唐恩躍，何增品，崔曉花，楊永平，熊秋霞△

(1.云南省保山市人民醫(yī)院檢驗(yàn)科 678000；2.昆明醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院檢驗(yàn)科，昆明 650032)

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·論 著·

基于CLSI EP12-A2文件要求的乙型肝炎五項(xiàng)定性檢測性能驗(yàn)證

唐恩躍1，何增品2，崔曉花2，楊永平2，熊秋霞2△

(1.云南省保山市人民醫(yī)院檢驗(yàn)科 678000；2.昆明醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院檢驗(yàn)科，昆明 650032)

目的 對昆明醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院檢驗(yàn)科免疫室酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)定性項(xiàng)目乙型肝炎(乙肝)五項(xiàng)進(jìn)行性能驗(yàn)證。方法 采用ELISA，通過稀釋乙肝五項(xiàng)各項(xiàng)目強(qiáng)陽性標(biāo)本得到臨界值濃度(C50)并驗(yàn)證其是否正確；采用各個(gè)項(xiàng)目C50 -20%～+20%濃度范圍的重復(fù)性實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證其結(jié)果是否包含C5～C95區(qū)間；用C50 +20%濃度驗(yàn)證檢測限；常規(guī)手工操作試驗(yàn)和TECAN全自動酶免檢測兩種方法檢測10例陽性和10例陰性標(biāo)本，對其結(jié)果進(jìn)行方法學(xué)比較及分析。結(jié)果 5個(gè)項(xiàng)目C50驗(yàn)證正確；C50 -20%～+20%濃度范圍包含了C5～C95區(qū)間；檢測限驗(yàn)證通過；5個(gè)項(xiàng)目兩種方法檢測結(jié)果一致性檢驗(yàn)Kappa系數(shù)均為1。結(jié)論 本實(shí)驗(yàn)室乙肝五項(xiàng)定性檢測使用方法及試劑盒相關(guān)性能均驗(yàn)證合格,常規(guī)手工操作試驗(yàn)方法和TECAN全自動酶免檢測方法兩種方法學(xué)比較結(jié)果一致性較好。

乙肝五項(xiàng)定性檢測； 性能驗(yàn)證； 酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)

近年來，各大醫(yī)院實(shí)驗(yàn)室將通過ISO15189實(shí)驗(yàn)室質(zhì)量和能力的認(rèn)可納入到了實(shí)驗(yàn)室的發(fā)展規(guī)劃中。在質(zhì)量體系的構(gòu)建中，對試驗(yàn)方法進(jìn)行方法學(xué)性能驗(yàn)證是實(shí)驗(yàn)室技術(shù)要求中非常重要的一環(huán)，在2013年4月實(shí)施的ISO15189補(bǔ)充文件CNAS-CL39實(shí)驗(yàn)室質(zhì)量和能力的認(rèn)可準(zhǔn)則在免疫學(xué)檢驗(yàn)領(lǐng)域的應(yīng)用中，對免疫學(xué)定性檢驗(yàn)方法的性能驗(yàn)證內(nèi)容提出了具體的要求[1]。定性項(xiàng)目的性能評價(jià)包括重復(fù)性評價(jià)(分析物濃度接近臨界點(diǎn)時(shí)的重復(fù)性實(shí)驗(yàn)、批內(nèi)重復(fù)性、批間重復(fù)性)、方法學(xué)比較(包括未知臨床診斷的方法學(xué)比較和已知臨床診斷的方法學(xué)比較)、檢測限驗(yàn)證、特異性驗(yàn)證等。其中最主要的是分析物濃度接近臨界點(diǎn)時(shí)的重復(fù)性實(shí)驗(yàn)和方法學(xué)比較兩項(xiàng)評價(jià)。美國臨床和實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)化協(xié)會(CLSI)頒布的EP12-A2文件《定性項(xiàng)目的性能評價(jià)》提出定性檢測重復(fù)性須驗(yàn)證3個(gè)濃度值的臨床標(biāo)本，即C50(臨界點(diǎn))、C5(低于C50濃度20%)和C95(高于C50濃度20%)。(1)C50:最佳條件下，處于和接近臨界值的分析物濃度，多次重復(fù)檢測此濃度的單一標(biāo)本時(shí)，將獲得50%的陽性結(jié)果和50%的陰性結(jié)果；(2)C5：檢測濃度為C5的分析物時(shí)，將產(chǎn)生5%的陽性結(jié)果，用濃度C95的標(biāo)本進(jìn)行重復(fù)性檢測時(shí)，將持續(xù)得到陽性結(jié)果[2]。昆明醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院檢驗(yàn)科免疫室參照EP12-A2文件對乙型肝炎(乙肝)五項(xiàng)進(jìn)行分析物接近臨界點(diǎn)時(shí)的重復(fù)性實(shí)驗(yàn)和方法學(xué)比較兩項(xiàng)性能評價(jià)，同時(shí)驗(yàn)證檢測限。

1 材料與方法

1.1 標(biāo)本選擇

1.1.1 質(zhì)控品 陰性血清(自配)和標(biāo)準(zhǔn)血清質(zhì)控品:HBsAg臨界質(zhì)控品0.2 IU/mL(201504002),乙肝表面抗原(HBsAg)0.5 IU/mL(201404002)，乙肝表面抗體(HBsAb) 10 mIU/mL(201411002)，乙肝e抗原(HBeAg) 1 NCU/mL(201404002)，乙肝e抗體(HBeAb) 1 NCU/mL(20148001)，乙肝核心抗體(HBcAb)2 IU/mL(201409002)均產(chǎn)自康徹斯坦公司。

1.1.2 分析物接近臨界點(diǎn)時(shí)的重復(fù)性實(shí)驗(yàn)

1.1.2.1 定性檢測重復(fù)性須驗(yàn)證3個(gè)濃度值的臨床標(biāo)本，即C50(臨界點(diǎn))、C5(C50-20%)和C95(C50+20%)。

1.1.2.2 如何獲得系統(tǒng)或試劑的臨界點(diǎn)(C50)：檢測試劑或系統(tǒng)說明書可能會注明分析物的臨界濃度。如果臨界濃度未知，可將陽性標(biāo)本進(jìn)行梯度稀釋，然后對他們進(jìn)行重復(fù)檢測以確定能夠獲得50%陽性和50%陰性結(jié)果的對應(yīng)稀釋度，這一對應(yīng)稀釋度的分析物濃度即為臨界點(diǎn)(C50)。

1.1.3 方法學(xué)比較 收集常規(guī)檢測標(biāo)本20例，其中陽性標(biāo)本7例，弱陽性標(biāo)本3例，陰性標(biāo)本10例。

1.2 試劑與試劑 HBsAg檢測試劑(批號201503081)、HBsAb檢測試劑(批號201506081)、HBeAg檢測試劑(批號201502021)、HBeAb檢測試劑(批號201412411)、HBcAb檢測試劑(批號201506081)均產(chǎn)自上?？迫A。儀器為瑞士Tecan公司生產(chǎn)的Tecan Freedom Evolyzer-2全自動酶免一體機(jī)、Thermo Multiskan MK3酶標(biāo)儀；深圳匯松公司生產(chǎn)的PW-960全自動酶標(biāo)洗板機(jī)，儀器均按ISO15189質(zhì)量體系技術(shù)要求校準(zhǔn)。

1.3 方法

1.3.1 室內(nèi)質(zhì)控 如性能驗(yàn)證在10 d內(nèi)完成，每次試驗(yàn)質(zhì)控品重復(fù)檢測2次，共提供20次重復(fù)檢測結(jié)果；如果性能驗(yàn)證超過20 d，則每一批次都要對每份質(zhì)控品進(jìn)行單次檢測，總計(jì)提供20次重復(fù)結(jié)果。

1.3.2 分析物接近臨界點(diǎn)時(shí)的重復(fù)性實(shí)驗(yàn) 將每個(gè)項(xiàng)目S/CO值在3左右的陽性標(biāo)本用0.9%的生理鹽水進(jìn)行倍比稀釋，將各稀釋度進(jìn)行40次重復(fù)檢測(每個(gè)項(xiàng)目C50濃度OD值接近CUT OFF值)，重復(fù)檢測每個(gè)項(xiàng)目的C50-20%、C50+20%濃度標(biāo)本各40次，確定每一濃度標(biāo)本結(jié)果陽性和陰性的百分比。實(shí)驗(yàn)操作和結(jié)果判斷嚴(yán)格按照說明書進(jìn)行。

1.3.3 檢測限驗(yàn)證 用C95濃度的標(biāo)本，重復(fù)檢測40次。

1.3.4 方法學(xué)比較 設(shè)定手工操作、MK3比色為評價(jià)方法，TECAN全自動酶免檢測方法為靶方法，驗(yàn)證其符合率，分別用常規(guī)手工操作試驗(yàn)方法和TECAN全自動酶免一體機(jī)同時(shí)檢測20例標(biāo)本，分布于10 d內(nèi)，按常規(guī)方法檢測。

1.4 判斷標(biāo)準(zhǔn)

1.4.1 室內(nèi)質(zhì)控 不合格批次在10 d內(nèi)不應(yīng)超過1次或20 d內(nèi)不超過兩次，如若超出，立即停止檢測工作并咨詢試劑制造商以確定原因并采取糾正措施。

1.4.2 分析物接近臨界點(diǎn)時(shí)的重復(fù)性實(shí)驗(yàn) 判斷標(biāo)準(zhǔn)見表1，若C50驗(yàn)證合格,則說明C50估計(jì)正確,若C50-20%、C50+20%驗(yàn)證合格，則說明(C50-20%)～(C50+20%)濃度包含了C5～C95的區(qū)間。

表1 分析物接近臨界點(diǎn)時(shí)的重復(fù)性實(shí)驗(yàn)判斷標(biāo)準(zhǔn)

1.4.3 檢測限驗(yàn)證 C95濃度的標(biāo)本重復(fù)檢測40次陽性結(jié)果≥36/40則驗(yàn)證通過。

1.4.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 計(jì)算Kappa系數(shù)評價(jià)其一致性，Kappa系數(shù)大于等于0.75，說明兩種方法一致性較好，Kappa系數(shù)在0.40～0.75則兩種方法一致性一般，Kappa系數(shù)小于0.40兩種一致性較差。計(jì)算公式為Kappa系數(shù)=(Po-Pe)/(1-Pe)，其中Po是實(shí)際一致比，Pe是期望一致比。

2 結(jié) 果

2.1 分析物濃度接近臨界點(diǎn)的重復(fù)性驗(yàn)證 對各項(xiàng)目C50、C5、C95濃度各進(jìn)行40次測試，5個(gè)項(xiàng)目均驗(yàn)證通過，說明5個(gè)項(xiàng)目C50-20%～C50+20%的濃度包含了C5～C95的區(qū)間。見表2。

表2 分析物濃度接近臨界點(diǎn)的重復(fù)性驗(yàn)證結(jié)果[n/n(%)]

2.2 檢測限驗(yàn)證 5個(gè)項(xiàng)目在C95濃度時(shí)均驗(yàn)證通過。見表3。

表3 檢測限驗(yàn)證結(jié)果[n/n(%)]

2.3 方法學(xué)比較 5個(gè)項(xiàng)目20例標(biāo)本用常規(guī)手工操作試驗(yàn)方法和TECAN全自動酶免一體機(jī)檢測陽性符合率和陰性符合率全部為100.0%，5個(gè)項(xiàng)目Kappa系數(shù)全部為1，表明5個(gè)項(xiàng)目常規(guī)手工操作試驗(yàn)方法和TECAN全自動酶免一體機(jī)檢測結(jié)果一致性較好。

3 討 論

ISO15189：2007準(zhǔn)則作為指導(dǎo)實(shí)驗(yàn)室建立質(zhì)量體系的綱領(lǐng)性文件，其第5.5.2條款指出實(shí)驗(yàn)室應(yīng)評估所選用方法和程序，在用于醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)之前應(yīng)證實(shí)其可給出滿意結(jié)果[2]。對定性實(shí)驗(yàn)而言，臨界值是唯一的醫(yī)學(xué)決定水平，它的高低直接關(guān)系試驗(yàn)的成敗[3]。用濃度接近臨界值的標(biāo)本作為評價(jià)材料比用強(qiáng)陽性或低陰性標(biāo)本更能發(fā)現(xiàn)檢測誤差[4]。根據(jù)EP12-A2文件《定性項(xiàng)目的性能評價(jià)》要求，乙肝五項(xiàng)須進(jìn)行分析物接近臨界點(diǎn)時(shí)的重復(fù)性實(shí)驗(yàn)和方法學(xué)比較兩項(xiàng)性能評價(jià)，其他的可以選做，不作強(qiáng)制要求。

由于最佳條件不易獲得，實(shí)驗(yàn)室準(zhǔn)確估計(jì)C50比較困難，昆明醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院檢驗(yàn)科免疫室按照EP12-A2文件要求，乙肝五項(xiàng)各個(gè)項(xiàng)目的C50通過稀釋各個(gè)項(xiàng)目的強(qiáng)陽性標(biāo)本得來，5個(gè)項(xiàng)目的C50驗(yàn)證結(jié)果在47.5%～60.0%，全部驗(yàn)證正確。在確定了C50后，對5個(gè)項(xiàng)目C50+20%的濃度各進(jìn)行40次檢測，陽性率均在95.0%及以上；對5個(gè)項(xiàng)目C50-20%的濃度各進(jìn)行40次檢測，陰性率都在95.0%及以上，驗(yàn)證通過，說明5個(gè)項(xiàng)目的(C50-20%)～(C50+20%)濃度包含了C5～C95的區(qū)間。C5～C95區(qū)間的寬度暗示了定性試驗(yàn)的精密度,因?yàn)槠浞从沉酥貜?fù)性檢測結(jié)果不一致的濃度范圍,C5～C95的區(qū)間越窄,代表方法越好[4]。同時(shí)，5個(gè)項(xiàng)目在C95驗(yàn)證通過的情況下也說明5個(gè)項(xiàng)目檢測限也驗(yàn)證通過。

當(dāng)實(shí)驗(yàn)室同時(shí)使用2套以上的檢測系統(tǒng)檢測同一項(xiàng)目時(shí)，必須保證兩者檢測結(jié)果的一致性[5]。本室對各項(xiàng)目的10例陽性標(biāo)本和10例陰性標(biāo)本用常規(guī)手工操作試驗(yàn)方法和TECAN全自動酶免一體機(jī)檢測來驗(yàn)證兩個(gè)方法的一致性，各個(gè)項(xiàng)目的陽性符合率和陰性符合率均為100.0%，通過計(jì)算Kappa系數(shù)來評價(jià)其一致性，5個(gè)項(xiàng)目兩種方法檢測一致性較好。

本實(shí)驗(yàn)室乙肝五項(xiàng)定性檢測使用方法及試劑盒相關(guān)性能均驗(yàn)證合格,常規(guī)手工操作試驗(yàn)方法和TECAN全自動酶免檢測兩種方法學(xué)比較結(jié)果一致性較好。

[1]中國合格評定國家認(rèn)可委員會．醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)室質(zhì)量和能力認(rèn)可準(zhǔn)則在臨床免疫學(xué)檢驗(yàn)領(lǐng)域的應(yīng)用說明[S]．北京：中國合格評定國家認(rèn)可委員會，2012．

[2]ClincalandLaboratoryStandardsInstitute.EP12-A2Userprotocolforevalutionofqualitativetestperformance；approvedguideline[S].PA,USA:CLSI,2009.

[3]中國合格評定國家認(rèn)可委員會．ISO15189：2007醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)室質(zhì)量和能力的專用要求[S]．北京：中國合格評定國家認(rèn)可委員會，2008．

[4]周輝，張治國，杜春英，等．Bact/Alert3D系統(tǒng)與常用檢測方法的比較[J]．臨床肺科雜志，2009，14(7)：902-903．

[5]黃嫵姣，黃憲章，莊俊華，等．CLSIEP12-A2文件在HBeAb定性檢測性能評價(jià)中的應(yīng)用[J]．檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)，2012，27(11)：900-903．

Performance validation of 5- item qualitative detection of hepatitis B based on requirements of EP12-A2 CLSI file

TANGEnyue1，HEZengpin2，CUIXiaohua2，YANGYongping2，XIONGQiuxia2△

(1.DepartmentofClinicalLaboratory，BaoshanMunicipalPeople′sHospital,Baoshan，Yunnan678000,China;2.DepartmentofClinicalLaboratory,FirstAffiliatedHospitalofKunmingMedicalUniversity,Kunming,Yunnan650032,China)

Objective To perform the performance verification of 5-item qualitative detection of enzyme linked immunosorbent assay(ELISA) in the immunology room of laboratory department of the First Affiliated Hospital of Kunming Medical University.Methods The ELISA method was adopted.The strong positive samples of hepatitis B 5 items were diluted to the critical value concentration (C50) and its correction was verified;the repeated experiments with the C50 -20%-+20% concentration range for the various items were adopted to verify whether the results including the C5-C95 interval;the detection limit was verified by using the C50 +20% concentration;10 positive and 10 negative specimens were detected by the conventional manual operating test and TECAN fully automatic enzyme immunoassay detection,then the obtained results were performed the methodological comparison and analysis.Results The 5-item C50 verification was correct;the C50 -20%-+20% concentration range included the C5-C95 interval;the verification of detection limit was passed;the Kappa coefficient of 5-item consistency test in the results detected by two methods was 1.Conclusion The application method of hepatitis B 5-item qualitative detection and related performance of reagent kit all are qualified by verification.The methodological comparison results of the routine manual operation test and TECAN fully automatic enzyme immunoassay display good consistency.

five qualitative detection of hepatitis B; performance verification; enzyme linked immunosorbent assay

唐恩躍，男，主管技師，主要從事生化檢驗(yàn)研究?！?/p>

，E-mail:asan_1123@163.com。

10.3969/j.issn.1673-4130.2016.24.022

A

1673-4130(2016)24-3443-03

2016-09-04

2016-10-23)