王 麗，段黎娟，徐海瑛

(黃河科技學(xué)院，河南鄭州 450006)

黃瓜藤提取物抑菌作用研究

王 麗，段黎娟，徐海瑛

(黃河科技學(xué)院，河南鄭州 450006)

[目的]利用不同工藝提取黃瓜藤，研究其提取物抑菌作用。[方法]首先采用水煎煮法和醇提取法對黃瓜藤進(jìn)行提取，濾紙片法、最低抑菌濃度(MIC)法測定提取液對大腸桿菌、福氏痢疾桿菌的抑菌作用，并用十字交叉法計(jì)算抑菌圈的直徑。[結(jié)果]黃瓜藤水提取液對大腸桿菌和福氏痢疾桿菌的抑菌直徑均大于10 mm，黃瓜藤水提取液對大腸桿菌和福氏痢疾桿菌的MIC均為 59.56 mg/mL。甲醇提取液對大腸桿菌和福氏痢疾桿菌的MIC分別為8.69、17.39 mg/mL。[結(jié)論]黃瓜藤水提取液和甲醇提取液對大腸桿菌和福氏痢疾桿菌均有抑菌作用，氯仿提取液對大腸桿菌和福氏痢疾桿菌均無抑菌作用。

黃瓜藤；提取物；抑菌作用；大腸桿菌；福氏痢疾桿菌

黃瓜藤(CucumissativiCaulis)是葫蘆科(Cucurbitaceae)甜瓜屬植物黃瓜的干燥藤莖，最早始載于《滇南本草》。據(jù)文獻(xiàn)記載，黃瓜藤有利水、解毒，治痢疾、淋病、黃水瘡的功效。在民間，黃瓜藤在豬病上應(yīng)用較多，特別是治療豬泄痢效果較好。我國黃瓜藤資源豐富，且目前獸藥中的抗菌藥來自西藥的較多，出現(xiàn)的耐藥案例也多[1]。鑒于此，筆者利用不同工藝提取黃瓜藤，研究其不同提取物對大腸桿菌、福氏痢疾桿菌的抑菌作用，為開發(fā)新的抗菌類獸藥奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株。大腸埃希菌(Escherichiacoli，ATCC35218)又稱大腸桿菌，福氏痢疾桿菌(F′s dysentery bacillus，ATCC29213)，購自武漢大學(xué)中國典型生物培養(yǎng)保藏中心。

1.1.2 培養(yǎng)基。水解酪蛋白(Mueller-Hinton，M-H)，北京奧特星生物技術(shù)責(zé)任有限公司，20090925。M-H肉湯培養(yǎng)基的配制：稱取0.30%牛肉膏、1.75%水解酪蛋白、0.15%可溶性淀粉、0.50%氯化鈉，放入適量蒸餾水中，調(diào)配，加熱溶解，調(diào)pH 7.2～7.4，分裝于試管或生理鹽水瓶內(nèi)，121 ℃高壓蒸汽滅菌20 min，備用。

1.1.3 藥材。黃瓜藤采于鄭州市，經(jīng)黃河科技學(xué)院藥學(xué)教研室王麗副教授鑒定為葫蘆科植物黃瓜(CucumissativusL.)的干燥藤莖。備用。

1.1.4 試劑。0.9%氯化鈉注射液，山東齊都有限公司，批號1102224102；無菌蒸餾水(自制)；甲醇和氯仿，均為分析純，天津化學(xué)一廠。0.5麥?zhǔn)媳葷峁?，?shí)驗(yàn)室配制(取0.5 mL 0.048 mol/L BaCl2和99.5 mL 0.18 mol/L H2SO4置于試管內(nèi)，相當(dāng)于細(xì)菌濃度大致為1.5×108CFU/mL，密封置暗處保存?zhèn)溆?。

1.1.5 儀器。HK-10B 500 g搖擺式粉碎機(jī)(廣州旭朗機(jī)械設(shè)備有限公司)；WB-2002水浴鍋、R-1002N旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀、SHB-ⅢA循環(huán)水式多用真空泵(鄭州長城科工貿(mào)有限公司)；超凈工作臺(上海錦昱科學(xué)儀器有限公司，SW-CJ-LFD型)；隔水式電熱恒溫培養(yǎng)箱(上海躍進(jìn)醫(yī)療器械廠，PYX-DHS-35X40)；LS-30高壓蒸汽滅菌器(上海博訊實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠，YXA-LS-30SⅡ)。

1.2 樣液的提取與制備

1.2.1 藥材樣液的提取。

1.2.1.1 水煎煮法提取液。將干燥的黃瓜藤粉碎成末，可過40目篩，纖維長度不超過1 cm。取黃瓜藤粗粉20 g置于1 000 mL圓底燒瓶中，加300 mL蒸餾水，加熱30 min，放冷抽濾(提取抽濾3次，合并提取液)。濃縮，制成水提取液，濃度為238.24 mg/mL，高壓蒸汽滅菌后存于4 ℃冰箱備用。

1.2.1.2 醇提取法提取樣液。將黃瓜藤粗粉20 g裝于1 000 mL圓底燒瓶中，加入300 mL甲醇，在水浴中加熱60 ℃回流提取1 h。放冷抽濾，得到提取液。縮液后置于燒杯中，加入適量的氯仿，用玻璃棒攪拌，靜置分層，用梨形漏斗分離，分裝入三角燒瓶中，上液溶于甲醇即為甲醇提取液，下層液為氯仿液，濃度為69.56 mg/mL，高壓蒸汽滅菌后存于4 ℃冰箱備用。

1.2.2 藥材樣液稀釋液的制備。

1.2.2.1 水提取液稀釋液的制備。取6支滅菌試管依次作標(biāo)記，2～6號管中各加800 μL生理鹽水，1號加1 600 μL 樣液，從1號取800 μL加入2號管混勻后，取800 μL 加入3號管混勻，依次如上操作至6號管。1～6號管的稀釋度分別為原液、1∶2、1∶4、1∶8、1∶16、1∶32。

1.2.2.2 甲醇液稀釋液的制備。取6支滅菌試管依次作標(biāo)記，2～6號管中各加入800 μL滅菌生理鹽水，1號加入1 600 μL樣液，從1號取800 μL加入2號管混勻后，取800 μL加入3號管混勻，依次如上操作至6號管。1～6號管的稀釋度分別為原液、1∶2、1∶4、1∶8、1∶16、1∶32。

1.2.3 菌液的制備。

1.2.3.1 菌株接種。把供試菌在瓊脂培養(yǎng)基的斜面或平板上傳代2～3次，使其生長穩(wěn)定，狀態(tài)良好。在超凈工作臺中，用灼燒滅菌過的接種環(huán)取狀態(tài)良好的菌落或菌苔一環(huán)，接種于3～5 mL的MH肉湯培養(yǎng)液中，進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)，置于37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)6～8 h，以待生長至輕微或中等渾濁，分別可制備得到大腸桿菌懸液和福氏痢疾桿菌懸液，取出作為試驗(yàn)菌種[2]。

1.2.3.2 菌液稀釋。將增菌后的菌液，用生理鹽水校正濃度至0.5麥?zhǔn)媳葷針?biāo)準(zhǔn)，此時細(xì)菌濃度約為1.5×108CFU/mL。再用MH肉湯將上述菌懸液進(jìn)行1∶100稀釋后備用，含菌量約為106CFU/mL 。需要注意稀釋液應(yīng)在15 min內(nèi)接種完即加入到肉湯中。放置備用。

1.3 測定方法。

1.3.1 牛津杯法測定黃瓜藤提取物的抑菌活性。將稀釋好的菌液取出100 μL用棉簽均勻涂布在滅菌的平板培養(yǎng)基上，每種細(xì)菌設(shè)3個重復(fù)。將滅菌的平板自然干燥后，取滅菌的3個牛津杯等間距放置在平板培養(yǎng)基上，各加入同種藥液100 μL，另外取同一菌種的平板加入相對應(yīng)的溶劑作為陰性對照[3]。根據(jù)原藥液的不同分為水提取液、甲醇提取液液、氯仿提取液3組。將3組12個平板置于37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)18～20 h后，取出用簽字筆做記號后，使用游標(biāo)卡尺采用十字交叉法測量抑菌圈直徑，取平均值作為結(jié)果進(jìn)行對比研究[4-5]。

根據(jù)以上方法測定水稀釋液和甲醇稀釋液抑菌直徑。

參照《微生物檢驗(yàn)技術(shù)》判定結(jié)果[6]：抑菌圈直徑≥20 mm為高敏，抑菌圈直徑10～19 mm為中敏，抑菌圈直徑<10 mm為鈍敏。

1.3.2 稀釋法藥敏試驗(yàn)測定最低抑菌濃度。取已培養(yǎng)的菌液加無菌肉湯稀釋至含細(xì)菌105CFU/mL。每種細(xì)菌做2組，其中一組為水提取液，另一組為甲醇提取液，共編為4組。每組取13 mm×100 mm滅菌試管8支，編號，于每管中加入無菌肉湯培養(yǎng)基2 mL。取1號管加入滅菌藥液2 mL，混勻后取出2 mL加入2號管，依次類推，直到6號管取出2 mL棄掉。7號管不加藥液做對照，以觀察肉湯培養(yǎng)基是否適合細(xì)菌生長。8號管加入藥液2 mL，混勻后取2 mL棄去，不加細(xì)菌做對照，觀察受試藥液是否受污染。將稀釋好的菌液分別取100 μL加入上述1～7號試管中，以無菌生長的藥物最高稀釋管中的藥液濃度為該藥液的最低抑菌濃度(MIC)。

1.3.3 結(jié)果預(yù)判。肉眼觀察各試管中的混濁情況，若澄清則判定為無細(xì)菌生長，若混濁判定為有細(xì)菌生長。首先檢查試管中的細(xì)菌生長情況，陰性對照孔內(nèi)應(yīng)澄清無細(xì)菌生長，陽性對照孔內(nèi)應(yīng)混濁有細(xì)菌生長。參照陽性對照孔和陰性對照孔來觀察試驗(yàn)孔。藥物最低濃度孔無細(xì)菌生長者，即為測定藥物對待測菌的單測MIC。

2 結(jié)果與分析

2.1 牛津杯法測得的黃瓜藤提取物抑菌效果 由表1可見，黃瓜藤提取物中，水提取液和甲醇提取液對2種細(xì)菌均有抑菌作用。水提取液證明黃瓜藤提取物具有抑菌作用，且有效成分能溶于甲醇中。而氯仿提取液則無抑菌活性，氯仿液與氯仿提取液抑菌圈大小相差不大，因此判斷黃瓜藤氯仿提取液中成分幾乎沒有抑菌作用。

表1 黃瓜藤原液提取物對供試菌的抑菌作用

Table 1 The bacteriostatic effect of cucumber stem extract on tested bacteria

黃瓜藤提取物Extractsofcucumberstem大腸桿菌E．coil抑菌圈直徑Diameterofinhibitionzone∥mm敏感度Sensitivity福氏痢疾桿菌F′sdysenterybacillus抑菌圈直徑Diameterofinhibitionzone∥mm敏感度Sensitivity水提取液Waterextract10±0．22中敏8±0．03鈍敏甲醇提取液Methanolextract10±0．29中敏9±0．36鈍敏氯仿提取液Chloroformextract7±0．52鈍敏7±0．05鈍敏無菌生理鹽水SPSS——甲醇Methanol7±0．07鈍敏7±0．03鈍敏氯仿Chloroform7±0．36鈍敏7±0．27鈍敏

注：“—”表示沒有抑菌圈。

Note：“—” stands for no inhibition zone.

2.2 水提取液、甲醇提取液的最低抑菌濃度 從表2可看出，黃瓜藤水提取液對大腸桿菌及福氏痢疾桿菌的MIC均為 59.56 mg/mL，甲醇提取液對大腸桿菌、福氏痢疾桿菌的MIC分別為8.69、17.39 mg/mL。可見，甲醇提取液對2種細(xì)菌的MIC較水提取液小，表明甲醇提取液對大腸桿菌和福氏痢疾桿菌的抑菌活性優(yōu)于水提取液，抑菌活性較強(qiáng)。水提取液對大腸桿菌和福氏痢疾桿菌的MIC相同，而甲醇提取液對大腸桿菌的MIC小于福氏痢疾桿菌的MIC，表示黃瓜藤提取物有效成分對大腸菌桿的抑菌效果優(yōu)于福氏痢疾桿菌。

表2 黃瓜藤水提取液和甲醇提取液的最低抑菌濃度

Table 2 The MIC of cucumber stem water extract and methanol extract

稀釋度Dilution水提取液Waterextract大腸桿菌E．coil福氏痢疾桿菌F’sdysenterybacillus甲醇提取液Methanolextract大腸桿菌E．coil福氏痢疾桿菌F’sdysenterybacillus1∶1----1∶2-MIC-MIC--MIC1∶4++-MIC+1∶8++++1∶16++++1∶32++++陽性對照Pos?itivecontrol++++陰性對照Neg?ativecontrol----

注：“-”表示無細(xì)菌生長；“+”表示有細(xì)菌生長

Note：“-” stands for no bacteria；“+” stands for bacteria growth.

3 結(jié)論與討論

以測量抑菌圈的直徑來衡量黃瓜藤不同提取物的抑菌活性，結(jié)果證實(shí)黃瓜藤水提取液和甲醇提取液有明顯的抑菌作用，氯仿提取液則無抑菌作用。同時也說明黃瓜藤的主要抑菌活性成分集中在甲醇提取液即氯仿上層液中。通過該試驗(yàn)為進(jìn)一步深入研究黃瓜藤的抑菌活性成分及其抑菌機(jī)理奠定了基礎(chǔ)，為開發(fā)廉價且資源豐富的黃瓜藤抗菌制劑以及獸藥中的中藥抗菌制劑提供科學(xué)依據(jù)。

[1] 張玉果，高林，于云東.家禽疫病發(fā)展規(guī)律與中獸藥防治中的優(yōu)勢[J].獸藥市場指南，2016(1)：39-40.

[2] 鄭錦慶，王小寧，岳杰，等.飛機(jī)草總黃酮體外抑菌活性與體內(nèi)抗大腸埃希菌感染效果[J].廣東海洋大學(xué)學(xué)報(bào)，2015，35(6)：53-57.

[3] 李仲興，王秀華，趙建宏，等.應(yīng)用M-H瓊脂進(jìn)行連翹體外抗菌實(shí)驗(yàn)的效果觀察[J].中國中藥雜志，2000，25(12)：742-745.

[4] 陶虛谷.南蛇藤根皮提取液對金黃色葡萄球菌的抑菌作用研究[D].長沙：湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)，2012.

[5] 聞慶，龐玉新，胡璇，等.艾納香殘?jiān)煌崛〔课惑w外抑菌活性研究[J].廣東藥學(xué)院學(xué)報(bào)，2015，31(6)：713-716.

[6] 郭積燕.微生物檢驗(yàn)技術(shù)[M].北京：人民衛(wèi)生出版社，2008.

Study on the Antibacterial Activity of the Extracts from Cucumber Stem

WANG Li, DUAN Li-juan, XU Hai-ying

(Huanghe S&T College, Zhengzhou, Henan 450006)

[Objective] The aim was to study the antibacterial activity of extracts from cucumber stem by different techniques. [Method] Water decoction and ethanol extraction method were used to extract cucumber stem, filter paper method and MIC was adopted to determine the antibacterial activity toE.coliand F′s dysentery bacillus, the diameter of inhibition zone was calculated by the cross method. [Result]The bacteriostaic diameter of cucumber stem water extract toE.coiland F′s dysentery bacillus was greater than 10 mm, the MIC was 59.56 mg/mL. The MIC of methanol extract toE.coiland F′s dysentery bacillus was 8.69, 17.39 mg/mL, respectively. [Conclusion] The water extracts and methanol parts of cucumber stem had inhibitory effect onE.coliand F′s dysentery bacillus, no antibacterial effect was observed in the chloroform extract ofE.coliand F′s dysentery bacillus.

Cucumber stem; Extracts; Antibacterial activity;Escherichiacoli; F′s dysentery bacillus

王麗(1979- )，女，河南鄧州人，副教授，碩士，從事中藥質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究。

2016-11-09

S 642.2

A

0517-6611(2016)35-0151-03