董晶晶，趙淑清

（山西大學生物技術研究所，化學生物學與分子工程教育部重點實驗室，山西太原030006）

擬南芥amiR-RUS4 ms35雄性不育雙突變體的構建、鑒定及表型分析

董晶晶，趙淑清

（山西大學生物技術研究所，化學生物學與分子工程教育部重點實驗室，山西太原030006）

控制雄性育性是研究植物生殖和選擇育種的一個重要目標。對雄性不育分子機制的深入理解將為控制雄性育性和雜種繁育提供有效途徑。利用人工microRNA技術對DUF647蛋白家族成員RUS4基因進行特異沉默，結果發(fā)現，amiR-RUS4植株敗育，藥室內壁次生加厚異常，花藥不開裂，表明RUS4與藥室內壁的木質化有關。MS35/MYB26是木質素生物合成途徑上游一個重要的激活因子，為了進一步了解RUS4和MYB26在調控花藥藥室內壁次生加厚過程中的作用，以ms35為母本、amiR-RUS4為父本進行人工雜交，得到雜交子2代（F2）；并對雜交子2代（F2）的基因型、表型和基因表達進行了鑒定，結果獲得一個純合的amiR-RUS4 ms35雙突變體，這為進一步分析RUS4和MS35在調控藥室內壁次生加厚中的作用提供了寶貴的試驗材料。

擬南芥；雄性不育；RUS4；MYB26

雄性不育是高等植物中較為普遍存在的一種遺傳現象，是指植物雄性生殖器官不能產生正常功能的雄配子——花粉的現象，如植物花藥中無花粉、花粉敗育和花藥不開裂等。雄性不育在農作物的雜種優(yōu)勢利用上具有重要的價值。近年來，人們對花藥和花粉發(fā)育基本過程的認識有了很大的提高，其中，許多信息來自于對擬南芥雄性不育突變體的詳細研究[1-4]。

花粉在植物雄性生殖器官花藥中發(fā)育成熟，早期花藥原基中造孢細胞通過一系列的細胞分裂、分化過程，形成小孢子母細胞和圍繞在外面的絨氈層、中層和藥室內壁3層營養(yǎng)組織，這3層營養(yǎng)組織和最外層表皮對小孢子母細胞起著重要的保護作用，同時為其發(fā)育成熟提供必要的物質和營養(yǎng)保障。當花藥內部表皮、藥室內壁、中層和絨氈層已經分化、減數分裂已經完成時，隨即進入花粉成熟以及花藥開裂進程。擬南芥花藥開裂發(fā)生主要包括中間層和絨氈層的退化，內壁細胞的膨脹，在內壁細胞和連接細胞間的纖維層累積即次生壁加厚，隔膜退化形成二室花藥，花藥脫水，花粉粒膨大，最終導致花藥開裂，釋放花粉粒。其中，藥室內壁次生加厚可為花藥開裂提供一種機械力量[5]。對花藥發(fā)育和花粉釋放機制的深入研究將為控制作物雄性育性和雜種繁育提供有效的途徑。

RUS4（ROOT UV-B SENSITIVE 4）是擬南芥DUF647（Domain of unknown function647）蛋白家族的一個成員[6]。通過人工microRNAs（artificial microRNAs,amiRNAs）技術獲得了特異沉默RUS4（At2g23470）基因的突變體[7]。amiR-RUS4突變體由于自花授粉失敗而產生短小的角果，但是通過人工授予有活力的花粉可以挽救其不育表型。研究結果顯示，突變體的花粉活力降低，同時藥室內壁次生加厚出現異常，導致花藥開裂失敗。

MYB26/MALE STERILE 35為R2R3型MYB轉錄因子，在花藥開裂過程中具有重要作用[8]。MYB26功能異常導致植株敗育，花藥不開裂，但花粉具有活力[9-10]。研究發(fā)現，MYB26定位于細胞核，在花藥藥室內壁早期發(fā)育時開始表達，花粉有絲分裂和雙核時期表達量達到最大，通過細胞特異的方式對花藥藥室內壁木質化和開裂起作用。MYB26過表達導致植株的異位次生加厚，在表皮組織表現尤為明顯。MYB26可調控多種次生壁加厚相關基因的表達，包括IRREGULAR XYLEM1（IRX1），IRX3，IRX8和IRX12，且myb26突變體中NAC SECONDARY WALL THICKENING PROMOTING FACTOR1（NST1）和NST2的表達發(fā)生變化，說明MYB26可調控NST1和NST2的表達，可能位于木質素合成途徑的上游，從而控制次生壁的木質化過程，推測MYB26通過NST1和NST2來調控IRX1，IRX3，IRX8，IRX12的表達[11]。

本研究以amiR-RUS4和ms35突變體為材料，進行人工雜交，以創(chuàng)制amiR-RUS4 ms35雙突變體，對雜交子2代（F2）進行了基因型、表型分析，并對雙突變體進行了表達分析，目的是得到純合的amiR-RUS4 ms35雙突變體，旨在為進一步分析RUS4和MYB26基因在調控藥室內壁次生加厚過程中的關系奠定基礎。

1 材料和方法

1.1 材料與生長條件

植物材料為野生型擬南芥 Col（Arabidopsis thaliana，Columbia ecotype），amiR-RUS4和ms35。其生長條件為：光周期16 h光照/8 h黑暗；相對濕度50%～70%；溫度（22±2）℃。

1.2 方法

1.2.1 人工授粉雜交 選擇ms35植株花瓣剛剛露白的花蕾，小心剝去花萼、花瓣和雄蕊，只留雌蕊，做好標記，作為母本。選擇完全盛開的amiR-RUS4的花作為父本。由于amiR-RUS4突變體花藥不開裂，需要人工釋放花粉粒，并將其授到ms35植株的雌蕊柱頭上，為保證成功，一般授粉2～3個花藥。授粉3 d后觀察，若雜交成功，可看到雌蕊伸長；若不成功，則萎蔫。15 d左右后收取單個角果，F1自交產生F2。

1.2.2 amiR-RUS4 ms35雙突變體的鑒定 待F2植株生長15 d左右，取葉片于已配制的蔗糖緩沖液[12]（50 mmol/L Tris-HCl，pH值 7.5，300 mmol/L NaCl，300 mmol/L蔗糖溶液）中充分研磨，99℃加熱10 min，6 000 r/min短暫離心，單株提取基因組DNA，利用引物MIR319a-F/R（表1）進行基因組水平的PCR檢測，以確定amiRNA前體的存在。純合的ms35株系則通過表皮毛來鑒定，由于ms35突變體中MS35和GL基因均發(fā)生突變，而GL基因的缺失導致葉片缺少表皮毛，所以，可以通過葉片表皮毛的有無來鑒定純合的ms35突變體。

1.2.3 表達分析 取經基因型和表型篩選出F2株系3，36，38號的花蕾，用TaKaRa MiniBEST Plant RNA Extraction Kit提取RNA，對RUS4和MYB26的表達進行RT-PCR檢測（引物如表1所示），從而進一步鑒定純合的amiR-RUS4 ms35雙突變體。

表1 amiR-RUS4 ms35植株鑒定的引物序列

1.2.4 表型分析 待F2植株生長50 d左右，觀察植株生長狀況、育性、葉片表皮毛、角果生長狀況。

2 結果與分析

2.1 amiR-RUS4 ms35植株的基因型分析

amiR-RUS4突變體由人工microRNA敲減獲得，其含有MIR319a前體核苷酸序列。種植amiRRUS4與ms35雜交F2共66株，用引物MIR319a-F和MIR319a-R在基因組水平進行PCR鑒定（以野生型Col作為對照），結果顯示，除6，9，17，23，35，47，48，54，66號外，其余57株植株均有目的條帶，且片段大小正確（圖1），表明此57株植株中含有人工microRNA背景。

2.2 amiR-RUS4 ms35植株的表型分析

ms35來自Ler生態(tài)型，且該突變體中MS35和GL基因突變。GL基因編碼一種類似MYB的蛋白質，該蛋白對于誘導表皮毛的發(fā)育是必需的，故ms35為表皮毛缺陷突變體，可作為表型觀察的一個特征。觀察66株中含有人工microRNA前體背景的F2植株表型發(fā)現，F2中3號植株無表皮毛，不結角果，其可能為純合的雙突變體，而36，38號植株育性降低且有表皮毛，其可能為雜合體（圖2）。

2.3 amiR-RUS4 ms35植株的表達分析

本研究對3，36，38號植株進行了RNA水平的半定量RT-PCR鑒定，結果顯示，3號植株花蕾中RUS4，MYB26基因的表達明顯下調，36，38號花蕾中RUS4表達降低不太明顯，MYB26表達量減少（圖3）。因此，雜交F2中3號植株為純合雙突變體。

3 討論

擬南芥作為模式植物，對其雄性育性相關基因的功能分析有助于促進作物雜種優(yōu)勢的應用。由基因控制的可遺傳的雄性不育突變體中花藥和花粉發(fā)育出現異常的過程是研究的重點，它將雄性不育個體調控育性變化的研究和分子水平研究聯系起來，為了解不育基因調控雄性不育的過程奠定了基礎，對全面認識植物雄性育性的分子調控具有重要意義。

DUF647蛋白家族是廣泛存在于真核生物體內高度保守的蛋白質家族，其在植物的生長發(fā)育過程中有著重要作用。擬南芥DUF647蛋白家族有6個成員：RUS1，RUS2，RUS3，RUS4，RUS5，RUS6。其中，RUS1和RUS2通過彼此相互作用，在根UVB感受途徑中發(fā)揮作用[6，13]。且有研究表明，WRX3/ RUS1在生長素極性運輸中有重要的調控作用[14]。RUS4作為DUF647蛋白家族成員之一，其是否與RUS1基因相類似在生長素運輸途徑中發(fā)揮功能，還有待于進一步分析。

本研究在實驗室運用人工microRNA技術對RUS4進行了特異沉默，獲得了amiR-RUS4基因敲減株，發(fā)現其花粉活力降低，藥室內壁次生加厚異常，花藥不開裂，為雄性不育株。ms35突變體中的MS35突變，使得花藥無藥室內壁木質化、花藥開裂缺陷，但花粉具有活力；同時該突變體中GL基因突變，GL基因可調控表皮毛的發(fā)育，其突變會導致植株葉片缺乏表皮毛。本試驗對amiR-RUS4和ms35雜交產生的F2植株進行了基因型、表型、表達分析，鑒定出了純合的amiR-RUS4 ms35雙突變體。突變體葉片缺乏表皮毛，含有microRNA前體序列，花蕾中RUS4和MYB26的表達明顯下調，觀察發(fā)現，藥室內壁次生加厚異常，這為進一步分析RUS4和MYB26在調控花藥藥室內壁次生加厚中的作用提供了有價值的試驗材料。

本研究通過吖啶橙/溴化乙錠染色發(fā)現，amiR-RUS4突變體藥室內壁木質化減少，而ms35/ myb26突變體花藥中藥室內壁完全沒有次生加厚，說明RUS4與MYB26均在藥室內壁次生加厚和花藥開裂過程中起作用。對amiR-RUS4 ms35純合雙突變體的鑒定發(fā)現，其植株表型和myb26相似，藥室內壁次生加厚均有缺陷。通過表達分析發(fā)現，在amiR-RUS4突變體中，MYB26的表達與野生型相比無明顯變化，說明RUS4功能缺失不會影響到MYB26的表達，推測MYB26可能位于RUS4基因的上游起作用或二者通過不同的途徑發(fā)揮作用。MYB26在藥室內壁木質化過程中，通過調控NST1和NST2來調節(jié)木質素合成相關基因IRX的表達，因此，通過對amiR-RUS4突變體中NST1/2的表達進行分析，也可推測RUS4與MYB26是否作用于同一途徑。

花藥藥室內壁次生加厚在花藥開裂過程中起關鍵性作用[8，15]，此過程需植物激素（如生長素[16-17]）和多種基因（如MYB26，SAF1[18]，CBSX2[19]，RPK2[20]，RUS4）參與調控。盡管目前已經確定了藥室內壁次生加厚過程的一些重要的調控因子，但是對于其具體調控機制仍不清楚，純合amiR-RUS4 myb26雙突變體的鑒定可為進一步研究RUS4基因調控花藥藥室內壁次生加厚的分子機制奠定一定的基礎。

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Construction，Identification and Phenotypic Analysis of amiR-RUS4 ms35 Male Sterile Double Mutant in Arabidopsis thaliana

DONG Jing-jing，ZHAO Shu-qing
（Key Laboratory of Chemical Biology and Molecular Engineering of Ministry Education，Institute of Biotechnology，Shanxi University，Taiyuan 030006，China）

Controlling male fertility is an important goal for the research of plant reproduction and selective breeding.A better understanding of the male sterile molecular mechanisms will provide effective ways for the control of male fertility and for hybrid generation. Specific silencing of a DUF647-containing gene RUS4 by artificial microRNA led to a severe reduction of male fertility.The amiR-RUS4 anther displayed altered endothecium secondary thickening,which impacted on anther dehiscence.Transcription factor MYB26/MS35 played a regulatory role in endothecium lignification as wall thickening was not observed in the endothecial cells of the MYB26 mutant and displayed indehiscent anthers.This study generated an amiR-RUS4 ms35 double mutant where homozygous ms35 lines were used for crosses with amiR-RUS4 plants.The genotypic,phenotypic and gene expression analysis were performed in the F2generation.One homozygous amiR-RUS4 ms35 double mutant were obtained,which will provide a valuable material for further analysis of the relationship between RUS4 and MS35 in the regulation of secondary thickening in the endothecium.

Arabidopsis thaliana;male sterile;RUS4;MYB26

Q943

A

1002-2481（2016）05-0583-04

10.3969/j.issn.1002-2481.2016.05.04

2016-01-26

國家自然科學基金項目（31170273）；太原市科技明星專項（11014902）

董晶晶（1990-），女，山西交城人，在讀碩士，研究方向：植物分子生物學。趙淑清為通信作者。