時廣利，班武娟，陳 燕，尹顏軍，白萬秋，丁湘彧

(首都醫(yī)科大學附屬北京胸科醫(yī)院，北京 101149)

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·論 著·

血清miR-6801在非小細胞肺癌輔助診斷中的臨床意義

時廣利，班武娟，陳 燕，尹顏軍，白萬秋，丁湘彧△

(首都醫(yī)科大學附屬北京胸科醫(yī)院，北京 101149)

目的 探討血清miR-6801在非小細胞肺癌(NSCLC)患者中的表達水平及其在NSCLC輔助診斷中的臨床意義。方法 采用實時熒光定量聚合酶鏈反應(PCR)檢測40例健康人和78例NSCLC患者血清中miR-6801的表達量,并構建受試者操作特征(ROC)曲線計算血清miR-6801的靈敏度和特異度。結果 NSCLC患者血清中miR-6801的表達水平顯著低于健康者，差異有統計學意義(P<0.05)；血清miR-6801在Ⅲ期+Ⅳ期中的表達水平顯著低于Ⅰ期+Ⅱ期(P<0.05)；血清miR-6801對NSCLC檢測的靈敏度為51.9%；miR-6801對Ⅰ期、Ⅱ期NSCLC檢測的靈敏度為40.6%。結論 NSCLC患者miR-6801的檢測對于NSCLC的輔助診斷和早期診斷有一定的臨床應用價值。

非小細胞肺癌； 微小RNA； 輔助診斷； 聚合酶鏈反應

肺癌是嚴重威脅人類健康與生命的惡性腫瘤之一，其病死率居各種惡性腫瘤之首。75%～80%的肺癌患者為非小細胞肺癌(NSCLC)，其5年存活率僅為15%～20%，而Ⅰa期發(fā)現并治療的患者，5年生存率可達80%[1]。缺乏有效的NSCLC早期診斷手段是NSCLC患者高病死率的主要原因[2]。微小RNA(miRNA)是一類內源性高度保守的長度為18～25個核苷酸的非編碼單鏈RNA分子，miRNA在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展中有致癌和抑癌的不同作用[3]。miRNA在血清中非常穩(wěn)定，有可能作為診斷肺癌的新血清標志物[4]。因此，本研究對NSCLC患者與健康者血清中miR-6801的表達水平進行了檢測，探討血清miR-6801表達水平在NSCLC輔助診斷中的臨床應用價值。

1 資料與方法

1.1 一般資料 2014年8月至2015年10月首都醫(yī)科大學附屬北京胸科醫(yī)院收治的初治NSCLC患者78例(NSCLC組)，其中男45例、女33例，年齡41～73歲(平均50.1歲)，其中肺腺癌38例、肺鱗癌40例。所有NSCLC患者全部經細胞學或組織學確診，既往未進行放療或化療，肺癌分期參照2002年美國癌癥聯合協會(AJCC)標準。健康對照組為北京胸科醫(yī)院體檢健康職工40例，其中男19例、女21例，年齡25～55歲(平均39.4歲)，無高血壓、高血脂、糖尿病等基礎性疾病。

1.2 標本采集 用真空采血管收集NSCLC患者和健康人空腹外周靜脈血4 mL。所有標本經4 000 r/min離心后分離出血清，收集后的血清標本放至-80 ℃超低溫冰箱中冷凍，集中進行miRNA的提取。此研究經本院倫理委員會審核通過。

1.3 方法

1.3.1 血清標本miRNA的提取 按照北京天根生化科技有限公司生產的miRNA提取試劑盒的操作說明書提取所有血清標本中的miRNA，使用Quawell Q3000微量核酸檢測儀對提取的miRNA進行檢測。

1.3.2 實時熒光定量聚合酶鏈反應(qRT-PCR) qRT-PCR實驗以合成的cDNA為模板，同時以miR-103作為內參照。qRT-PCR反應為20 μL體系，PCR反應循環(huán)條件：94 ℃預熱2 min，94 ℃ 20 s，60 ℃ 34 s，共進行45個循環(huán)。qRT-PCR實驗數據經過Lightcycler 480Ⅱ軟件進行分析，每個cDNA標本的表達量檢測均重復3次，血清miRNA的相對表達量用2-ΔCt表示。

1.3.3 血清標本癌胚抗原(CEA)的檢測 所有血清標本CEA的濃度測定釆用流式熒光免疫法，CEA檢測試劑盒由上海透景生物科技有限公司生產，應用美國LUMINEX200流式熒光點陣分析儀進行測定。

1.4 統計學處理 應用SPSS17.0軟件進行統計學分析,計量資料以中位數(四分位間距)表示。多組間血清miRNA相對表達量比較采用Kruskal WallisH檢驗，兩組之間比較采用Mann-WhitneyU檢驗；通過受試者操作特征曲線(ROC)分析miRNA表達水平對NSCLC診斷價值，并計算95%置信區(qū)間；組間率的比較采用χ2檢驗。所有統計學檢驗均為雙側概率檢驗，以P<0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 血清miR-6801相對表達量的檢測結果 NSCLC組患者血清中miR-6801的表達水平顯著低于健康對照組，差異有統計學意義(Z=2.128,P<0.05)；NSCLC組患者血清中miR-6801的表達水平與患者性別及吸煙狀態(tài)不相關，差異無統計學意義(P>0.05)。NSCLC組經TNM分期后，血清miR-6801在Ⅲ期+Ⅳ期中的表達水平顯著低于Ⅰ期+Ⅱ期(Z=2.081,P<0.05)；NSCLC組經病理分期后，血清miR-6801在腺癌中的表達水平與鱗癌比較，差異無統計學意義(P>0.05)。見表1。

表1 各組研究對象血清中miR-6801的相對表達量

注：與健康對照組比較，*P=0.029；與Ⅰ期+Ⅱ期比較，#P=0.041。

2.2 血清miR-6801對NSCLC檢測的靈敏度 血清miR-6801在Ⅲ期+Ⅳ期NSCLC中檢測的靈敏度(57.8%)顯著高于Ⅰ期+Ⅱ期(40.6%)(χ2=5.565,P<0.05)；血清miR-6801對早期NSCLC(Ⅰ期+Ⅱ期)檢測的靈敏度(40.6%)顯著高于CEA(21.9%)，差異有統計學意義(χ2=4.875,P<0.05)；血清miR-6801在肺腺癌中檢測的靈敏度與肺鱗癌比較，差異無統計學意義(P>0.05)。見表2。

表2 血清miR-6801對NSCLC檢測的靈敏度(%)

注：與CEA比較，*P=0.024；與Ⅰ期+Ⅱ期比較，#P=0.038。

2.3 血清miR-6801在NSCLC中的診斷價值分析 應用ROC曲線分析血清miR-6801在NSCLC中的診斷價值，血清miR-6801診斷NSCLC的ROC曲線下面積(AUC)為0.732,95%置信區(qū)間(CI)=0.628～0.831；血清miR-6801對NSCLC的診斷價值高于血清CEA(AUC=0.596，95%CI=0.484～0.709)。

3 討 論

目前，CT、X線片等影像學檢查及支氣管鏡和痰脫落細胞檢查是最常用的肺癌檢測手段。但是，胸片和痰脫落細胞檢查在肺癌診斷中的靈敏度比較低。支氣管鏡檢查為侵入性方式檢查。而CT檢查由對肺癌診斷的靈敏度過高而容易引起假陽性。盡管有人建議低劑量螺旋CT可作為肺癌篩查的常規(guī)手段，但仍處于研究階段[5]。腫瘤標志物對肺癌的輔助診斷、早期診斷、預后判斷和療效監(jiān)測具有重要的應用價值。但是，目前應用的腫瘤標志物在肺癌診斷中的靈敏度較低，尤其是在早期肺癌(Ⅰ期+Ⅱ期)中的靈敏度更低，對于肺癌的診斷具有很大的局限性[6]。因此，尋找新型、并且特異度和靈敏度都比較好的血液腫瘤標志物是當今臨床迫切需要的。

miRNA在細胞的增殖、凋亡、腫瘤的發(fā)生、發(fā)展等多種生理和病理過程中發(fā)揮重要作用，miRNA有可能成為新的肺癌早期診斷和癌癥進程相關的標記物[7]。目前，血清中miRNA作為惡性腫瘤分子標志的研究是近幾年來的研究熱點。血清miRNA的來源，認為主要來自于壞死或凋亡的細胞，或者來自于腫瘤細胞釋放的內源性miRNA入血[4]。miRNA在血清中能夠非常穩(wěn)定地存在，能夠抵抗RNA內切酶的降解[8]。Shen等[9]研究顯示，聯合檢測血漿miR-21、miR-126、miR-210和miR-486-5p這4種miRNA對NSCLC檢測的靈敏度和特異度高達86.2%和96.5%；對Ⅰ期NSCLC檢測的靈敏度和特異度為73.3%和96.5%。Zheng等[10]研究發(fā)現，血漿miR-155、miR-197及miR-182在Ⅰ期肺癌患者中的表達水平顯著上升，這3種miRNA對肺癌檢測的靈敏度和特異度為81.3%和86.7%。Roth等[11]研究發(fā)現，miR-10b、miR-34a、miR-141在肺癌患者血清的表達水平明顯高于良性疾病組和對照組，并與淋巴結是否轉移相關聯。Zhu等[12]研究結果顯示，肺癌患者血清中miR-183家族(包括miR-96、miR-182和miR-183)的表達水平顯著高于健康對照組，并且與肺癌患者的生存期密切相關。目前的這些研究提示，血清中miRNA表達水平與肺癌的發(fā)生、發(fā)展和病理過程密切相關，并且miRNA有可能參與肺癌的早期形成階段。

本研究的實驗結果首次發(fā)現，NSCLC患者血清中miR-6801的表達水平顯著低于健康對照組，差異有統計學意義(P<0.05)；血清miR-6801在Ⅲ期+Ⅳ期中的表達水平顯著低于Ⅰ期+Ⅱ期，差異有統計學意義(P<0.05)；血清miR-6801在Ⅲ期+Ⅳ期NSCLC中檢測的靈敏度(57.8%)顯著高于Ⅰ期+Ⅱ期(40.6%)(P<0.05)；血清miR-6801對早期NSCLC(Ⅰ期+Ⅱ期)檢測的靈敏度(40.6%)顯著高于CEA(21.9%)，差異有統計學意義(P<0.05)。以上研究結果表明，血清miR-6801作為篩查NSCLC的腫瘤標志物具有潛在的臨床應用價值，并且有可能成為NSCLC早期診斷的參考指標。

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Clinical significance of serum miR-6801 in auxiliary diagnosis of non-small cell lung cancer

SHIGuangli,BANWujuan,CHENYan,YINYanjun,BAIWanqiu,DINGXiangyu△

(DepartmentofClinicalLaboratory,AffiliatedBeijingChestHospital,CapitalMedicalUniversity,Beijing101149,China)

Objective To investigate the expression level of serum miR-6801 in non-small cell lung cancer (NSCLC) and its clinical significance in the auxiliary diagnosis of NSCLC.Methods The real-time quantitative PCR method was adopted to examine the expression amount of serum miR-6801 in 78 NSCLC patients and 40 healthy controls.The sensitivity and specificity of miR-6801 in the diagnosis of NSCLC were evaluated by receiver operating characteristic (ROC) curve.Results The expression level of miR-6801 in the patients with NSCLC was significantly lower than that in healthy controls with statistical difference (P<0.05);the expression level of miR-6801 at stages Ⅲ and Ⅳ was significantly lower than that at stages Ⅰ and Ⅱ (P<0.05);the sensitivity of miR-6801 in detecting NSCLC was 51.9%，and the sensitivities of miR-6801 in the stage I and II of NSCLC was 40.6 %．Conclusion The serum miR-6801 detection has a certain clinical application value for auxiliary diagnosing and early diagnosing of NSCLC.

non-small cell lung cancer； miRNA； auxiliary diagnosis； polymerase chain reaction

時廣利，男，主任技師，主要從事分子生物學研究?！?/p>

，E-mail:dingxymail@163.com。

10.3969/j.issn.1673-4130.2016.24.012

A

1673-4130(2016)24-3416-03

2016-09-01

2016-10-20)