min）10 min后留取上清液。胃蛋白酶、淀粉酶、脂肪酶、總蛋白含量測定均采用南京建成生物工程研究所生產(chǎn)的試劑盒，按照試劑盒說明書進行操作。利用Epoch酶標(biāo)儀（美國Biotek公司）對顯色溶液吸光度進行測定。其中，每毫克組織蛋白，37℃下，每分鐘分解蛋白生產(chǎn)1 μg氨基酸相當(dāng)于1個胃蛋白酶活力單位；每毫克蛋白在37℃與底物作用30 min，水解10 mg淀粉定義為1個淀粉酶活力單位；在37℃條件下，每克組織蛋白與底物反應(yīng)1 min，每消耗1 μmol底物為一個脂肪酶活力單位。

試驗在大連海洋大學(xué)農(nóng)業(yè)部北方海水增養(yǎng)殖重點實驗室進行，試驗周期為56 d。試驗期間，每天換水一次，換水比例為玻璃鋼水槽容積的50%。換水時吸底，以清除水槽底部的殘餌和糞便，每次換水后投喂配合飼料（17∶00）。試驗期間，溶氧＞5 mg/l，水溫保持在（15±2）℃，鹽度為28～30。攝食生長試驗結(jié)束后，對每個網(wǎng)籠中的海膽進行計數(shù)并稱重，每個網(wǎng)籠取6只海膽，解剖并稱量性腺以計算性腺指數(shù)，分離消化道并收集于1.5 ml離心管中，用1 ml注射器吸取體腔液，離心5 min（4 ℃，3 000 r/min），將上清液移至新的1.5 ml離心管，消化道和體腔液上清液氮速凍后保存于-80℃?zhèn)溆谩?/p>

針對局部給藥方面，有臨床相關(guān)研究者提出[5] ，通過將不同劑量紫杉醇涂層支架，植入至豬心的冠脈左前降支部位，經(jīng)1個月后行冠狀動脈造影，結(jié)果發(fā)現(xiàn)不同組的新生內(nèi)膜面積，會隨著紫杉醇劑量的不斷增加呈減少趨勢。針對全身給藥方面研究，有臨床研究學(xué)者提出，通過將不同劑量紫杉醇（微粒型），注入兔雙側(cè)骼動脈的內(nèi)部剝落部位，劑量較高的一組相較劑量較低的一組，新生內(nèi)膜皮平均厚度明顯較低。

G——海膽性腺的重量(g)。

攝食配合飼料和海帶的海膽在蛋白酶、脂肪酶和淀粉酶方面未見顯著性差異，說明配合飼料可被海膽很好地接受并利用。NCG的添加并未顯著影響中間球海膽腸道消化酶活力（P＞0.05）。從生長指標(biāo)來看，NCG的添加未對海膽生長速率產(chǎn)生顯著影響，這也可能與NCG未改變海膽消化酶活力有關(guān)。

2 試驗結(jié)果

2.1 飼料中添加NCG對中間球海膽成活率、增重率和性腺發(fā)育速率的影響（見表2）

表2 飼料中添加NCG對海膽成膽生長和性腺指數(shù)的影響

海帶處理組海膽體腔液SOD和CAT活力顯著高于未添加NCG飼料組，而添加NCG不同程度提高了海膽體腔液中SOD和CAT的活力。隨著飼料中NCG添加量的升高，海膽SOD和CAT活力呈先升高后下降的趨勢，當(dāng)NCG添加量為0.12%和0.16%時，海膽分別具有最高SOD活力和最高CAT活力，顯著高于未添加NCG處理組（P＜0.05）。過量添加NCG（1%）有降低海膽SOD和CAT活力的趨勢（P＞0.05）。海膽體腔液中GST和AKP活力在各飼料組間差異不顯著（P＞0.05）。

式中：Wf和Wi——分別是海膽平均末重和平均初重(g)；

2.2 飼料中添加NCG對中間球海膽消化酶活力的影響（見表3）

試驗數(shù)據(jù)采用SPSS16.0軟件進行統(tǒng)計分析，在單因素方差分析達到顯著水平時（P＜0.05），采用Turkey's檢驗進行多重比較，數(shù)據(jù)表示為“平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤”的形式。

2.3 飼料中添加NCG對中間球海膽免疫性能的影響（見表4）

表3 飼料中添加NCG對海膽成膽消化酶活力的影響(U/mg Pro)

表4 飼料中添加NCG對海膽成膽免疫性能的影響(U/ml)

中間球海膽的成活率均大于90%，且各處理組之間差異不顯著（P＞0.05）。飼料中添加NCG對海膽的終末體重和增重率均未產(chǎn)生顯著影響（P＞0.05）。配合飼料組海膽性腺指數(shù)均高于海帶組，隨著飼料中NCG添加量的升高，海膽性腺指數(shù)顯著升高，并當(dāng)NCG添加量為0.12%時具有最大值（14.76%），與0.16%和1.0%NCG組差異不顯著，但顯著高于NCG未添加組和低添加量組（0.04%～0.08%）的性腺指數(shù)（P＜0.05）。

閥廳屋蓋上的單軌吊車及懸掛設(shè)備荷載如圖2所示。屋蓋上設(shè)置7座單軌吊車，計算時考慮2座吊車同時運行。設(shè)備荷載按照集中荷載考慮，位置按實布置，每處吊點集中荷載標(biāo)準(zhǔn)值20 kN。

3 討論

3.1 飼料中添加NCG提高了海膽性腺指數(shù)

本研究中，飼料中添加0.12%的NCG能顯著提高海膽的性腺指數(shù)。這與陸生動物中的研究結(jié)果相一致。飼料中添加0.1%的NCG顯著提高了母豬所產(chǎn)仔豬的數(shù)量和出生重量。這可能是由于NCG能夠促進精氨酸的內(nèi)源性合成，從而間接增加日糧中精氨酸含量。已有研究證明飼料中添加1%的精氨酸能夠顯著提高母豬每窩活仔數(shù)和出生體重。此外，精氨酸在體內(nèi)分解代謝過程中會產(chǎn)生多氨。多氨在DNA和蛋白質(zhì)合成中起調(diào)控作用，因此也調(diào)控著機體的細胞增殖和分化，進而促進性腺組織的分化和增長。

3.2 飼料中添加NCG促進了海膽非特異性免疫力

本研究中，與不添加NCG飼料組相比，添加NCG顯著提高了海膽體腔液中SOD和CAT活力，且與海帶處理組具有相當(dāng)?shù)乃?。楊平等發(fā)現(xiàn)飼料中添加0.1%或1.0%NCG顯著提高了妊娠期母豬的免疫力。精氨酸已被證實在多種陸生動物中發(fā)揮免疫促進作用，尤其是當(dāng)動物機體處于亞健康狀態(tài)時這種免疫促進作用更為顯著。在水產(chǎn)動物中研究相對較少，Buentello等研究發(fā)現(xiàn)2%～4%精氨酸能夠顯著提高斑點叉尾鮰的免疫力和抗病力。Cheng等發(fā)現(xiàn)精氨酸能夠提高美國紅魚和雜交條紋鱸的免疫力。有關(guān)精氨酸調(diào)控機體免疫性能機制的研究已有諸多報道，其中精氨酸體內(nèi)代謝產(chǎn)物NO被公認(rèn)為參與動物免疫反應(yīng)。NO是動物體以精氨酸為底物在NO合成酶的作用下合成的，F(xiàn)erid Murad因其發(fā)現(xiàn)NO作為信號分子具有松弛平滑肌細胞和擴張血管的作用被授予諾貝爾生理學(xué)獎。NCG是精氨酸內(nèi)源合成途徑中關(guān)鍵酶（CPS-1）的有效激活劑，能增加精氨酸的內(nèi)源合成，從而通過精氨酸間接發(fā)揮免疫調(diào)控作用。

4 結(jié)論

飼料中添加NCG并未改變中間球海膽生長速率和消化酶活力，但卻顯著影響了其性腺發(fā)育速率和免疫性能。綜合性腺發(fā)育和免疫指標(biāo)，推薦中間球海膽成膽配合飼料中NCG的添加量為0.12%～0.16%飼料干物質(zhì)。

（參考文獻刊略，需者可函索rtzou@dlou.edu.cn）