白耀博，陳學(xué)進(jìn)，鳳舞劍，曹 丹

(1.徐州生物工程職業(yè)技術(shù)學(xué)院，江蘇徐州 221151；2.河南科技學(xué)院園藝園林學(xué)院，河南新鄉(xiāng) 453003)

徐州市草莓灰霉病菌對(duì)嘧霉胺的抗藥性

白耀博1，陳學(xué)進(jìn)2，鳳舞劍1，曹 丹1

(1.徐州生物工程職業(yè)技術(shù)學(xué)院，江蘇徐州 221151；2.河南科技學(xué)院園藝園林學(xué)院，河南新鄉(xiāng) 453003)

[目的]明確徐州市草莓灰霉病菌對(duì)嘧霉胺的抗藥性。[方法]2014、2015年在徐州不同草莓保護(hù)地采集草莓灰霉病菌(Botrytiscinerea)樣品，經(jīng)單孢分離得到93個(gè)草莓灰霉病菌菌株，采用菌絲生長(zhǎng)速率法測(cè)定其對(duì)嘧霉胺的抗藥性。[結(jié)果]檢測(cè)的抗性菌株比例高達(dá)53.76%，且以低抗菌株為主，占35.48%。徐州市不同區(qū)縣抗性菌株抗性頻率不同，其中銅山區(qū)、賈汪區(qū)、睢寧縣、沛縣已出現(xiàn)高抗菌株。[結(jié)論]徐州市草莓灰霉病菌對(duì)嘧霉胺已產(chǎn)生不同水平的抗藥性，以低抗菌株為主，且抗性菌株較普遍，應(yīng)合理更換或輪換使用與嘧霉胺無(wú)交互抗性的藥劑。

灰霉病菌；殺菌劑；抗藥性

由灰葡萄孢(BotrytiscinereaPers.)引起的草莓灰霉病是保護(hù)地草莓上發(fā)生普遍、危害嚴(yán)重的病害之一，造成草莓爛果，一般減產(chǎn)10%～30%，重者在50%以上[1]?；瘜W(xué)防治作為草莓病害防治的主要手段，經(jīng)常使用苯并咪唑類(lèi)、二甲酰亞胺類(lèi)和苯胺基嘧啶類(lèi)等殺菌劑?；颐共【蚱渚哂屑闹鞣秶鷱V、繁殖快和遺傳變異頻繁等特點(diǎn)，極易對(duì)殺菌劑產(chǎn)生抗性[2]。嘧霉胺屬于苯胺基嘧啶類(lèi)殺菌劑，不抑制孢子的萌發(fā)，主要抑制芽管伸長(zhǎng)和菌絲生長(zhǎng)，具備葉片穿透及根部?jī)?nèi)吸作用，是防治灰霉病的高效藥劑[3]。已有研究表明，嘧霉胺主要抑制蛋氨酸合成和胞壁水解酶分泌[3]?；颐共【鷮?duì)嘧霉胺的抗藥性受單基因控制，易產(chǎn)生高風(fēng)險(xiǎn)的抗性問(wèn)題。嘧霉胺自20世紀(jì)90代在歐洲被廣泛使用以來(lái)，很多國(guó)家報(bào)道了抗性菌株的出現(xiàn)[4]。而我國(guó)自1998年使用嘧霉胺后，部分省市也有報(bào)道灰霉病菌的抗嘧霉胺菌株[5]。徐州市草莓灰霉病發(fā)生和危害十分嚴(yán)重，而嘧霉胺在當(dāng)?shù)厥褂枚嗄旰罂顾幮郧闆r尚未明確。鑒于此，筆者于2014、2015 年在徐州市草莓主產(chǎn)區(qū)采集、分離草莓灰霉病菌菌株，在室內(nèi)測(cè)定了其對(duì)嘧霉胺的敏感性，并測(cè)定了徐州市草莓灰霉病菌對(duì)嘧霉胺的抗藥性水平，旨在為徐州市草莓種植中嘧霉胺的合理使用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 供試藥劑。95.5%嘧霉胺原藥由陜西農(nóng)心作物科技有限公司提供。嘧霉胺原藥預(yù)溶解于甲醇，配成10 mg/mL母液，保存于4 ℃冰箱中，使用時(shí)稀釋成適當(dāng)濃度。

1.1.2 培養(yǎng)基。菌株分離采用馬鈴薯葡萄糖瓊脂(PDA)培養(yǎng)基：馬鈴薯200.0 g，葡萄糖20.0 g，瓊脂15.0 g，加蒸餾水至1 000 mL。 敏感性測(cè)定采用Chapeland組合培養(yǎng)基[3]：葡萄糖10.0 g，瓊脂15.0～20.0 g，K2HPO41.5 g，KH2PO42.0 g，MgSO4·7H2O 5.0 g,(NH4)2SO41.0 g，加蒸餾水至1 000 mL。

1.2 方法

1.2.1 試驗(yàn)菌的采集與培養(yǎng)。 2014年11月至2015 年4月，在徐州周?chē)?個(gè)區(qū)縣草莓主產(chǎn)區(qū)調(diào)查并采集草莓灰霉病病果，用滅菌的木質(zhì)牙簽輕觸病果上灰霉病菌霉層，迅速放入PDA培養(yǎng)基斜面上，帶回實(shí)驗(yàn)室編號(hào)，注明時(shí)間地點(diǎn)(表1)。1個(gè)病果作為1個(gè)菌株，用 PDA分離純化后，得到93個(gè)單孢菌株，轉(zhuǎn)至 PDA 斜面上，保存于4 ℃冰箱中供抗藥性測(cè)定使用。

表1 供試草莓灰霉病菌菌株及其來(lái)源

1.2.2 草莓灰霉病菌對(duì)嘧霉胺的敏感性測(cè)定。采用菌絲生長(zhǎng)速率法[6]，將所有單孢菌株置于制備好的一系列濃度含藥培養(yǎng)基上，檢測(cè)草霉灰霉病菌對(duì)嘧霉胺的抗藥性。通過(guò)測(cè)定比較藥劑對(duì)各菌株的抑制生長(zhǎng)有效中濃度(EC50)，確定抗性水平。對(duì)嘧霉胺的抗藥性水平由紀(jì)明山等[3]的敏感基線值(0.091 1 μg/mL)確定：菌株的EC50值小于敏感基線的5倍(0.455 5 μg/mL)為敏感菌株，當(dāng)菌株的EC50值在敏感基線的5～10倍(0.455 5～0.911 0 μg/mL)為低抗菌株，當(dāng)菌株的EC50值在敏感基線的10～40倍(0.911 0～3.644 0 μg/mL)為中抗菌株，當(dāng)菌株的EC50值大于敏感基線的40倍(3.644 0 μg/mL)為高抗菌株。

當(dāng)PDA 培養(yǎng)基滅菌后溫度降到40 ℃左右時(shí)，加入各藥劑，分別制成含嘧霉胺0.25、0.50、1.00、2.00、4.00 μg/mL的含藥平皿。以不加藥的PDA培養(yǎng)基為對(duì)照組，每處理3次重復(fù)。將待檢測(cè)的灰霉病菌在 PDA平皿上培養(yǎng)3 d 后，取生長(zhǎng)活力一致的直徑5 mm 的菌片移至各含藥平皿上，在25 ℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)3 d，十字交叉法測(cè)量菌落直徑。應(yīng)以菌絲凈生長(zhǎng)直徑的差異計(jì)算各菌株在不同含藥培養(yǎng)基上的菌絲生長(zhǎng)抑制百分率。用DPS統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行處理，求出藥劑對(duì)各菌株的EC50、毒力回歸方程以及相關(guān)系數(shù)，并統(tǒng)計(jì)各區(qū)縣抗性敏感菌株的發(fā)生頻率。

抗性頻率=抗性菌株數(shù)/測(cè)定菌株數(shù)×100%

2 結(jié)果與分析

2.1 徐州市不同區(qū)縣草莓灰霉病菌對(duì)嘧霉胺的抗性頻率 由表2可知，徐州市的草莓灰霉病菌對(duì)嘧霉胺的抗藥性比例較高，占總檢測(cè)菌株的53.76%。徐州市各區(qū)縣抗嘧霉胺草莓灰霉病菌株的頻率和抗藥性水平都存在明顯差異。銅山區(qū)、賈汪區(qū)、新沂市、睢寧縣草莓灰霉病菌的抗性頻率較高，在60%以上； 賈汪區(qū)、睢寧縣、銅山區(qū)、沛縣都出現(xiàn)了不同水平的抗性菌株；泉山區(qū)檢測(cè)到低抗菌株和中抗菌株，抗性頻率達(dá)40.00%；新沂市、豐縣檢測(cè)到的都是低抗菌株，其抗性頻率分別是66.67%、10.00%；邳州未檢測(cè)到抗性菌株，均為敏感菌株。上述區(qū)縣抗性頻率的差異可能與不同地區(qū)的用藥歷史和用藥水平有關(guān)。

表2 徐州市草莓灰霉病菌對(duì)嘧霉胺的抗藥性

2.2 徐州市草莓灰霉病菌對(duì)嘧霉胺的抗藥性 由表3可知，徐州市的草莓灰霉病菌對(duì)嘧霉胺的抗藥性出現(xiàn)分化，抗性菌株比例達(dá)53.76%。其中，33株屬于低抗菌株，占測(cè)定菌株的35.48%；8株屬于中抗菌株，占測(cè)定菌株的8.60%；9株屬于高抗菌株，占測(cè)定菌株的9.67%；其他43株敏感菌株占測(cè)定菌株的46.24%?？剐跃闖W14抗性水平最高，其EC50是9.083 2 μg/mL，是最敏感菌株P(guān)Z5(EC50為0.061 2 μg/mL)的148倍，說(shuō)明徐州市草莓灰霉病菌已經(jīng)對(duì)嘧霉胺產(chǎn)生不同水平的抗性，以低抗菌株為主，抗性群體較普遍。

表3 徐州市草莓灰霉病菌對(duì)嘧霉胺的抗性表型及頻率

Table 3 Resistant phenotypes and resistance frequency ofBotrytiscinereato pyrimethanil in Xuzhou

抗性表型Resistantphenotypes測(cè)定菌株數(shù)Numberofdetectedstrains個(gè)最高EC50ThehighestEC50μg/mL最低EC50ThelowestEC50μg/mL抗性頻率Resistancefrequency%高抗Highresist?ance99．08324．12309．67中抗Middlere?sistance82．80951．06508．60低抗Lowresist?ance330．86750．475635．48敏感Sensitivity430．42450．061246．24

3 結(jié)論與討論

自20世紀(jì)90年代使用苯并咪唑類(lèi)多菌靈、二甲酰亞胺類(lèi)腐霉利以及N-苯基氨基甲酸酯類(lèi)乙霉威殺菌劑防治灰霉病以來(lái)，相繼有病原菌對(duì)藥劑產(chǎn)生抗藥性的報(bào)道[6]，而種植者通過(guò)增加施藥次數(shù)、加大使用劑量保證生產(chǎn)，迫使高抗菌株成為優(yōu)勢(shì)種群。嘧霉胺是1998年之后在我國(guó)推廣的灰霉病特效藥，灰霉病菌對(duì)該類(lèi)藥劑的抗藥性由單基因控制，因此很容易產(chǎn)生抗藥性。近年來(lái)國(guó)內(nèi)遼寧省、山東省、北京市等關(guān)于灰霉病菌對(duì)嘧霉胺等苯胺基嘧啶類(lèi)殺菌劑產(chǎn)生抗藥性的報(bào)道很多[4]，導(dǎo)致出現(xiàn)高抗菌株，嚴(yán)重影響田間防治效果。該研究通過(guò)對(duì)93株灰霉病菌檢測(cè)結(jié)果表明，在徐州草莓主產(chǎn)區(qū)，草莓灰霉病菌對(duì)嘧霉胺的抗藥性較普遍，抗性菌株的比例高達(dá) 53.76%，抗性水平以低抗為主，并且有向中高抗水平發(fā)展的趨勢(shì)，其中抗性水平最高的菌株是最敏感菌株抗性水平的148倍。江蘇省蘇南地區(qū)草莓灰霉病菌對(duì)嘧霉胺出現(xiàn)抗藥性，抗性頻率在60%以上[7]，這與該研究結(jié)果一致。賈汪區(qū)、睢寧縣、銅山區(qū)、沛縣4個(gè)區(qū)縣草莓灰霉病菌對(duì)嘧霉胺已經(jīng)出現(xiàn)高抗菌株，風(fēng)險(xiǎn)較大，值得重視。

綜上可見(jiàn)，徐州草莓灰霉病菌已經(jīng)對(duì)嘧霉胺產(chǎn)生了不同水平的抗藥性，以低抗菌株為主，且抗性菌株較普遍。為了延長(zhǎng)嘧霉胺的使用壽命，避免產(chǎn)生嚴(yán)重抗藥性給生產(chǎn)帶來(lái)重大損失，建議徐州市加強(qiáng)對(duì)嘧霉胺田間抗藥性的監(jiān)測(cè)工作，根據(jù)各地的實(shí)際情況，與嘧霉胺無(wú)交互抗性的藥劑交替，減少每季施藥量。參考文獻(xiàn)

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Resistance Detection ofBotrytiscinereato Pyrimethanil in Xuzhou

BAI Yao-bo1, CHEN Xue-jin2, FENG Wu-jian1et al

(1.Xuzhou Vocational College of Bioengineering, Xuzhou, Jiangsu 221151; 2.School of Horticulture Landscape Architecture, Henan Institute of Science and Technology, Xinxiang, Henan 453003)

[Objective] The aim was to clear resistance detection ofBotrytiscinereato pyrimethanil in Xuzhou. [Method] We collectedBotrytiscinereasamples from different strawberry protected areas in 2014 and 2015, isolated 93Botrytiscinereastrains through single spore isolation, and determined its resistance to pyrimethanil by mycelial growth rate method. [Result] The rate of resistant strains reached 53.76%, which were mainly low resistant strains, accounting for 35.48%. The resistant strains in different regions had different resistance frequency, among them Tongshan district, Jiawang district, Suining district and Peixian had high resistant strains. [Conclusion] TheBotrytiscinereain Xuzhou had generated different levels of resistance, and were mainly low resistant strains, so some regents which had no interaction resistance with pyrimethanil should be used to effectively controlBotrytiscinerea.

Botrytiscinerea; Fungicides; Resistance

徐州生物工程職業(yè)技術(shù)學(xué)院院級(jí)基金項(xiàng)目(2014B01)。

白耀博(1986- )，男，陜西西安人，講師，碩士，從事保護(hù)地蔬菜病蟲(chóng)害防治研究。

2016-10-17

S 436.68+4

A

0517-6611(2016)35-0162-03