周 星 高香奇 符欣蕙

海南省藥物研究所，海南 ?？?570311

黎藥經(jīng)驗(yàn)方的致突變?cè)囼?yàn)研究

周 星 高香奇 符欣蕙

海南省藥物研究所，海南 ?？?570311

目的：考察黎藥經(jīng)驗(yàn)方的遺傳毒性。方法：致突變?cè)囼?yàn)采用鼠傷寒沙門菌回復(fù)突變?cè)囼?yàn)( Ames 試驗(yàn))、小鼠骨髓嗜多染紅細(xì)胞微核試驗(yàn)和小鼠精子畸型試驗(yàn)等三項(xiàng)試驗(yàn)。Ames 試驗(yàn)：設(shè)受試物5個(gè)劑量組(即5.000、1.000、0.200、0.040、0.008mg/皿)，另設(shè)未處理對(duì)照組、溶劑對(duì)照組和陽(yáng)性對(duì)照組; 微核試驗(yàn)：小鼠50只，雌雄各半，設(shè)10、5.0、2.5 g/kg·bw 劑量組，另設(shè)溶劑對(duì)照和陽(yáng)性對(duì)照組; 精子畸型率試驗(yàn)：昆明種小鼠雄性25只，分組同微核實(shí)驗(yàn)，檢測(cè)精子畸形率。結(jié)果：Ames 試驗(yàn)中，加或不加 S9 的情況下，受試物對(duì)TA97、TA98、TA100和TA102菌株均未顯示致突變作用。與溶劑對(duì)照組比較，高、中、低3個(gè)劑量的受試物組雄性、雌性小鼠微核試驗(yàn)、小鼠精子畸變率差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。結(jié)論：綜合考慮前期試驗(yàn)結(jié)果及相關(guān)研究，在本次實(shí)驗(yàn)條件下，在一定劑量范圍內(nèi)，Ames 試驗(yàn)、 微核試驗(yàn)和小鼠精子畸變?cè)囼?yàn)結(jié)果顯示陰性，認(rèn)為該黎藥經(jīng)驗(yàn)方具有遺傳毒性的可能性較小。

驗(yàn)方；黎族；致突變；遺傳毒性

本黎藥驗(yàn)方中所含的主要有雞血藤、補(bǔ)血藤、七葉蓮、牛大力等藥材。該方為黎族民間的經(jīng)驗(yàn)方，在黎醫(yī)指導(dǎo)下，用于調(diào)節(jié)婦女產(chǎn)后身體狀態(tài)并可促使其恢復(fù)體力。通過(guò)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)該方能顯著延緩小鼠游泳至力竭的時(shí)間，發(fā)現(xiàn)其具有較強(qiáng)的延緩疲勞的作用，能有效提高運(yùn)動(dòng)耐力，具有抗疲勞功效[1]。其中主要藥材雞血藤、牛大力等在南方民間食療療中具有歷史悠久。對(duì)牛大力的本草考證上發(fā)現(xiàn)其始載于《生草藥性備要》，是《廣西中藥材標(biāo)準(zhǔn)》(1990年版)收載的地方藥材[2]，補(bǔ)腰腎、強(qiáng)筋骨功效顯著[3]。雞血藤是一味活血化瘀中藥，能補(bǔ)血、活血、通絡(luò)；主治月經(jīng)不調(diào)、血虛萎黃、麻木癱瘓等[4]，藥理實(shí)驗(yàn)研究表明有顯著的補(bǔ)血作用[5]。近年來(lái)，黎族驗(yàn)方中常見藥材雞蛋花通過(guò)高內(nèi)涵體外微核實(shí)驗(yàn)和Ames實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)還具有較強(qiáng)的抗突變活性[6]。但民族藥物來(lái)源復(fù)雜，部分藥材還未收入地方藥材標(biāo)準(zhǔn)，故對(duì)其開展相關(guān)毒理學(xué)研究具有重要意義。本研究按黎醫(yī)采用傳統(tǒng)煎煮工藝得到的湯劑作為受試物，以小鼠為實(shí)驗(yàn)動(dòng)物觀察該藥的致突變作用，旨在為黎族驗(yàn)方的使用安全性評(píng)價(jià)提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 受試物和試驗(yàn)菌株 黎藥驗(yàn)方受試物(以下簡(jiǎn)稱“受試物”，藥材由五指山黎族民間醫(yī)藥研究協(xié)會(huì)提供，按其提供方法得水煎液并濃縮到一定濃度)；Ames試驗(yàn)用鼠傷寒沙門菌組氨酸缺陷型TA97、TA98、TA100、TA102菌株(海南省藥物研究所保存)。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 無(wú)特定病原體(SPF)級(jí)KM小鼠50只(25～30g，雌、雄各半)、性成熟雄性KM小鼠25只(30～35g)[海南省藥物研究所提供，生產(chǎn)許可證號(hào):SCXK(瓊)2015-0007]。動(dòng)物于屏障系統(tǒng)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)室飼養(yǎng)[使用許可證號(hào)SYXK(瓊)2014-0025]，溫度為(24.0±1.5)℃，濕度為(60±10)%，工作照度為200l～300lx，人工照明、黑夜12h交替，噪音<60dB，檢疫3d后進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。飼養(yǎng)環(huán)境和飼料標(biāo)準(zhǔn)均遵循國(guó)家相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)[7-8]。

1.2 方法

1.2.1 鼠傷寒沙門氏菌回復(fù)突變?cè)囼?yàn)(Ames試驗(yàn)) 采用平板滲入法對(duì)樣品進(jìn)行測(cè)試，分別在加與不加大鼠肝S9系統(tǒng)的條件下進(jìn)行試驗(yàn)。鼠傷寒沙門菌突變菌株TA97、TA98、TA100和TA102經(jīng)鑒定符合要求。設(shè)5個(gè)劑量:5.000、1.000、0.200、0.040、0.008mg/皿，使用蒸餾水稀釋。同時(shí)設(shè)未處理對(duì)照組、溶劑對(duì)照和陽(yáng)性對(duì)照組。在頂層培養(yǎng)基中加入0.1mL試驗(yàn)菌株增菌液、0.1mL試驗(yàn)用受試物溶液和0.5mL肝臟混合功能氧化酶(S9混合液)，混勻后倒入底層培養(yǎng)基平板上，每個(gè)劑量6個(gè)平皿；(37±1)℃培養(yǎng)48h，計(jì)數(shù)每皿回變菌落數(shù)[9]。

1.2.2 小鼠骨髓細(xì)胞微核試驗(yàn) 體重25～30gKM小鼠50只，隨機(jī)分為5個(gè)組，每組10只，雌雄各半，以受試物對(duì)小鼠的急性經(jīng)口毒性試驗(yàn)最大給藥量結(jié)果(10g/kg，以流浸膏計(jì))為依據(jù)，試驗(yàn)設(shè)受試物3個(gè)劑量組(即10、5.0、2.5g/kg·bw)、陽(yáng)性對(duì)照組(灌胃40mg/kg環(huán)磷酰胺)、溶劑對(duì)照組(滅菌水)，間隔24h，2次灌胃，給藥體積為0.2mL/10g，末次給予受試物6h后，取胸骨骨髓制片，每只動(dòng)物觀察1000個(gè)嗜多染紅細(xì)胞(PCE)，計(jì)數(shù)含帶微核的細(xì)胞數(shù)，計(jì)算微核率(‰)。同時(shí)計(jì)數(shù)200個(gè)細(xì)胞中嗜多染紅細(xì)胞和正染紅細(xì)胞(NCE)比例[10]。

1.2.3 小鼠精子畸形試驗(yàn) 體重30～35g雄性KM小鼠25只，隨機(jī)分為5個(gè)組，每組5只，分別為受試物3個(gè)劑量組(即10、5.0、2.5g/kg·bw)、陽(yáng)性對(duì)照組(灌胃40mg/kg環(huán)磷酰胺)、溶劑對(duì)照組(蒸餾水)，每日灌胃1次，連續(xù)5d，末次灌胃30d后處死小鼠，取附睪制片，每只動(dòng)物觀察計(jì)數(shù)1000個(gè)結(jié)構(gòu)完整的精子，計(jì)數(shù)畸形精子數(shù)，計(jì)算精子畸形率(%)[11]。

2 結(jié)果

2.1 受試物致突變作用 各菌株不同陽(yáng)性對(duì)照回復(fù)突變菌落數(shù)均遠(yuǎn)超溶劑對(duì)照和未處理對(duì)照突變菌落數(shù)，表明試驗(yàn)體系可靠。在檢測(cè)劑量范圍內(nèi)，加或者不加S9的情況下，受試物對(duì)4個(gè)菌株均未顯示誘變作用。見表1。

表1 Ames試驗(yàn)結(jié)果 ，個(gè))

注：1:2-氨基芴0.010mg/皿;2:1,8-二羥蒽醌0.050mg/皿;3:敵克松0.050mg/皿;4:疊氮鈉0.0015mg/皿;+S9:加肝臟混合功能氧化酶;-S9:不加肝臟混合功能氧化酶。

2.2 受試物對(duì)小鼠骨髓PCE微核率影響 與溶劑對(duì)照組比較，各劑量受試物組小鼠骨髓PCE微核細(xì)胞率差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；與溶劑對(duì)照組比較，陽(yáng)性對(duì)照組小鼠骨髓PCE微核細(xì)胞率明顯升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；各組小鼠PCE/NCE比值差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見表2。

表2 小鼠骨髓微核試驗(yàn)結(jié)果 ±s)

注：與溶劑對(duì)照組比較，*P<0.05。

2.3 受試物對(duì)小鼠精子畸形率影響 溶劑對(duì)照組、受試物3個(gè)劑量組(即10、5、2.5g/kg)、陽(yáng)性對(duì)照組小鼠精子畸形率分別為(0.95±0.35)%、(1.02±0.38)%、(1.19±0.27)%、(1.11±0.48)%、(2.96±0.97)%；與溶劑對(duì)照組比較，陽(yáng)性對(duì)照組小鼠精子畸形率明顯升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，受試物各劑量組小鼠精子畸型率比較差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

3 討論

Ames試驗(yàn)、小鼠精子畸形試驗(yàn)和小鼠骨髓微核試驗(yàn)作為遺傳毒性檢測(cè)試驗(yàn)常用經(jīng)典組合。Ames試驗(yàn)檢測(cè)終點(diǎn)為基因突變，是由美國(guó)生化學(xué)家BruceN.Ames在1975年建立的鼠傷寒沙門菌回復(fù)突變?cè)囼?yàn)，是一種已被公認(rèn)并廣泛開展的致突變鑒定方法。此方法能夠在短期內(nèi)檢測(cè)藥物、食品、化學(xué)品、醫(yī)療器械等受試物有無(wú)致突變性。小鼠精子畸形試驗(yàn)檢查受試物能否對(duì)破壞哺乳動(dòng)物精子正常形態(tài)。體內(nèi)微核試驗(yàn)?zāi)軌驒z測(cè)斷裂劑和部分非整倍體誘變劑。

有些中草藥具有延緩并消除疲勞、改善激素分泌、提高免疫能力等多種作用，又與運(yùn)動(dòng)關(guān)系密切。所以，開發(fā)中草藥運(yùn)動(dòng)補(bǔ)劑對(duì)提高運(yùn)動(dòng)能力、對(duì)改善人體功能有重要意義。前期已有研究表明該黎族驗(yàn)方具有抗疲勞作用的效果，且該方在海南黎族地區(qū)應(yīng)用較多，故進(jìn)行遺傳毒性的相關(guān)考察具有重要意義。

研究結(jié)果表明，與溶劑對(duì)照組比較，受試物各劑量組小鼠骨髓微核細(xì)胞率和精子畸型率均無(wú)明顯變化，提示其對(duì)小鼠體細(xì)胞和生殖細(xì)胞均無(wú)誘變作用。Ames試驗(yàn)結(jié)果顯示，受試物各劑量組受試菌株(TA97、TA98、TA100、TA102)在加S9與不加S9時(shí)回變菌落數(shù)均未超過(guò)未處理對(duì)照菌落數(shù)的2倍，提示該受試物無(wú)間接和直接的致突變作用。

綜上所述，在一定劑量范圍內(nèi)，該黎藥驗(yàn)方無(wú)致突變和致畸作用。感謝五指山黎族民間醫(yī)藥研究協(xié)會(huì)及楊麗娜女士提供該黎族驗(yàn)方?？紤]到本研究所用動(dòng)物種類局限性，還應(yīng)擴(kuò)大實(shí)驗(yàn)動(dòng)物種屬，增加其他實(shí)驗(yàn)項(xiàng)目進(jìn)一步探討其遺傳毒性，以確保人體服用的安全性。

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(編輯：陶希睿)

Research on mutagenesis caused by proved recipe of the Li

ZHOU Xing GAO Xiangqi FU Xinhui

Phamarceutical institute of Hainan,Haikou 570311, China

Objective To study the mutagenesis caused by sproved recipe of the Li．Methods Ames test Test substance groups of 5.000 mg /dish，1.000，0.200，0.040 mg /dish and 0.008 mg /dish and three control groups(untreated，solvent and positive control) to detect the rechanged bacterium colonies．Micronucleus test 50 samples of the Kunming mice were randomly divided into positive control group，solvent control group and group of test substance 10.0g/kg，5.0g/kg，and 2.5g/kg.There were 10 in each group(male and female in half)．The micronucleus rate of bone marrow polychromatic erythrocyte were detected; Sperm malformation rate test 25 samples of the Kunming male mice, designed the groups as micronucleus test, were testing the rate of sperm abnormality．Results Comparing with control group，bone marrow cell micronucleus rate and sperm malformation rate of high，middle and low test substance groups of mice，what had no statistical significance(P>0.05). Compared with the untreated group，different doses of test substance Ames strains from the back variables did not change significantly (P>0.05). Conclusion Considering the preliminary test results and related research, under the conditions of this experiment and in the definite dose range，the three test results above show negative results. There is little possibility that test substance of proved recipe from the Li has mutagenesis.

Proved Recipe;The Li;Mutagenesis; Genetic Toxicity

2016-10-14

周星(1981-)，男，助理研究員，主要從事藥學(xué)研究。E-mail: zhouxing54@tom.com

R29

A

1007-8517(2016)24-0043-03