楊文杰,韓麗紅,秦文斌
(1.包頭醫(yī)學(xué)院生物化學(xué)教研室,內(nèi)蒙古包頭 014060;2.包頭醫(yī)學(xué)院基因診斷研究所;3.包頭醫(yī)學(xué)院血紅蛋白研究室)
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從唾液中提取脫氧核糖核酸擴(kuò)增血紅蛋白β基因*
楊文杰1,韓麗紅2,3,秦文斌2,3
(1.包頭醫(yī)學(xué)院生物化學(xué)教研室,內(nèi)蒙古包頭 014060;2.包頭醫(yī)學(xué)院基因診斷研究所;3.包頭醫(yī)學(xué)院血紅蛋白研究室)
目的:探索一種對(duì)人體無(wú)害、無(wú)痛、操作簡(jiǎn)便的獲取基因組脫氧核糖核酸(deoxyribonucleic acid,DNA)的方法。方法:從唾液中提取基因組DNA,應(yīng)用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(polymerase chain reaction,PCR)擴(kuò)增血紅蛋白β基因,采用含溴乙錠的瓊脂糖凝膠電泳鑒定擴(kuò)增產(chǎn)物。結(jié)果:從唾液中提取基因組DNA能夠擴(kuò)增出血紅蛋白β基因。結(jié)論:唾液作為獲取基因組脫氧核糖核酸的簡(jiǎn)易來(lái)源,取樣方法簡(jiǎn)便、快捷,更適用于疾病研究中大規(guī)模群體篩查。
基因組脫氧核糖核酸;聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng);唾液
人的體液攜帶大量信息,其中血、尿、腦脊液已經(jīng)廣泛運(yùn)用于檢測(cè)人體的健康水平和診斷疾病。使用唾液作為檢測(cè)工具可追溯到上世紀(jì)60年代,早期檢測(cè)缺乏準(zhǔn)確性和標(biāo)準(zhǔn)性,隨著蛋白質(zhì)組學(xué)及基因組學(xué)技術(shù)的發(fā)展,唾液中重要成分的發(fā)現(xiàn)以及唾液收集方法的改進(jìn),使得唾液成為疾病檢測(cè)的工具成為可能。唾液具有取樣方便且安全無(wú)創(chuàng)傷,可反復(fù)采集提取等優(yōu)點(diǎn),對(duì)疾病的早期診斷、早期治療及預(yù)后監(jiān)測(cè)具有重要的實(shí)用價(jià)值,并可方便地用于對(duì)高危人群的普查篩選[1]。
聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(polymerase chain reaction,PCR)是體外酶促合成特異DNA片段的一種方法,為最常用的分子生物學(xué)技術(shù)之一。PCR能快速特異擴(kuò)增任何已知目的基因或DNA片段,并能輕易地將DNA混合物中皮克水平的目的基因大量擴(kuò)增,從而達(dá)到納克、微克、毫克級(jí)的特異性脫氧核糖核酸(deoxyribonucleic acid,DNA)片段。因此,PCR技術(shù)一經(jīng)問(wèn)世就被迅速而廣泛地用于分子生物學(xué)的各個(gè)領(lǐng)域。它不僅可以用于基因的分離、克隆和核苷酸序列分析,還可以用于突變體和重組體的構(gòu)建,基因表達(dá)調(diào)控的研究,基因多態(tài)性的分析,遺傳病和傳染病的診斷,腫瘤機(jī)制的探索,法醫(yī)鑒定等諸多方面。
本實(shí)驗(yàn)應(yīng)用PCR技術(shù)從人群唾液樣本中提取基因組DNA,應(yīng)用PCR技術(shù)擴(kuò)增β珠蛋白基因片段,探索一種對(duì)人體無(wú)害、無(wú)痛、操作簡(jiǎn)便的獲取基因組DNA的方法。
1.1標(biāo)本的采集 囑樣本提供者在提取唾液前30 min內(nèi),勿進(jìn)食、飲水、吸煙或嚼口香糖。在吐唾液之前,放松臉頰,輕揉30 s以產(chǎn)生唾液。向唾液樣本采集管中輕輕地吐入口腔內(nèi)分泌的唾液,收集唾液時(shí)應(yīng)注意盡量避免出現(xiàn)過(guò)多的泡沫。
1.2儀器 PCR儀、臺(tái)式高速離心機(jī)、電泳儀、電泳槽、微量移液器、紫外燈檢測(cè)儀、微波爐。
1.3試劑 裂解液(由包頭醫(yī)學(xué)院基因診斷研究所秦文斌教授提供)、10 mmol/L三羥甲基氨基甲烷-鹽酸(pH 8.3)、50 mmol/L氯化鉀、2 mmol/L氯化鎂,10 mmol/L硫酸銨、4種脫氧核糖核酸各200 μmol/L、10 mg/mL溴乙錠、電泳緩沖液、Taq DNA聚合酶、液體石臘、瓊脂糖、去離子水。
1.4方法
1.4.1從唾液中提取基因組DNA 取0.1 mL唾液加入到EP管中,2 000 轉(zhuǎn)/min離心10 min,棄上清。加入裂解液60 μL,劇烈震蕩2 min,沸水浴中煮沸10 min,12 000 轉(zhuǎn)/min離心10 min,上清液中即含有基因組DNA。
1.4.2PCR擴(kuò)增 以血紅蛋白β基因?yàn)槟0遄孕性O(shè)計(jì)引物,擴(kuò)增Hbβ基因的400 bpDNA片段。引物l:5’-AAG GAG ACC AAT AGA AAC TGG GC-3’;引物2:5’-TCT CCC CTT CCT ATG ACA TGA AC-3’。向20 μL PCR反應(yīng)液中加入5 μL模板,反應(yīng)總體積為25 μL。混勻離心后后加入液體石臘1滴。反應(yīng)條件為94 ℃預(yù)變性2 min;35個(gè)循環(huán)(94 ℃變性30 s、55 ℃退火30 s、72 ℃延伸45 s);72 ℃延伸10 min。
1.4.3擴(kuò)增產(chǎn)物的檢測(cè) 將凝膠托架兩端封閉,水平放置在工作臺(tái)上,放上梳子。用0.5×電泳緩沖液配制1.5 %瓊脂糖凝膠,加熱溶解后灌入凝膠板中。待凝膠凝固后,小心拔出梳子。將托架放入電泳槽中,加入0.5×TBE緩沖液,使之沒(méi)過(guò)膠面2 mm,拔出梳子。向PCR產(chǎn)物中加入5 μL載樣緩沖液,混勻,取10 μL加入凝膠樣品孔中。蓋上電泳槽,接通電源,樣品端接陰極,電泳15~20 min(電壓100 V)。在紫外燈(波長(zhǎng)302 nm)下觀察電泳結(jié)果。
從唾液中提取基因組DNA,應(yīng)用PCR技術(shù)能夠擴(kuò)增出血紅蛋白β基因。見(jiàn)圖1。
唾液中含有豐富的DNA,是樣品采集的優(yōu)質(zhì)來(lái)源。唾液樣本采集是一種對(duì)人體無(wú)害、無(wú)痛的獲取DNA的方法。該法不會(huì)對(duì)被收集者造成任何不適,容易被接受,因而能最大限度地?cái)U(kuò)大基因研究的取樣范圍,特別適合分子流行病學(xué)的大規(guī)模人群樣本采集。常溫下唾液樣本DNA可以保存多年,綠色環(huán)保,攜帶方便。唾液作為全身體液的一種,不僅含有多種蛋白質(zhì),還含有核糖核酸、DNA、脂肪酸以及各種微生物等。
本實(shí)驗(yàn)中利用裂解液從唾液中提取基因組DNA,方法簡(jiǎn)單,操作簡(jiǎn)便,用時(shí)短,結(jié)果好。使用唾液作為診斷體液,具有收集簡(jiǎn)便、無(wú)創(chuàng)、費(fèi)用低廉等諸多優(yōu)點(diǎn)。人的體液攜帶大量蛋白質(zhì)和遺傳物質(zhì)。近年來(lái),使用血液作為診斷體液,通過(guò)高通量生物質(zhì)譜技術(shù)研究疾病蛋白質(zhì)組學(xué)、尋找疾病標(biāo)志物已經(jīng)得到廣泛研究[2]。應(yīng)用基因組學(xué)和蛋白質(zhì)組學(xué)新手段,對(duì)唾液中的蛋白質(zhì)、核酸、微生物進(jìn)一步進(jìn)行研究,有望找到實(shí)用的相關(guān)診斷和治療的標(biāo)志物。隨著技術(shù)的不斷創(chuàng)新和研究的繼續(xù)深入,可以預(yù)見(jiàn)唾液作為檢測(cè)工具與血液相比具有安全、無(wú)創(chuàng)、數(shù)量充足、可持續(xù)獲取等優(yōu)勢(shì),適用于龐大的群體篩查[3]。
[1] 陳嘉昌,張紅宇,彭瑾瑜,等.從唾液獲取人體DNA的簡(jiǎn)易方法與應(yīng)用[J].中山大學(xué)學(xué)報(bào)(醫(yī)學(xué)科學(xué)版),2006,27(S2):171-173.
[2] 陳婷,吳補(bǔ)領(lǐng),高杰,等.口腔微生物宏基因組學(xué)總DNA制備的方法學(xué)初探[J].臨床口腔醫(yī)學(xué)雜志,2011,27(3):144-147.
[3] Loo JA,Yan W,Ramachandran P,et al.Comparative human salivary and plasma proteomes[J].J Dent Res,2010,89(10):1016-1023.
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Amplification of hemoglobin β gene by DNA extracted from saliva
YANG Wenjie1, HAN Lihong2,3, QIN Wenbin2,3
(1.BiochemistryTeachingandResearchSectionofBaotouMedicalCollege,Baotou014040,China;2.GeneticDiagnosisInstituteofBaotouMedicalCollege,Baotou014040,China; 3.HemoglobinLaboratoryofBaotouMedicalCollege,Baotou014040,China)
Objective:To explore a harmless, painless and easily-operated method for genomic deoxyribonucleic acid (DNA). Methods:Genomic DNA was extracted from saliva. Polymerase chain reaction (PCR) was applied to amplify hemoglobin β gene, and the amplification products were identified by agarose gel electrophoresis containing ethidium bromide. Results:The genomic DNA extracted from saliva can amplify the hemoglobin β gene. Conclusion:Saliva is a simple source of genomic DNA. The method is simple and fast, and may be used for screening on a large scale.
Genome deoxyribonucleic acid (DNA); Polymerase chain reaction; Saliva
包頭市科技計(jì)劃項(xiàng)目(2015S2004-8),包頭醫(yī)學(xué)院博士科研啟動(dòng)基金項(xiàng)目(BSJJ201605)
秦文斌
2016-06-15)