■ 黃遵錫 程志斌

（1.云南師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，云南昆明 650222；2.云南農(nóng)業(yè)大學(xué)，云南昆明 650201；3.昆明三正生物科技(集團(tuán))有限公司，云南昆明 650217）

2013年12月，我國(guó)農(nóng)業(yè)部將凝結(jié)芽孢桿菌正式列入《飼料添加劑品種目錄》（程志斌等，2015；黃遵錫等，2015），至此我國(guó)飼料工業(yè)與養(yǎng)殖業(yè)規(guī)范使用的飼用微生態(tài)制劑已達(dá)34種，比2008版《飼料添加劑品種目錄》新增了18種。這一事實(shí)充分說(shuō)明：在“減抗、禁抗”的行業(yè)發(fā)展趨勢(shì)下，飼用微生態(tài)制劑是我國(guó)安全、高效飼料添加劑研發(fā)與推廣的主要方向之一（邱權(quán)等，2016）。凝結(jié)芽孢桿菌作為新增的飼用微生態(tài)制劑，以其良好的安全性（Endres等，2009；Endres等，2011）、抗逆性（趙樹(shù)平等，2014；鄒梅等，2017）、產(chǎn)乳酸抑菌性（姚曉紅等，2015；王磊等，2016）等綜合優(yōu)勢(shì)，得到了廣大動(dòng)物營(yíng)養(yǎng)學(xué)家與飼料企業(yè)配方師的關(guān)注，尤其在替代斷奶仔豬飼用抗生素使用領(lǐng)域取得了良好的效果與推廣應(yīng)用（黃海強(qiáng)，2014；高書(shū)鋒等，2015；洪文等，2016）。

目前，我國(guó)飼料行業(yè)研究較集中、市場(chǎng)推廣較多的飼用微生態(tài)制劑主要有6種：酵母菌、枯草芽孢桿菌、地衣芽孢桿菌、屎腸球菌、糞腸球菌、丁酸梭菌（李海花等，2016；衛(wèi)旭彪等，2016；張董燕等，2016；郭照宙等，2017），且推廣的商業(yè)飼用微生態(tài)制劑往往是多菌種的復(fù)合產(chǎn)品（華洵璐等，2015；郭紅炳等，2016）。這提示我們：為了更好地發(fā)揮飼用凝結(jié)芽孢桿菌的效果與用途，在確定單一飼用凝結(jié)芽孢桿菌使用效果的基礎(chǔ)上，進(jìn)一步研究凝結(jié)芽孢桿菌與其他飼用微生態(tài)制劑的組合功效，具有可發(fā)掘的更廣泛的實(shí)際商業(yè)價(jià)值。鑒于目前凝結(jié)芽孢桿菌與其他益生菌組合使用的科學(xué)試驗(yàn)研究與報(bào)道極少，本試驗(yàn)探索性將凝結(jié)芽孢桿菌與最常見(jiàn)的飼用枯草芽孢桿菌組合，研究其對(duì)仔豬生長(zhǎng)性能的影響。

1 材料與方法

1.1 飼用凝結(jié)芽孢桿菌制劑和枯草芽孢桿菌制劑

本試驗(yàn)使用的飼用凝結(jié)芽孢桿菌制劑（100×108CFU/g）和枯草芽孢桿菌制劑（200×108CFU/g），均由昆明三正生物科技（集團(tuán)）有限公司提供。

1.2 試驗(yàn)動(dòng)物與試驗(yàn)設(shè)計(jì)

32頭同一批次28日齡斷奶、體重（7.37±0.03）kg的健康商品閹公豬（杜×長(zhǎng)×大），平均分成四個(gè)處理組，代謝籠飼養(yǎng)。所有處理組基礎(chǔ)日糧及營(yíng)養(yǎng)水平設(shè)置一致，依據(jù)試驗(yàn)飼糧使用的不同飼用添加劑，試驗(yàn)分組設(shè)計(jì)見(jiàn)表1。對(duì)照組：模擬當(dāng)前常規(guī)商業(yè)仔豬飼料中添加吉他霉素50 mg/kg、土霉素50 mg/kg、金霉素75 mg/kg等組合抗生素防腹瀉方案；試驗(yàn)組1：在對(duì)照組基礎(chǔ)上添加500 g/t（全價(jià)配合飼料）飼用凝結(jié)芽孢桿菌；試驗(yàn)組2：在對(duì)照組基礎(chǔ)上添加500 g/t（全價(jià)配合飼料）飼用枯草芽孢桿菌；試驗(yàn)組3：在對(duì)照組基礎(chǔ)上，同時(shí)添加500 g/t（全價(jià)配合飼料）飼用凝結(jié)芽孢桿菌和500 g/t（全價(jià)配合飼料）飼用枯草芽孢桿菌。

表1 試驗(yàn)分組設(shè)計(jì)

1.3 試驗(yàn)日糧

參照NRC（1998）豬營(yíng)養(yǎng)需要標(biāo)準(zhǔn)并結(jié)合云南省市場(chǎng)實(shí)際情況，配制“玉米-豆粕-魚(yú)粉”型試驗(yàn)日糧，試驗(yàn)基礎(chǔ)日糧組成及營(yíng)養(yǎng)水平見(jiàn)表2。試驗(yàn)飼料由云南快大多畜牧科技有限公司提供。

表2 試驗(yàn)基礎(chǔ)日糧組成及營(yíng)養(yǎng)水平

1.4 飼養(yǎng)管理

試驗(yàn)期定時(shí)飼喂，每天3次，自由飲水，控制豬舍溫度。免疫及消毒衛(wèi)生程序按試驗(yàn)豬場(chǎng)常規(guī)飼養(yǎng)管理制度進(jìn)行。試驗(yàn)周期28 d。

1.5 測(cè)定指標(biāo)

1.5.1 生長(zhǎng)性能

測(cè)定豬體重、采食量，計(jì)算平均日增重、平均日采食量、料肉比等指標(biāo)。記錄與統(tǒng)計(jì)所有處理組試驗(yàn)仔豬的腹瀉情況與腹瀉率。

1.5.2 飼料表觀消化率試驗(yàn)

采用內(nèi)源指示劑法測(cè)定仔豬對(duì)飼料主要營(yíng)養(yǎng)組分的表觀消化率（程志斌等，2011）。試驗(yàn)14 d開(kāi)始，連續(xù)4 d收集糞樣，-20℃保存。待試驗(yàn)結(jié)束后，糞樣統(tǒng)一解凍，于（60±3）℃烘干，粉碎后待檢測(cè)。實(shí)驗(yàn)室分析測(cè)定干物質(zhì)、粗蛋白、粗脂肪、粗纖維等表觀消化率，在云南農(nóng)業(yè)大學(xué)完成。

1.5.3 仔豬糞便微生物菌群分析

試驗(yàn)27 d早晨喂完飼料后2 h，以籠為單位，采集用于分析乳酸菌與大腸桿菌的新鮮糞樣，用無(wú)菌塑料管保存。糞便中乳酸菌與大腸桿菌數(shù)量的檢測(cè)計(jì)數(shù)方法，參考王向榮等（2013）的報(bào)道。

1.6 統(tǒng)計(jì)分析

使用SAS統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)處理組間進(jìn)行單因素多重比較統(tǒng)計(jì)分析，P＜0.05表示差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 飼糧添加凝結(jié)芽孢桿菌與枯草芽孢桿菌對(duì)斷奶仔豬生長(zhǎng)性能的影響（見(jiàn)表3）

表3結(jié)果顯示，56日齡試驗(yàn)仔豬末體重指標(biāo)：?jiǎn)我惶砑语曈媚Y(jié)芽孢桿菌的試驗(yàn)組1仔豬體重顯著高于對(duì)照組（組合抗生素組）（P＜0.05）；而單一添加飼用枯草芽孢桿菌的試驗(yàn)組2仔豬體重與對(duì)照組相比差異不顯著（P＞0.05）；同時(shí)使用凝結(jié)芽孢桿菌和枯草芽孢桿菌的試驗(yàn)組3仔豬體重雖然高于對(duì)照組，但差異不顯著（P＞0.05）。平均日增重指標(biāo)：試驗(yàn)組1和試驗(yàn)組3差異不顯著（P＞0.05），均顯著高于對(duì)照組和試驗(yàn)組2（P＜0.05），且對(duì)照組和試驗(yàn)組2相比差異不顯著（P＞0.05）。料肉比指標(biāo)，試驗(yàn)組1顯著低于（P＜0.05）其他3個(gè)處理組。此外，試驗(yàn)全期4個(gè)處理組仔豬腹瀉率均控制在合理的實(shí)際養(yǎng)殖生產(chǎn)水平，且單一添加飼用凝結(jié)芽孢桿菌的試驗(yàn)組1仔豬腹瀉率最低。

表3 飼糧添加凝結(jié)芽孢桿菌與枯草芽孢桿菌對(duì)斷奶仔豬生長(zhǎng)性能的影響

2.2 凝結(jié)芽孢桿菌與枯草芽孢桿菌對(duì)飼料養(yǎng)分表觀消化率的影響（見(jiàn)表4）

表4結(jié)果顯示，干物質(zhì)表觀消化率指標(biāo)：試驗(yàn)組1與對(duì)照組相比差異不顯著（P＞0.05），均高于（P＜0.05）試驗(yàn)組2；試驗(yàn)組3干物質(zhì)表觀消化率低于對(duì)照組，但統(tǒng)計(jì)差異不顯著（P＞0.05）。除此之外，粗蛋白、粗脂肪、粗纖維等表觀消化率指標(biāo)，四個(gè)處理組之間統(tǒng)計(jì)差異不顯著（P＞0.05）。

表4 凝結(jié)芽孢桿菌與枯草芽孢桿菌對(duì)飼料養(yǎng)分表觀消化率的影響（%）

2.3 飼糧添加凝結(jié)芽孢桿菌與枯草芽孢桿菌對(duì)斷奶仔豬糞便微生物菌群的影響（見(jiàn)表5）

表5結(jié)果顯示，仔豬糞便中乳酸菌的數(shù)量指標(biāo)：試驗(yàn)組1顯著高于對(duì)照組（P＜0.05）；試驗(yàn)組2和試驗(yàn)組3略高于對(duì)照組，但統(tǒng)計(jì)差異不顯著（P＞0.05）。仔豬糞便中大腸桿菌的數(shù)量指標(biāo)：試驗(yàn)組1數(shù)值最小，對(duì)照組數(shù)值最大，但4個(gè)處理組之間統(tǒng)計(jì)差異不顯著（P＞0.05）。

表5 飼糧添加凝結(jié)芽孢桿菌與枯草芽孢桿菌對(duì)斷奶仔豬糞便微生物菌群的影響（lgCFU/g）

3 討論

近2年來(lái)，我國(guó)飼料工業(yè)和畜牧業(yè)“減抗、禁抗”的步伐明顯加快（陳輝等，2017；唐受文等，2017）。2016年7月我國(guó)農(nóng)業(yè)部公告第2428號(hào)，宣布禁止畜禽飼料中添加硫酸黏菌素。最新2017年9月我國(guó)農(nóng)業(yè)部發(fā)布《飼料添加劑安全使用規(guī)范（修訂意見(jiàn)征求稿）》，將25 kg以內(nèi)仔豬飼糧中銅的最高添加限量下調(diào)為125 mg/kg，鋅的最高添加限量下調(diào)為150 mg/kg。雖然目前只是“征求意見(jiàn)稿”，但很明顯以硫酸黏菌素為主的組合飼用抗生素方案、高銅及高鋅添加劑方案等，用于應(yīng)對(duì)斷奶仔豬腹瀉的技術(shù)即將禁用。這提示我國(guó)飼料企業(yè)配方師應(yīng)盡快確定“減抗、禁抗”的替代方案，同時(shí)選用安全、有效的“替抗”飼用添加劑產(chǎn)品。這也是本試驗(yàn)在斷奶仔豬日糧中探索性研究飼用凝結(jié)芽孢桿菌與枯草芽孢桿菌“單一”或“組合”使用效果的初衷。

為使本研究更符合當(dāng)前飼料企業(yè)的實(shí)際生產(chǎn)情況，本次試驗(yàn)所有試驗(yàn)組仔豬飼糧中均添加了組合抗生素（吉他霉素50 mg/kg、土霉素50 mg/kg、金霉素75 mg/kg），以模擬當(dāng)前飼料企業(yè)真實(shí)使用飼用微生態(tài)制劑的情況。試驗(yàn)組1在對(duì)照組飼糧基礎(chǔ)上添加500 g/t（全價(jià)配合飼料）飼用凝結(jié)芽孢桿菌的原因是：已有試驗(yàn)報(bào)道顯示，0.5～1×107CFU/g（全價(jià)配合飼料）飼用凝結(jié)芽孢桿菌能夠顯著改善斷奶仔豬生長(zhǎng)性能（周映華等，2012；高書(shū)鋒等，2015）。試驗(yàn)組2在對(duì)照組飼糧基礎(chǔ)上添加500 g/t（全價(jià)配合飼料）飼用枯草芽孢桿菌的原因是：有研究顯示，1～2×107CFU/g（全價(jià)配合飼料）飼用枯草芽孢桿菌對(duì)改善斷奶仔豬生長(zhǎng)性能具有一定效果（黃雪泉，2010；魏立民等，2017）。本試驗(yàn)在驗(yàn)證前人試驗(yàn)結(jié)果的同時(shí)，進(jìn)一步設(shè)計(jì)試驗(yàn)組3：在對(duì)照組基礎(chǔ)上同時(shí)添加500 g/t（全價(jià)配合飼料）飼用凝結(jié)芽孢桿菌和500 g/t（全價(jià)配合飼料）飼用枯草芽孢桿菌，觀察組合使用飼用凝結(jié)芽孢桿菌、枯草芽孢桿菌對(duì)斷奶仔豬生產(chǎn)性能的效果。

本次試驗(yàn)4個(gè)處理組仔豬腹瀉率（2%～4%）均控制在合理的實(shí)際養(yǎng)殖生產(chǎn)水平，這說(shuō)明整體試驗(yàn)仔豬健康狀況良好，因此本試驗(yàn)結(jié)果對(duì)廣大飼料企業(yè)配方師實(shí)施逐步“減抗”具有真實(shí)的參考價(jià)值。表3結(jié)果顯示，添加了飼用凝結(jié)芽孢桿菌（5×106CFU/g）的試驗(yàn)組1和試驗(yàn)組3兩組仔豬的平均日增重差異不顯著，均顯著高于對(duì)照組（組合抗生素組）和試驗(yàn)組2（枯草芽孢桿菌組）。這一結(jié)果說(shuō)明：在正常斷奶、健康狀況良好的條件下，飼糧添加凝結(jié)芽孢桿菌進(jìn)一步提高了28～56日齡斷奶仔豬的生長(zhǎng)速度。高書(shū)鋒等（2015）研究了3個(gè)劑量（5×106CFU/g、7.5×106CFU/g、1×107CFU/g）凝結(jié)芽孢桿菌對(duì)28日齡斷奶仔豬（7 kg）生長(zhǎng)性能的影響，他們的試驗(yàn)結(jié)果也顯示，與對(duì)照組（金霉素50 mg/kg）相比，三個(gè)添加了飼用凝結(jié)芽孢桿菌的試驗(yàn)組仔豬平均日增重均顯著提高。本試驗(yàn)結(jié)果與高書(shū)鋒等（2015）的報(bào)道基本一致。

表3料肉比指標(biāo)顯示：?jiǎn)我惶砑语曈媚Y(jié)芽孢桿菌的試驗(yàn)組1優(yōu)于其他三個(gè)處理組，這一結(jié)果提示：①在飼糧含有規(guī)范使用的抗生素基礎(chǔ)上，飼用凝結(jié)芽孢桿菌能夠進(jìn)一步改善仔豬的飼料轉(zhuǎn)化效率。表4分析仔豬對(duì)飼料營(yíng)養(yǎng)表觀消化率的結(jié)果也顯示，試驗(yàn)組1的干物質(zhì)消化率最高，這與表3生產(chǎn)性能的結(jié)果相符。②在飼糧含有抗生素的基礎(chǔ)上，添加較高劑量（1×107CFU/g）的枯草芽孢桿菌不能進(jìn)一步改善飼料轉(zhuǎn)化效率。進(jìn)一步分析表觀消化率顯示（表4），試驗(yàn)組2的干物質(zhì)消化率最低。這一現(xiàn)象在黃雪泉（2010）和魏立民等（2017）的報(bào)道中也有發(fā)現(xiàn)。③在日糧含有抗生素的基礎(chǔ)上，試驗(yàn)組3同時(shí)添加飼用凝結(jié)芽孢桿菌和枯草芽孢桿菌，仔豬綜合生產(chǎn)性能反而略低于單一使用凝結(jié)芽孢桿菌的試驗(yàn)組1。

造成以上結(jié)果的可能原因，我們推測(cè)如下：

其一，實(shí)際飼料產(chǎn)品配方以及養(yǎng)殖生產(chǎn)過(guò)程中，選用優(yōu)質(zhì)的飼用凝結(jié)芽孢桿菌制劑產(chǎn)品，才能獲得進(jìn)一步改善斷奶仔豬生產(chǎn)性能的功效。凝結(jié)芽孢桿菌在仔豬腸道內(nèi)增殖、增生的過(guò)程，產(chǎn)生L-乳酸，因此凝結(jié)芽孢桿菌屬于乳酸菌類細(xì)菌。優(yōu)質(zhì)的飼用凝結(jié)芽孢桿菌產(chǎn)品，能夠產(chǎn)生大量乳酸，具有直接殺菌抑菌功效（張董燕等，2016）。大量的體外經(jīng)典牛津杯法抑菌實(shí)驗(yàn)已經(jīng)證實(shí)：凝結(jié)芽孢桿菌體外強(qiáng)效抑制腸道致病大腸桿菌等有害細(xì)菌（李剛等，2013；姚曉紅等，2015；趙鈺等，2015；王磊等，2016）。周映華等（2012）和高書(shū)鋒等（2015）通過(guò)動(dòng)物試驗(yàn)也證明：飼喂凝結(jié)芽孢桿菌能夠顯著降低斷奶仔豬腸道致病菌。本次試驗(yàn)同樣也檢測(cè)了仔豬糞便中微生物菌群情況，結(jié)果顯示（表5）：?jiǎn)我惶砑语曈媚Y(jié)芽孢桿菌的試驗(yàn)組1仔豬腸道乳酸菌維持較高水平，而大腸桿菌數(shù)量值最低。這一結(jié)果通過(guò)采集糞便檢測(cè)體現(xiàn)，且我們的結(jié)果與周映華等（2012）和高書(shū)鋒等（2015）的報(bào)道完全一致，同時(shí)也與現(xiàn)有的體外試驗(yàn)的結(jié)果相符（李剛等，2013；姚曉紅等，2015；趙鈺等，2015；王磊等，2016）。

其二，不同菌株的飼用枯草芽孢桿菌制劑產(chǎn)品質(zhì)量不同，對(duì)斷奶仔豬生產(chǎn)性能影響差異較大。在斷奶仔豬飼糧中添加枯草芽孢桿菌，雖有大量報(bào)道顯示能夠顯著改善仔豬生產(chǎn)性能（黃雪泉，2010；劉江坤等，2017；魏立民等，2017），但也有報(bào)道顯示：飼用枯草芽孢桿菌對(duì)斷奶仔豬增重和料重比等生產(chǎn)性能指標(biāo)影響不顯著（劉影等，2010；王亞芳等，2014），尤其是飼糧中同時(shí)添加不同類型的飼用抗生素，情況更加復(fù)雜（孫燕等，2011）。我們認(rèn)為主要有4個(gè)因素干擾了飼用枯草芽孢桿菌在斷奶仔豬上的飼喂效果，包括：①并非所有的枯草芽孢桿菌菌株具有直接抑菌、殺菌功效?？莶菅挎邨U菌不像凝結(jié)芽孢桿菌、乳酸菌等益生菌，能夠在腸道分泌大量乳酸，發(fā)揮直接的抑菌、殺菌功效。雖然也有報(bào)道顯示：某些枯草芽孢桿菌菌株具有直接抑制大腸桿菌等有害菌的功效（王亞芳等，2014；張媛媛等，2014），但至今枯草芽孢桿菌分泌的特異抑菌物質(zhì)及其作用機(jī)理不明確。②很多綜述性文獻(xiàn)認(rèn)為，枯草芽孢桿菌間接抑菌、調(diào)控腸道菌群平衡的機(jī)理，是基于“腸道占位”理論（邱權(quán)等，2016；郭照宙等，2017）。然而，實(shí)際養(yǎng)殖生產(chǎn)與飼料配方十分復(fù)雜，尤其是飼糧中添加多種抗生素的條件下，抗生素也可能同時(shí)抑制枯草芽孢桿菌在斷奶仔豬腸道中的增殖，這并不利于“占位”，進(jìn)而影響飼用枯草芽孢桿菌的實(shí)際使用效果。③枯草芽孢桿菌“腸道占位”理論的成立，還取決于特異菌株的枯草芽孢桿菌在斷奶仔豬腸道中的增殖速度。如果某一菌株的枯草芽孢桿菌增殖速度低于大腸桿菌，且添加量不充分的情況下，該飼用枯草芽孢桿菌產(chǎn)品平衡腸道菌群的效果就較差或不穩(wěn)定。秦瑤等（2014）采用體外枯草芽孢桿菌與大腸桿菌混合培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)，證實(shí)了這一觀點(diǎn)。該觀點(diǎn)已經(jīng)應(yīng)用于實(shí)際治療腹瀉仔豬：首先口服抗生素，過(guò)2 h后，再口服補(bǔ)充足量的枯草芽孢桿菌、乳酸菌等益生菌。④進(jìn)一步分析，對(duì)于健康仔豬而言，如果飼糧添加或外源攝入的枯草芽孢桿菌過(guò)多，在腸道中大量增殖，雖然有利于維持腸道菌群平衡（表5），但同時(shí)也消耗大量營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，反而不利于仔豬生產(chǎn)性能的提高，體現(xiàn)在實(shí)際養(yǎng)殖生產(chǎn)中動(dòng)物采食量和料肉比指標(biāo)的異常增高。我們的試驗(yàn)結(jié)果也證實(shí)了這一實(shí)際生產(chǎn)中觀察到的現(xiàn)象（表3和表4）。

其三，不同飼用益生菌組合使用，是協(xié)同效應(yīng)，還是拮抗效應(yīng)，決定了復(fù)合飼用微生態(tài)制劑的實(shí)際效果。姚曉紅等（2015）和趙鈺等（2015）采用牛津杯法實(shí)驗(yàn)證明，凝結(jié)芽孢桿菌體外對(duì)枯草芽孢桿菌具有一定抑制作用，這與本次動(dòng)物試驗(yàn)的結(jié)果吻合。與對(duì)照組相比，單一添加飼用凝結(jié)芽孢桿菌的試驗(yàn)組1仔豬各項(xiàng)生產(chǎn)性能指標(biāo)進(jìn)一步提高；反而，凝結(jié)芽孢桿菌與枯草芽孢桿菌組合使用的試驗(yàn)組3料肉比指標(biāo)，與對(duì)照組相比差異不顯著，卻明顯高于試驗(yàn)組1。這一結(jié)果進(jìn)一步提示，當(dāng)前市場(chǎng)大量銷售的凝結(jié)芽孢桿菌和枯草芽孢桿菌、甚至包括其他益生菌的復(fù)合飼用微生態(tài)制劑產(chǎn)品，其作用效果及機(jī)理有待商榷。

4 結(jié)論

斷奶仔豬飼糧使用多種飼用抗生素的條件下，單一添加適量的飼用凝結(jié)芽孢桿菌能夠進(jìn)一步改善斷奶仔豬的生產(chǎn)性能。然而，本試驗(yàn)顯示單一添加枯草芽孢桿菌、或凝結(jié)芽孢桿菌與枯草芽孢桿菌組合使用，沒(méi)有獲得進(jìn)一步改善斷奶仔豬生產(chǎn)性能的正效應(yīng)。