■李仲玉 杜 鵑 陳志輝 徐良梅邢澤龍 楊 麒

（東北農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，黑龍江哈爾濱 150030）

蛋白質(zhì)是生物細(xì)胞和組織的重要成分，同時(shí)蛋白質(zhì)也行使重要的生物學(xué)功能。而在飼料生產(chǎn)中，蛋白質(zhì)含量的多寡也是評(píng)定飼料營(yíng)養(yǎng)價(jià)值的重要指標(biāo)。目前，畜牧行業(yè)采用由飼料中含有的氮元素的含量乘以蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)化系數(shù)（常以6.25來表示）所得到的數(shù)據(jù)來推算飼料中蛋白質(zhì)的含量，即通常所說的粗蛋白質(zhì)。因此，飼料中粗蛋白質(zhì)的檢測(cè)其本質(zhì)就是飼料中氮元素的檢測(cè)。目前，飼料中氮元素的國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)檢測(cè)主要采用的是凱氏定氮法。但手動(dòng)半微量定氮法操作步驟較多，對(duì)操作人員的實(shí)驗(yàn)水平要求也較高。隨著科學(xué)技術(shù)的發(fā)展，全自動(dòng)定氮儀在生產(chǎn)中的應(yīng)用越來越廣泛。然而，在飼料生產(chǎn)企業(yè)中，依賴人工的半微量定氮法和全自動(dòng)分析儀哪個(gè)更符合生產(chǎn)實(shí)際需要，還存在爭(zhēng)議。因此，本文將對(duì)半微量定氮法和兩種不同型號(hào)的全自動(dòng)凱氏定氮儀檢測(cè)結(jié)果的差異進(jìn)行分析。

1 材料和方法

1.1 儀器與所需試劑

1.1.1 樣品

試驗(yàn)選取魚粉、血粉、水解羽毛粉、豆粕、發(fā)酵豆粕、膨化大豆、棉粕、玉米蛋白粉、DDGS、谷氨酸渣等蛋白質(zhì)飼料原料10種，均購(gòu)于哈爾濱遠(yuǎn)大飼料有限公司。

1.1.2 試驗(yàn)儀器

精密天平（瑞士 METTLER ML303）、消化爐（美國(guó)FOSS 8420）、凱氏燒瓶及蒸餾裝置（玻璃）、全自動(dòng)凱氏定氮儀（美國(guó)FOSS 2300、FOSS 8400）。

1.1.3 所需試劑[1]

（1）消化催化劑：0.4 g五水硫酸銅（化學(xué)純），6 g硫酸鈉（化學(xué)純），磨碎混勻。

（2）NaOH溶液：取NaOH（分析純）400 g溶于1 000 ml蒸餾水配成40%溶液。

（3）硫酸銨：分析純，干燥。

（4）混合指示劑：甲基紅0.1%的乙醇溶液，溴甲酚綠0.5%的乙醇溶液，兩者進(jìn)行等體積混合，置于陰涼處保存，三個(gè)月內(nèi)有效。

（5）全自動(dòng)定氮儀硼酸吸收液：稱取硼酸（分析純）10 g，溶于1 000 ml蒸餾水配制成1%的硼酸溶液，然后加入0.1%甲基紅乙醇溶液7 ml，與0.1%溴甲酚綠乙醇溶液10 ml、4%氫氧化鈉溶液0.5 ml，混合，置陰涼處，保存期為1個(gè)月。

（6）半微量定氮法硼酸吸收液：稱取硼酸（分析純）20 g，溶于1 000 ml蒸餾水配制成2%的硼酸溶液，然后加入甲基紅-溴甲酚綠指示劑待用。

（7）0.1 mol/l鹽酸標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制（半微量定氮法）：8.3 ml濃鹽酸（分析純），緩慢注入1 000 ml水中，搖勻，標(biāo)定后待用。

（8）0.05 mol/l硫酸標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制（全自動(dòng)定氮分析儀）：用量筒量取2.8 ml的濃硫酸（分析純）緩慢注入1 000 ml水中，冷卻，搖勻，標(biāo)定后待用。

（9）蔗糖：分析純。

1.2 測(cè)定方法

1.2.1 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

試驗(yàn)由兩名檢測(cè)員（檢測(cè)員A和檢測(cè)員B）分別采用半微量定氮法和兩種不同型號(hào)的全自動(dòng)定氮儀（FOSS 2300、FOSS 8400）對(duì)樣品進(jìn)行測(cè)定，每名檢測(cè)員試驗(yàn)10種蛋白飼料原料樣品，每種樣品做6個(gè)重復(fù)的粗蛋白質(zhì)含量。

1.2.2 樣品消化

樣品全部由本單位實(shí)驗(yàn)員統(tǒng)一進(jìn)行消化，準(zhǔn)確稱取0.2 g樣品，置于洗滌后烘干的干凈的消化管內(nèi)，然后加入催化劑和10 ml濃硫酸，同時(shí)消化空白樣6個(gè)（蔗糖0.5 g/管）。將消化管放置于消化爐中，溫度先調(diào)至260℃，待消化管中沒有大量濃煙時(shí)，將溫度升至420℃，消化直至澄清，關(guān)閉消化爐電源，保持冷凝水開通，冷卻1～2 h。

1.2.3 硫酸銨回收率

每個(gè)試驗(yàn)組稱取硫酸銨樣品分別放置于6個(gè)消化管中（0.2 g/管），進(jìn)行消化后用凱氏定氮法進(jìn)行測(cè)定。

X=[(V2-V1)×C×0.014]×100/(m×V'/V)。

式中：V1——滴定試樣所需標(biāo)準(zhǔn)溶液的體積；

V2——滴定空白所需標(biāo)準(zhǔn)溶液的體積；

C——標(biāo)準(zhǔn)溶液的濃度；

m——試樣的質(zhì)量；

V——試樣分解液定容體積；

V'——用于蒸餾的分解液的體積。

1.2.4 蒸餾和滴定

半微量定氮法的蒸餾和滴定參考國(guó)標(biāo)GB/T 6432—1994[2]，全自動(dòng)定氮儀按儀器說明書操作。

1.2.5 數(shù)據(jù)分析

試驗(yàn)數(shù)據(jù)先用Microsoft Excel進(jìn)行整理和初步計(jì)算，然后采用SPSS20.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行Duncan's法進(jìn)行多重比較，以各組“平均值±平均標(biāo)準(zhǔn)誤（SEM）”表示，以P＜0.05作為差異顯著性判斷標(biāo)準(zhǔn)。

2 結(jié)果

空白樣消耗酸體積見表1，從表1可以看出，半微量法、FOSS 2033和FOSS 8400各組之間空白樣消耗酸的體積顯著降低（P＜0.05），而且標(biāo)準(zhǔn)誤也逐漸降低。但在同一方法下，兩名檢測(cè)員的空白樣消耗酸的體積沒有顯著差異（P＞0.05）。

表1 空白樣消耗酸體積（ml）

硫酸銨回收率的結(jié)果見表2，兩名檢測(cè)員三個(gè)試驗(yàn)組硫酸銨回收率均沒有顯著差異（P＞0.05），但標(biāo)準(zhǔn)誤有下降趨勢(shì)。

蛋白飼料原料粗蛋白檢測(cè)結(jié)果見表3。從表3中可以看出，F(xiàn)OSS 2300和FOSS 8400的測(cè)定結(jié)果沒有顯著差異（P＞0.05），但相同檢測(cè)項(xiàng)中FOSS 2300的標(biāo)準(zhǔn)誤要高于FOSS 8400。半微量法與全自動(dòng)定氮儀兩組相比，粗蛋白的測(cè)定結(jié)果總體偏低，其中檢測(cè)員A測(cè)定的水解羽毛粉、豆粕顯著低于其他各組（P＜0.05），檢測(cè)員A的DDGS和檢測(cè)員B的玉米蛋白粉的粗蛋白含量顯著高于其他各組（P＜0.05）。而且半微量法的檢測(cè)結(jié)果的標(biāo)準(zhǔn)誤均高于全自動(dòng)定氮儀兩組。

表2 硫酸銨回收率（%）

表3 蛋白飼料原料粗蛋白的測(cè)定結(jié)果

3 討論

粗蛋白質(zhì)的半微量檢測(cè)法在滴定的時(shí)候，滴定管的液體流量完全靠人工控制，顏色的變化和液體的變化往往只在一瞬間，在滴定時(shí)即需要檢測(cè)員對(duì)顏色變化有準(zhǔn)確的判斷，又需要檢測(cè)員能眼疾手快的終止滴定，同時(shí)還要防止氨氣跑掉，這對(duì)經(jīng)驗(yàn)和身體反應(yīng)速度有較高的要求。新手檢測(cè)員身體反應(yīng)速度快，但是往往經(jīng)驗(yàn)不足；而經(jīng)驗(yàn)豐富的檢測(cè)員，隨著年齡的增長(zhǎng)，身體反應(yīng)速度開始逐漸變慢；年富力強(qiáng)而又經(jīng)驗(yàn)豐富的檢測(cè)員的數(shù)量低于實(shí)際生產(chǎn)的需求，長(zhǎng)期高負(fù)荷的進(jìn)行樣品的檢測(cè)，又會(huì)造成工作疲勞，影響檢測(cè)結(jié)果。全自動(dòng)定氮儀采用的比色法判斷液體顏色的變化，在液體顏色達(dá)到設(shè)定值的瞬間，通過電子原件的傳導(dǎo)，終止滴定然后計(jì)數(shù)。因此從理論上，全自動(dòng)定氮儀的檢測(cè)精度更高，工作時(shí)間更長(zhǎng)，更適合生產(chǎn)需求[3]。

各組檢測(cè)員空白樣品的測(cè)定值均小于0.200 0 ml，說明各試驗(yàn)組空白樣品均對(duì)試驗(yàn)結(jié)果無影響。但空白樣品都由第三方實(shí)驗(yàn)員統(tǒng)一預(yù)處理的，而滴定結(jié)果從半微量定氮法到全自動(dòng)定氮儀，呈現(xiàn)顯著下降的趨勢(shì)，而且樣品的平行性也更好。使用滴定管進(jìn)行樣品滴定時(shí)，液體流速在30～50 μl/s，而全自動(dòng)定氮儀的滴定液的流速為3～5 μl/s。因此，全自動(dòng)定氮儀在滴定空白樣品時(shí)，檢測(cè)精度顯著高于人工檢測(cè)。而在本試驗(yàn)兩種不同型號(hào)的全自動(dòng)定氮儀中，F(xiàn)OSS 2300已經(jīng)使用10年，在管路和電子原件均存在老化現(xiàn)象，而FOSS 8400的剛剛使用1年，經(jīng)過磨合后正處于最佳狀態(tài)，因此FOSS 8400的空白樣耗酸量和標(biāo)準(zhǔn)誤均要低于FOSS 2300，說明全自動(dòng)定氮儀隨著使用時(shí)間的增加精確度會(huì)逐漸下降，但其精密度依然高于依賴人工和玻璃器皿的半微量定氮法。

硫酸銨回收率的試驗(yàn)主要是檢測(cè)蒸餾和滴定系統(tǒng)是否達(dá)到要求，其數(shù)值一般要求在99.50%～100.50%之間。從檢測(cè)數(shù)據(jù)分析，半微量法中檢測(cè)員A的檢測(cè)結(jié)果為99.25%，并未達(dá)到系統(tǒng)要求。而半微量法中檢測(cè)員B和兩種不同型號(hào)的全自動(dòng)定氮儀的硫酸銨回收率則均在99.50%以上，完全達(dá)到后續(xù)試驗(yàn)要求。在使用半微量法定氮時(shí)，無論是檢測(cè)員A還是檢測(cè)員B測(cè)定結(jié)果的標(biāo)準(zhǔn)誤都高于全自動(dòng)定氮儀的標(biāo)準(zhǔn)誤。這可能與檢測(cè)系統(tǒng)液體步進(jìn)的差異有關(guān)，全自動(dòng)定氮儀每次滴定時(shí)消耗的酸僅為半微量法的十分之一。因此，全自動(dòng)定氮儀在進(jìn)行樣品檢測(cè)時(shí)，平行性也要好于依賴玻璃器皿的半微量法。這說明以玻璃器皿為主的半微量法檢測(cè)系統(tǒng)在精密度的控制上存在不足，而儀器的老化對(duì)粗蛋白的檢測(cè)結(jié)果和平行性也存在影響。

半微量定氮法需將消化后的液體從消化管中轉(zhuǎn)移到容量瓶中，再用移液管轉(zhuǎn)移到蒸餾瓶中，蒸餾后再對(duì)樣品進(jìn)行滴定，整個(gè)過程對(duì)檢測(cè)員的操作技能的要求比較高，而且反復(fù)的轉(zhuǎn)移也難免會(huì)造成氮元素的損失[4]。而且半微量法的蒸餾過程，整個(gè)管路并不屬于全封閉狀態(tài)，難免會(huì)造成氨氣的損失；而滴定的過程也可能會(huì)因?yàn)闄z測(cè)員經(jīng)驗(yàn)不足或操作失誤而產(chǎn)生誤差，造成樣品測(cè)定結(jié)果偏低或平行性較差[5]。蛋白飼料原料的粗蛋白檢測(cè)結(jié)果看，半微量法中兩名檢測(cè)員對(duì)蛋白質(zhì)飼料原料的測(cè)定結(jié)果總體上低于全自動(dòng)定氮儀，這可能與蒸餾過程中氨氣的損失有關(guān)，這也與硫酸銨回收率的測(cè)定結(jié)果比較一致。而且檢測(cè)員A豆粕和水解羽毛粉的檢測(cè)結(jié)果顯著偏低，則主要是因?yàn)闄z測(cè)員A在這兩個(gè)樣品的蒸餾過程中有1～2個(gè)重復(fù)樣存在密封不嚴(yán)的情況，造成了氨氣的損失。檢測(cè)A和檢測(cè)員B均有一個(gè)樣品測(cè)定結(jié)果顯著偏高，其主要原因是因?yàn)?，兩名檢測(cè)員在滴定過程中，個(gè)別樣品存在滴定過量的情況。在實(shí)際生產(chǎn)中，如果樣品數(shù)量過大，檢測(cè)員進(jìn)入疲勞期的時(shí)候，這種情況是很難避免的。而全自動(dòng)定氮儀在蒸餾過程中，將消化管直接放入蒸餾裝置進(jìn)行蒸餾，因此減少了氨氣的損失，其測(cè)定結(jié)果高于半微量定氮法。

4 結(jié)論

綜合本次試驗(yàn)數(shù)據(jù)，全自動(dòng)定氮儀數(shù)據(jù)的重復(fù)性更好。然而全自動(dòng)定氮儀儀器價(jià)格相對(duì)較高，對(duì)于小型飼料廠來講，飼料檢測(cè)樣品數(shù)量比較少，熟練的檢測(cè)員完全勝任半微量定氮法的檢測(cè)工作。而對(duì)大型飼料廠，產(chǎn)品數(shù)量多，樣品檢測(cè)的壓力較大，要想保證檢測(cè)的速度和質(zhì)量，需要大量的高水平檢測(cè)人員，這時(shí)全自動(dòng)定氮儀的快速、準(zhǔn)確的優(yōu)勢(shì)就凸顯出來，而且機(jī)器不會(huì)出現(xiàn)疲勞現(xiàn)象，配合自動(dòng)進(jìn)樣器，可以做到全天候的工作。因此，對(duì)小型飼料廠，可以短期聘請(qǐng)熟練的檢測(cè)員，半微量的凱氏定氮法節(jié)省成本，同時(shí)加強(qiáng)對(duì)新檢測(cè)員的培訓(xùn)；而大型飼料廠則更適合采用全自動(dòng)定氮儀進(jìn)行檢測(cè)，以滿足大批量生產(chǎn)的需求。