張濟培，韋慶蘭,2，譚華龍，陳 岡，陳建紅*

(1.佛山科學技術(shù)學院生命科學學院，廣東佛山 528231；2.華南農(nóng)業(yè)大學獸醫(yī)學院，廣東廣州 510642)

廣東水禽源大腸埃希菌耐藥性及氨基糖苷類耐藥基因研究

張濟培1，韋慶蘭1,2，譚華龍1，陳 岡1，陳建紅1*

(1.佛山科學技術(shù)學院生命科學學院，廣東佛山 528231；2.華南農(nóng)業(yè)大學獸醫(yī)學院，廣東廣州 510642)

為了調(diào)查廣東地區(qū)水禽源大腸埃希菌對氨基糖苷類藥物耐藥現(xiàn)狀和耐藥基因的流行情況，探索大腸埃希菌的氨基糖苷類耐藥基因型與耐藥表型之間的關(guān)系，本研究采用瓊脂梯度稀釋法測定251株廣東地區(qū)水禽源大腸埃希菌對氨基糖苷類藥物的耐藥性和采用PCR方法檢測耐藥基因。藥敏試驗結(jié)果顯示，大腸埃希菌對鏈霉素耐藥較嚴重，鴨源和鵝源的耐藥率分別為81.58%和75.43%，對慶大霉素和卡那霉素較敏感，耐藥率分別為25%和54.86%，對阿米卡星最為敏感，其中鴨源的菌株耐藥率僅為1.32%。PCR方法檢測顯示，aadA1和aph(3′)-1檢出率較高，為84.6%和91.9%，表明攜帶aadA1和aph(3′)-1耐藥基因的水禽源大腸埃希菌在廣東地區(qū)呈流行趨勢。耐藥基因型與耐藥表型相關(guān)性分析結(jié)果顯示，耐藥基因rmtB的攜帶與4種藥物(慶大霉素、阿米卡星、卡那霉素和壯觀霉素)耐藥株的產(chǎn)生具有顯著相關(guān)性，表明耐藥基因rmtB對大腸埃希菌耐藥株的產(chǎn)生起重要的作用。本試驗結(jié)果可為指導廣東地區(qū)水禽大腸埃希菌病的臨床用藥提供理論基礎(chǔ)和研究大腸埃希菌的耐藥基因提供相關(guān)的數(shù)據(jù)。

水禽大腸埃希菌；氨基糖苷類藥物；耐藥基因型；耐藥表型

自從1944年Waksman從鏈霉菌中發(fā)現(xiàn)鏈霉素以來，氨基糖苷類藥物以及衍生物陸續(xù)被廣泛應(yīng)用于臨床上，但耐藥性已成為不可忽視的問題。大腸埃希菌對氨基糖苷類藥物的耐藥性以產(chǎn)生鈍化酶為主。通過N-乙酰轉(zhuǎn)移酶，O-核苷酸轉(zhuǎn)移酶和O-磷酸轉(zhuǎn)移酶等鈍化酶(其基因包括aadA1和aph(3′)-1)對氨基糖苷類藥物關(guān)鍵位點的化學修飾，阻斷了藥物與細菌16 S rRNA結(jié)合[1]。因為這些酶存在廣泛的特異性底物，可以催化不只一個反應(yīng)，所以此機制作用廣泛且在臨床上尤為重要[2]。近年來研究發(fā)現(xiàn)了一種新的耐藥機制，通過16 S rRNA甲基化修飾靶位，而16 S rRNA 甲基化酶(其基因包括rmtB)在2003年首次被報道，該酶能夠引起革蘭陰性桿菌對氨基糖苷類藥物的高水平耐藥[3]。氨基糖苷類鈍化酶和16S rRNA甲基化酶由質(zhì)粒編碼并與轉(zhuǎn)座子相連，質(zhì)粒交換和轉(zhuǎn)座子傳遞加速了耐藥基因在不同細菌間的傳播，導致了嚴重復雜的耐藥現(xiàn)象[4]。因此本文通過對廣東地區(qū)水禽源大腸埃希菌的耐藥性和耐藥基因(rmtB、aadA1和aph(3′)-1)進行檢測，以此為研究水禽源大腸埃希菌耐藥情況和耐藥表型的流行情況提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株來源 251株水禽源大腸埃希菌分離自廣東省不同地區(qū)水禽養(yǎng)殖場，鵝源175株，鴨源76株，由佛山科學技術(shù)學院生命科學學院獸醫(yī)學科中心實驗室保存；大腸埃希菌ATCC25922質(zhì)控菌購自中國藥品生物制品檢定所。

1.1.2 主要藥品與試劑 慶大霉素、阿米卡星、卡那霉素、鏈霉素和壯觀霉素為上海源葉生物科技有限公司產(chǎn)品；MH瓊脂培養(yǎng)基和LB瓊脂培養(yǎng)基為廣東環(huán)凱生物技術(shù)有限公司產(chǎn)品；Premix rTaq、pMD18 T-Vector、Marker DL 2 000和感受態(tài)細胞為TaKaRa公司產(chǎn)品；SanPrep 柱式DNA膠回收試劑盒SanPrep 柱式DNA膠回收試劑盒為上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)股份有限公司產(chǎn)品。

1.1.3 引物 使用Oligo7軟件設(shè)計引物，并由英濰捷基生物有限公司合成，引物序列、片段長度和PCR退火溫度見表1。

1.2 方法

1.2.1 藥物敏感性試驗 根據(jù)CLSI推薦的瓊脂梯度稀釋法進行藥物敏感性試驗，根據(jù)CLSI標準進行藥物敏感性結(jié)果判定[5]。

1.2.2 耐藥基因的PCR擴增及測序 以水煮法制備的大腸埃希菌總DNA為模版，擴增rmtB、aadA1和aph(3′)-1耐藥基因，并用瓊脂糖凝膠電泳檢測擴增產(chǎn)物(退火溫度見表1)。隨機選取PCR擴增陽性產(chǎn)物，使用SanPrep 柱式DNA膠回收試劑盒回收產(chǎn)物，然后與pMD18 T-Vector 16 ℃連接過夜，再轉(zhuǎn)化到感受態(tài)細胞中，最后做菌液PCR鑒定，將陽性重組菌送英濰捷基生物有限公司測序,并與GenBank上已注冊的基因序列進行比對分析。

1.2.3 數(shù)據(jù)分析 采用SPSS 19.0軟件對所得數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析。分析水禽源大腸埃希菌耐藥基因型與耐藥表型的相關(guān)性時，采用Pearson卡方檢驗的獨立性檢驗，P<0.01表示極顯著相關(guān)，P<0.05表示顯著相關(guān)，而P>0.05表示兩者獨立不相關(guān)。

表1 PCR引物序列

Table 1 Primer sequences of PCR

目的基因Targetgenes引物Primers引物序列(5'-3')Primersequences片段大小/bpFragmentsize退火溫度/℃AnnealingtemperaturesrmtBrmtB-FrmtB-RAACCCCTTGGCGCTATACGAGCGTAGTTCGCCTCCATGCCTT31662aadA1aadA1-FaadA1-RACCTTTTGGAAACTTCGGCTTCTCGCCTTTCACGTAGTGGAC56356aph(3')-1aph(3')-1-Faph(3')-1-RAATTTATGCCTCTTCCGACCAACAACCTATTAATTTCCCCTCGT41356

2 結(jié)果

2.1 藥物敏感性試驗結(jié)果

在251株水禽源大腸埃希菌中，149株對氨基糖苷類藥物表現(xiàn)耐藥。水禽源大腸埃希菌對鏈霉素耐藥較嚴重，鴨源和鵝源的耐藥率分別為81.58%和75.43%，MIC50以及MIC90均高于256 μg/mL；對慶大霉素和卡那霉素較敏感，耐藥率為25%～54.86%，MIC50為2 μg/mL～32 μg/mL；而鴨源的菌株對阿米卡星最為敏感，耐藥率為1.32%，MIC50為2 μg/mL～32 μg/mL(表2)。

2.2 PCR擴增產(chǎn)物測序及序列分析結(jié)果

將測序結(jié)果與GenBank中已發(fā)表的rmtB、aadA1和aph(3′)-1耐藥基因序列進行比對，結(jié)果分析表明rmtB、aadA1和aph(3′)-1耐藥基因與GenBank中已發(fā)表的基因序列同源性均高于96.7%。

表2 水禽源大腸埃希菌對氨基糖苷類藥物的敏感性

Table 2 The sensitivity of aminoglycosides antibiotics toE.coliisolates from waterfowl

抗菌藥物Antibacterials鴨源菌株(76)StrainsofducksS/%I/%R/%鵝源菌株(175)StrainsofgeeseS/%I/%R/%MIC50/(μg·mL-1)MIC90/(μg·mL-1)慶大霉素Gentamicin71.053.9525.0059.431.7138.862>256阿米卡星Amikacin98.6801.3267.432.2930.282256卡那霉素Kanamycin60.531.3138.1642.282.8654.8632256鏈霉素Streptomycin18.42-81.5824.57-75.43256>256壯觀霉素Spectinomycin69.749.2121.05205.7174.2932>256

注：“-”表示CLSI沒有相應(yīng)判斷標準。“R”、“I”和“S”分別表示耐藥率、中介率和敏感率。

Note:“-” means CLSI hasn′t corresponding criteria; “R” means resistance; “I” means intermediate; “S” means sensitive.

2.3 耐藥基因PCR擴增結(jié)果

PCR檢測結(jié)果表明，149株大腸埃希菌氨基糖苷類耐藥株中，rmtB、aadA1和aph(3′)-1基因檢出率分別為16.8%(25/149)、84.6%(126/149)和91.9%(137/149)。僅1.3%(2/149)的氨基糖苷類耐藥株沒有檢測到rmtB、aadA1和aph(3′)-1耐藥基因。統(tǒng)計分析顯示，耐藥基因rmtB的攜帶與4種藥物(慶大霉素、阿米卡星、卡那霉素和壯觀霉素)耐藥株的產(chǎn)生極顯著相關(guān)(P<0.01)，而其他基因則表現(xiàn)與耐藥株的產(chǎn)生獨立不相關(guān)(P>0.05)(表3)。部分菌株rmtB、aadA1和aph(3′)-1基因電泳結(jié)果見圖1～圖3。

表3 氨基糖苷類藥物耐藥表型與基因型相關(guān)性分析

Table 3 Analysis of antibiotic resistance genes and phenotypes of antimicrobial resistance

抗菌藥物Antibacterials基因型genetypesR株攜帶率/%CarryingrateofR鴨源菌株Strainsofducks鵝源菌株StrainsofgeeseI株攜帶率/%CarryingrateofI鴨源菌株Strainsofducks鵝源菌株StrainsofgeeseS株攜帶率/%CarryingrateofS鴨源菌株Strainsofducks鵝源菌株Strainsofgeeseχ2P慶大霉素GentamicinrmtB10.0(2/20)26.5(18/68)0(0/3)0(0/3)1.9(1/53)7.7(8/104)16.7<0.01aadA175.0(15/20)86.8(59/68)0(0/3)100.0(3/3)86.8(46/53)81.8(85/104)4.7>0.05aph(3')-195.0(19/20)91.2(62/68)100.0(3/3)66.7(2/3)84.9(45/53)86.6(90/104)2.1>0.05阿米卡星AmikacinrmtB100.0(1/1)35.9(19/53)0(0/0)0(0/4)2.7(2/75)5.9(7/118)42.7<0.01aadA1100.0(1/1)81.1(43/53)0(0/0)100.0(4/4)80.0(60/75)84.8(100/118)0.9>0.05aph(3')-1100.0(1/1)81.1(43/53)0(0/0)100.0(4/4)88.0(66/75)86.4(102/118)1.7>0.05卡那霉素KanamycinrmtB3.5(1/29)21.9(21/96)0(0/1)20.0(1/5)4.3(2/46)54.1(4/74)9.7<0.01aadA168.9(20/29)87.5(84/96)100.0(1/1)100.0(5/5)87.0(40/46)78.4(58/74)1.4>0.05aph(3')-196.6(28/29)89.6(86/96)100.0(1/1)100.0(5/5)82.7(38/46)85.1(63/74)3.7>0.05鏈霉素StreptomycinrmtB3.2(2/62)16.7(22/132)--7.1(1/14)9.3(4/43)0.3>0.05aadA182.3(51/62)86.4(114/132)--71.4(10/14)76.8(33/43)3.3>0.05aph(3')-187.1(54/62)87.9(116/132)--85.7(12/14)90.7(39/43)0>0.05壯觀霉素SpectinomycinrmtB6.3(1/16)11.1(19/72)0(0/7)0(0/10)3.8(2/53)7.5(7/93)17.1<0.01aadA187.5(14/16)84.7(61/72)100.0(7/7)90.0(9/10)75.5(40/53)82.8(77/93)2.6>0.05aph(3')-1100.0(16/16)88.9(64/72)71.4(5/7)90.0(9/10)86.8(46/53)87.1(81/93)1.4>0.05

注：“-”表示CLSI沒有相應(yīng)判斷標準；“R”、“I”和“S”分別表示耐藥、中介和敏感。

Note:“-” means CLSI hasn′t corresponding criteria; “R” means resistance; “I” means intermediate; “S” means sensitive.

M.DNA 標準DL2 000；1～7.待檢菌株；8.陽性對照；9.陰性對照

M.DNA Marker DL2 000; 1-7.E.colifrom waterfowl to be detected; 8.Positive control; 9.Negative control

圖1 rmtB基因PCR擴增結(jié)果

Fig.1 PCR amplification results of rmtB genes

M.DNA標準DL 2 000；1～13.待檢菌株；14.陽性對照；15.陰性對照

M.DNA Marker DL2 000; 1-13.E.colifrom waterfowl to be detected; 14.Positive control; 15.Negative control

圖2 aadA1基因PCR擴增結(jié)果

Fig.2 PCR amplification results of aadA1 genes

M.DNA標準DL 2 000；1～15.待檢菌株；16.陽性對照；17.陰性對照M.DNA Marker DL 2 000; 1-15.E.coli from waterfowl to be detected; 16.Positive control; 17.Negative control

3 討論

氨基糖苷類藥物是一組種類繁多，而且在臨床應(yīng)用上使用較多的抗菌化合物，對由革蘭陰性菌和陽性菌以及原生動物引起的傳染病都起到較好的作用，然而細菌對氨基糖苷類藥物的耐藥性問題引人擔憂。本研究對251株水禽源大腸埃希菌耐藥性做了調(diào)查，結(jié)果顯示，分離株對鏈霉素耐藥最為嚴重，鴨源和鵝源的耐藥率分別為81.58%和75.43%，MIC50以及MIC90均高于256 μg/mL，對阿米卡星最為敏感，其中鴨源的耐藥率僅為1.32%，MIC50為2 μg/mL～32 μg/mL。與陳志華[6]、宦海霞[7]和于學輝[8-9]對水禽源大腸埃希菌耐藥性的研究結(jié)果(慶大霉素耐藥率為12.08%～28%、阿米卡星耐藥率為0～3.1%、卡那霉素耐藥率為16.91%～37%、鏈霉素耐藥率為15.45%～72%和壯觀霉素耐藥率為5%～12.77%)相比，5種氨基糖苷類藥物的耐藥率都有所升高，其中對阿米卡星和壯觀霉素耐藥率增長最快。水禽源大腸埃希菌對敏感度較高的抗菌藥物正在逐漸產(chǎn)生耐藥性，引起這一現(xiàn)象的可能與抗生素耐藥性的生物適應(yīng)性代價有關(guān)?？股啬退幮缘纳镞m應(yīng)性代價是影響耐藥菌株的出現(xiàn)和傳播的重要因素，由于耐藥適應(yīng)性代價，在抗生素選擇性壓力小時，耐藥菌增長速率低于敏感株。然而在長期的抗生素壓力下，耐藥菌通過獲得額外的補償性適應(yīng)突變而改善耐藥代價，耐藥菌增長速率因此高于敏感株，耐藥菌得到大量繁殖成為優(yōu)勢菌，從而細菌對抗菌藥物的耐藥率升高[10-12]。

統(tǒng)計分析本研究中水禽源大腸埃希菌耐藥基因型與耐藥表型相關(guān)性，結(jié)果表明，耐藥基因rmtB的攜帶與4種藥物(慶大霉素、阿米卡星、卡那霉素和壯觀霉素)耐藥株的產(chǎn)生具有顯著相關(guān)性(P<0.01)。雖然耐藥基因aadA1和aph(3′)-1在統(tǒng)計

學上表現(xiàn)與耐藥菌株的產(chǎn)生獨立不相關(guān)，但是它們在耐藥菌株中的檢出率較高，為84.6%～91.9%，表明aadA1和aph(3′)-1是廣東地區(qū)流行的基因型。本研究中耐藥基因aadA1和aph(3′)-1的攜帶率如此高，但生物統(tǒng)計學上卻沒有顯示其與耐藥表型相關(guān)，即大腸埃希菌敏感株和耐藥株耐藥基因攜帶率都較高，兩者之間差異不顯著，這可能與敏感株中耐藥基因的沉默有關(guān)。在細菌中，完整的耐藥基因表達系統(tǒng)可以關(guān)閉，即耐藥基因沉默。Enne V I等[13-14]研究顯示，在大腸埃希菌敏感株中檢測到的耐藥基因blaOXA-2、aadA1、sulI和tetA及其啟動子大多數(shù)是完好無損的，但是它們不表達，從而無法表現(xiàn)耐藥表型。然而，這個過程是可逆的，將其他質(zhì)粒以正常的頻率通過接合進入攜帶耐藥基因的菌株中，耐藥基因則可以在新的質(zhì)粒上表達。研究證明[15-17]，耐藥基因沉默是特定的出現(xiàn)于宿主最初攜帶的質(zhì)粒上，如果耐藥基因及其啟動子完整，則其他質(zhì)粒從攜帶耐藥基因的菌株通過接合轉(zhuǎn)移到另一個菌株中時，耐藥基因的表達可以恢復。耐藥基因沉默不是由于基因或啟動子的突變，也不是由于質(zhì)粒整合到染色體上，可能由于大腸埃希菌的一個染色體改變，使啟動子活性被抑制。耐藥基因沉默現(xiàn)象提示我們，在抗生素過度壓力下，質(zhì)粒更加頻繁的轉(zhuǎn)移，從可能導致沉默耐藥基因恢復表達，從而引起更嚴重的細菌耐藥性。

本試驗通過檢測廣東地區(qū)水禽源大腸埃希菌對氨基糖苷類藥物的耐藥性和耐藥基因，反映了該地區(qū)大腸埃希菌對氨基糖苷類藥物耐藥嚴重，充實了大腸埃希菌的耐藥性研究數(shù)據(jù)庫，可為該地區(qū)臨床用藥提供了科學的理論依據(jù)，為研究該地區(qū)的大腸埃希菌的耐藥基因提供相關(guān)的數(shù)據(jù)。

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Investigation on Aminoglycosides Antibiotics Resistance and Resistance Genes ofEscherichiacoliIsolated from Waterfowl in Guangdong Province

ZHANG Ji-pei1,WEI Qing-lan1,2,TAN Hua-long1,CHEN Gang1,CHEN Jian-hong1

(1.CollegeofLifeSciences,FoshanUniversity,Foshan，Guangdong,528231,China; 2.CollegeofVeterinaryMedicine,SouthChinaAgriculturalUniversity,Guangzhou，Guangdong,510642,China)

In order to understand the resistance to aminoglycosides antibiotics and the prevalence of aminoglycosides resistance genes from waterfowl in Guangdong province,explore the relationship between antibiotic resistance genes and phenotypes of antimicrobial resistance,antimicrobial susceptibilities of total 251E.coliisolates to aminoglycosides antimicrobial agents were determined by agar dilution methods and the aminoglycosides resistance genes were detected by PCR.The results of drug sensitivity tests showed that the resistant incidence rates of ducks and geese were exhibited to streptomycin (81.58% and 75.43%),gentamicin (25% and 38.86%),spectinomycin (21.05% and 74.29%),kanamycin (38.16% and 54.86%) and amikacin (1.32% and 30.28%).The occurrences ofaadA1 andaph(3′)-1 genes were ranked the higher (84.6%-91.9%).It indicated that the antimicrobial resistance genetypes ofaadA1 andaph(3′)-1 were detected frequently among commensalE.colifrom waterfowl in Guangdong province.Analysis of resistance genetypes and drug resistance phenotype correlations showed thatrmtBgene had significant correlation on the resistance ofE.colito gentamicin,amikacin,kanamycin and spectinomycin,which indicatedrmtBgene played an important role in the resistant strains ofE.coli.This research played a significant role in prevention of colibacillosis, and provided relevant data for the resistance genes ofE.coli.

Escherichiacolifrom waterfowl; aminoglycoside antibiotics; resistance gene; resistance genetype

2015-09-20

張濟培(1970-)，男，廣東陸河人，碩士，高級實驗師，主要從事預防獸醫(yī)學研究。*通訊作者

S852.61

A

1007-5038(2016)05-0042-05