朱慶超，郭奇奇，王艷華,2，姜雪梅，方 乾，李 浩，胡建宏

(1．西北農(nóng)林科技大學(xué) 動物科技學(xué)院，陜西楊凌 712100；2．拉薩市動物疫病預(yù)防控制中心，拉薩 850000)

不同冷凍保護(hù)劑對羔羊睪丸組織冷凍效果的影響

朱慶超1，郭奇奇1，王艷華1,2，姜雪梅1，方 乾1，李 浩1，胡建宏1

(1．西北農(nóng)林科技大學(xué) 動物科技學(xué)院，陜西楊凌 712100；2．拉薩市動物疫病預(yù)防控制中心，拉薩 850000)

為探討非滲透性冷凍保護(hù)劑與滲透性冷凍保護(hù)劑配伍對羔羊睪丸組織冷凍效果的影響，以φ=10% DMSO、φ=10% EG、φ=10% DMSO+5 g/L BSA和φ=10% EG+5 g/L BSA為冷凍保護(hù)劑，測定冷凍前后羔羊睪丸組織的細(xì)胞活率、曲細(xì)精管完整率、睪酮濃度、抑制素質(zhì)量濃度以及堿性磷酸酶(AKP)和酸性磷酸酶(ACP)活性。結(jié)果表明，φ=10% DMSO+5 g/L BSA組的細(xì)胞活率、曲細(xì)精管完整率、睪酮濃度、抑制素的質(zhì)量濃度及AKP和ACP活性均顯著高于其他處理組，但顯著低于對照組(新鮮組織)；φ=10% EG+5 g/L BSA組與φ=10% DMSO組的AKP和ACP活性差異不顯著，但均顯著高于φ=10% EG組。說明φ=10% DMSO中添加5 g/L的BSA能有效改善羔羊睪丸組織的冷凍效果。

羔羊；睪丸組織；冷凍保存；冷凍保護(hù)劑

睪丸組織的成功冷凍保存不僅為瀕危野生動物[1-2]和優(yōu)良家畜的生殖能力保存提供有效途徑，也為恢復(fù)未成年男性癌癥患者生殖能力提供新的選擇[3]。因此，建立睪丸組織低損傷冷凍保存技術(shù)體系具有重要的理論和實踐意義。

在冷凍保存過程中，冷凍保護(hù)劑對于防止睪丸組織的冷凍損傷發(fā)揮重要作用。Yildiz等[4]研究報道，冷凍保護(hù)劑的類型對于冷凍并且移植到小鼠體內(nèi)的睪丸組織的精子發(fā)生和類固醇合成具有顯著影響。Yang等[5]研究表明，冷凍保護(hù)液的成分對于凍后睪丸組織的細(xì)胞活率和組織形態(tài)具有顯著影響。目前使用的睪丸組織冷凍保護(hù)劑主要屬于滲透性冷凍保護(hù)劑，滲透性保護(hù)劑多是一些小分子物質(zhì)，可以透過細(xì)胞膜滲透到細(xì)胞內(nèi)，主要包括二甲基亞砜(DMSO)、甘油、乙二醇(EG)等。唐立新等[6]研究表明，用DMSO作低溫保護(hù)劑對大鼠睪丸組織形態(tài)特征的保護(hù)效果優(yōu)于甘油和丙二醇；Yildiz等[4]比較DMSO、EG、丙二醇和甘油對小鼠睪丸的冷凍效果，認(rèn)為經(jīng)過DMSO冷凍的睪丸組織移植到小鼠皮下后，其組織成活率、曲細(xì)精管完整性以及睪酮濃度均顯著高于其他冷凍組。Jahnukainen等[7]研究報道，1.4 mol/L的DMSO能很好地保護(hù)恒河猴的睪丸組織；Wyns等[8]研究指出，0.7 mol/L的DMSO能成功保存人的睪丸組織；在豬的睪丸組織冷凍保存過程中，甘油的保護(hù)效果優(yōu)于DMSO和EG[9]。

非滲透性冷凍保護(hù)劑多是大分子物質(zhì)，如糖類和蛋白類，不能滲透到細(xì)胞內(nèi)，對細(xì)胞無毒副作用。牛血清白蛋白(BSA)由580多個氨基酸組成，具有復(fù)雜的三維分子形狀，能與多種細(xì)胞代謝產(chǎn)物相結(jié)合，是一種常用的非滲透性冷凍保護(hù)劑[10]。Naijian等[11]研究報道，10或15 g/L的BSA 能顯著提高凍后山羊精子的活率。Lee等[12]研究表明，在冷凍保護(hù)液(α-MEM，DMSO，胎牛血清)中添加海藻糖能顯著提高睪丸組織中生殖細(xì)胞的冷凍效果；王曉英[13]研究認(rèn)為，在DMSO中添加蔗糖對精原細(xì)胞的冷凍保存效果明顯優(yōu)于DMSO和甘油。然而，在滲透性冷凍保護(hù)劑中添加BSA對睪丸組織的冷凍效果研究還未見報道。

為研究BSA與滲透性冷凍保護(hù)劑配伍對羔羊睪丸組織冷凍效果的影響，本試驗以DMSO、EG、DMSO+BSA以及EG+BSA作為冷凍保護(hù)劑(DMSO與φ=10% EG，參照洪潔赟等[10]研究方法；BSA質(zhì)量濃度設(shè)為5 g/L，參照Naijian等[11]和洪潔赟等[10]研究方法)，通過測定冷凍前后羔羊睪丸組織的細(xì)胞活率、曲細(xì)精管完整性、睪酮濃度、抑制素質(zhì)量濃度、堿性磷酸酶(AKP)和酸性磷酸酶(ACP)活性，分析不同冷凍保護(hù)劑對凍后睪丸組織活性的影響，為長期保存雄性動物的生殖能力提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 樣品的收集

羔羊的睪丸組織采自陜西富平。采集2月齡左右關(guān)中奶山羊的左右兩側(cè)睪丸組織(8個)，置于保溫杯中，迅速加入預(yù)冷(4 ℃)的含有雙抗(青霉素-鏈霉素)的磷酸鹽緩沖液(PBS)，2 h內(nèi)帶回實驗室。

1.2 羔羊睪丸組織的冷凍與解凍

用酒精棉球擦洗睪丸表面，然后用PBS清洗3次，在超凈工作臺中去除脂肪墊、微血管、附睪以及白膜等，將生精小管用剪刀剪碎至2～5 mm3，將切碎的睪丸組織塊混勻，平均分成5組，1組直接用于測定細(xì)胞活率、苦味酸固定和組織培養(yǎng)(新鮮睪丸組織為對照組)，另外4組分別添加4種冷凍保護(hù)劑(冷凍保護(hù)劑的配制見表1)，經(jīng)逐步冷凍法(4 ℃ 2 h，-20 ℃ 2 h，-80 ℃ 12 h處理后投入液氮)冷凍保存。睪丸組織冷凍保存1個月后，從液氮罐中取出凍存管，迅速置于37 ℃的水浴鍋中復(fù)溫，直至睪丸組織全部融化。解凍完全后，用PBS清洗3次，徹底洗去冷凍保護(hù)劑。

表1 冷凍保護(hù)劑的成分

注：BSA為0.05 g/mL，青霉素為10 000 U/mL，鏈霉素為10 000 μg/mL。

Note: The concentration of BSA, penicillin, and streptomycin were 0.05 g/mL, 10 000 U/mL and 10 000 μg/mL, respectively.

1.3 細(xì)胞活率、曲細(xì)精管完整率測定

睪丸組織解凍后，經(jīng)2步酶消化法(IV型膠原酶-胰蛋白酶)獲得單細(xì)胞懸液，將細(xì)胞密度調(diào)整至106mL-1，采用臺盼藍(lán)拒染法測細(xì)胞活率?；旌弦簽閂(細(xì)胞懸液)∶V(4 g/L的臺盼藍(lán)溶液)=9∶1。經(jīng)臺盼藍(lán)染色后，立刻在光學(xué)顯微鏡下計數(shù)染成藍(lán)色和未染色細(xì)胞，死細(xì)胞被染成淡藍(lán)色，而活細(xì)胞未染色?；罴?xì)胞率(%)=活細(xì)胞總數(shù)/(活細(xì)胞總數(shù)+死細(xì)胞總數(shù))×100%。

解凍后，用苦味酸溶液[V(苦味酸飽和液)∶V(甲醛)∶V(冰乙酸)=15∶4∶1]將睪丸組織固定過夜，用PBS清洗3次，進(jìn)行常規(guī)石蠟包埋(脫水、透明、浸蠟、包埋)，切片(6 μm)，蘇木精-伊紅染色，最后在顯微鏡下統(tǒng)計曲細(xì)精管完整率。曲細(xì)精管完整率(%)=完整曲細(xì)精管數(shù)/(完整曲細(xì)精管數(shù)+損傷曲細(xì)精管數(shù))×100%。

1.4 睪丸組織的體外培養(yǎng)

將凍后的睪丸組織移入培養(yǎng)皿中，加入含φ=15%的胎牛血清、100 U/mL青霉素和100 μg/mL 鏈霉素的α-MEM，33 ℃、φ=5% CO2無菌培養(yǎng)24 h，收集培養(yǎng)基，-20 ℃冰箱保存，用于測定睪酮濃度和抑制素質(zhì)量濃度，培養(yǎng)后的睪丸組織用于測定AKP和ACP活性。

1.5 睪酮濃度和抑制素質(zhì)量濃度測定

采用酶聯(lián)免疫反應(yīng)(ELISA)試劑盒檢測組織培養(yǎng)基中的睪酮濃度和抑制素質(zhì)量濃度，嚴(yán)格按照羊睪酮和抑制素試劑盒說明書操作。用酶標(biāo)儀在450 nm波長下測定睪酮和抑制素的吸光度(OD值)，通過標(biāo)準(zhǔn)曲線計算樣品中睪酮濃度(nmol/L)和抑制素質(zhì)量濃度(ng/L)。

1.6 AKP和ACP活性測定

將培養(yǎng)后的睪丸組織用PBS清洗3次，濾紙吸干水分，稱質(zhì)量，然后加入φ=0.86%的生理鹽水(生理鹽水的體積∶組織塊質(zhì)量=1∶9)，勻漿，2 000 r/min離心10 min，取上清，用于測定組織中AKP和ACP的活性。AKP和ACP的測定按試劑盒說明書進(jìn)行，在520 nm下測吸光度(OD值)，單位用U/gprot表示。

1.7 數(shù)據(jù)分析

每個試驗處理重復(fù)3次，所有結(jié)果均用“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”表示。利用SPSS 17.0進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析，采用單因素方差分析進(jìn)行顯著性檢驗。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同冷凍保護(hù)劑對凍后睪丸組織細(xì)胞活率和曲細(xì)精管完整性的影響

不同冷凍保護(hù)劑下凍后睪丸組織的細(xì)胞活率和曲細(xì)精管完整率見表2。從表2可以看出，在羔羊睪丸組織中添加DMSO+BSA，解凍后細(xì)胞活率和曲細(xì)精管完整率顯著高于其他冷凍保護(hù)劑(P<0.05)，但顯著低于對照組(P<0.05)。EG處理組的細(xì)胞活率和曲細(xì)精管完整率最低，顯著低于對照組和其他處理組(P<0.05)。另外，DMSO組和EG+BSA處理組的細(xì)胞活率和曲細(xì)精管完整率差異不顯著(P>0.05)。

2.2 不同冷凍保護(hù)劑對凍后睪丸組織中睪酮濃度和抑制素質(zhì)量濃度的影響

從表3可以看出，DMSO+BSA組的睪酮濃度和抑制素質(zhì)量濃度顯著高于其他冷凍保護(hù)劑(P<0.05)，但顯著低于對照組(P<0.05)。EG處理組的睪酮濃度和抑制素質(zhì)量濃度最低，顯著低于對照組和其他處理組(P<0.05)。另外，DMSO組的睪酮濃度顯著高于EG+BSA組(P<0.05)，但抑制素質(zhì)量濃度差異不顯著(P>0.05)。

表2 不同冷凍保護(hù)劑下凍后羔羊睪丸組織的細(xì)胞活率和曲細(xì)精管完整率

注：同行不同字母表示差異顯著(P<0.05)。下同。

Notes: Different letters in the same line mean significant difference atP<0.05.The same as below.

表3 不同冷凍保護(hù)劑下凍后睪丸組織的睪酮濃度和抑制素質(zhì)量濃度

2.3 不同冷凍保護(hù)劑對羔羊睪丸組織AKP和ACP活性的影響

從表4可以看出，對照組中AKP和ACP活性顯著高于處理組(P<0.05)。在處理組中，DMSO+BSA組的AKP和ACP活性最高，顯著高于其他處理組(P<0.05)。DMSO組的AKP和ACP的活性與EG+BSA組差異不顯著(P>0.05)，但顯著高于EG處理組(P<0.05)。EG處理組的2種酶活性最低。

表4 不同冷凍保護(hù)劑下冷凍保存后睪丸組織的AKP和ACP活性

3 討 論

未成年動物的睪丸組織冷凍保存可以為動物繁殖能力的保存提供一個新的途徑。但是，目前關(guān)于睪丸組織冷凍保護(hù)劑的研究多集中在滲透性冷凍保護(hù)劑，而滲透性冷凍保護(hù)劑中添加非滲透性冷凍保護(hù)劑的研究比較少。BSA是一種低密度蛋白質(zhì)，經(jīng)常在精子的冷凍保存過程中添加，并取得顯著效果[10, 14]。在本研究中，0.05 g/mL的BSA被分別添加到φ=10% DMSO和φ=10% EG中，旨在研究滲透性冷凍保護(hù)劑與非滲透性冷凍保護(hù)劑的配伍組合對羔羊睪丸組織凍后活性的影響。結(jié)果顯示，φ=10% DMSO中添加5 g/L BSA對羔羊睪丸組織的冷凍效果最好，冷凍保存后羔羊睪丸組織的細(xì)胞活率、曲細(xì)精管完整率、睪酮濃度、抑制素質(zhì)量濃度以及AKP和ACP活性均顯著高于其他冷凍保護(hù)劑，與洪潔赟等[10]的研究結(jié)果一致。

在冷凍過程中，細(xì)胞內(nèi)會產(chǎn)生冰晶，而冰晶會通過物理損傷如刺破細(xì)胞膜，或者化學(xué)損傷如引起細(xì)胞內(nèi)外的滲透壓變化而損傷細(xì)胞。DMSO和EG屬于滲透性冷凍保護(hù)劑，能夠滲透到細(xì)胞內(nèi)，并置換出細(xì)胞內(nèi)部的水分，不僅能夠保持細(xì)胞內(nèi)部的滲透壓，同時可以減少細(xì)胞內(nèi)外冰晶的形成，進(jìn)而保護(hù)細(xì)胞免受損傷[15]。Anchordoguy等[16]研究報道，與EG相比，DMSO的分子質(zhì)量更低，具有更好的滲透性。洪潔赟等[10]研究表明，牛睪丸組織冷凍保存1周后，DMSO組的AKP和ACP活性顯著高于EG組；Yildiz等[4]比較DMSO和EG對小鼠睪丸的冷凍效果，認(rèn)為經(jīng)過DMSO冷凍的睪丸組織移植到小鼠皮下后，其組織成活率、曲細(xì)精管完整性以及睪酮含量均顯著高于EG組，與本研究結(jié)果一致。在本研究中，DMSO組的細(xì)胞活率、曲細(xì)精管完整率、睪酮濃度、抑制素質(zhì)量濃度以及AKP和ACP活性均高于EG組，可能是由于DMSO的滲透性比EG強(qiáng)，更容易滲透到細(xì)胞內(nèi)，從而減少細(xì)胞內(nèi)冰晶的形成。另外，在冷凍過程中，DMSO可能會通過靜電作用來保持細(xì)胞膜磷脂的穩(wěn)定性，減少細(xì)胞膜的冷凍損傷[16]。所以，DMSO對羔羊睪丸組織的冷凍保護(hù)效果優(yōu)于EG。

細(xì)胞膜的流動性是保持細(xì)胞正常生理活性的基礎(chǔ)，細(xì)胞在冷凍過程中防止冰晶形成后，對細(xì)胞膜的保護(hù)就顯得尤為重要。本研究中，在DMSO中添加5 g/L的BSA起到很好的效果，其凍后的細(xì)胞活率、曲細(xì)精管完整率、睪酮濃度、抑制素質(zhì)量濃度以及AKP和ACP活性均顯著高于其他冷凍組。Naijian等[11]研究報道，10或15 g/L的BSA能顯著提高凍后羊精子活率；昝林森等[14]研究表明，1 g/L的BSA添加量可以顯著提高凍后牛精子的活率和質(zhì)膜完整率，但對頂體完整率無顯著影響，與本研究結(jié)果相似。白蛋白是血清的主要蛋白質(zhì)，具有緩沖pH變化、調(diào)節(jié)滲透壓、保護(hù)細(xì)胞免受機(jī)械損傷，攜帶激素、生長因子、脂溶性維生素、藥物、微量元素等作用。Waston[17]認(rèn)為，BSA可以溶解磷脂使細(xì)胞膜具有一定的流動性，減少膜脂在冷凍過程中的損傷，從而增強(qiáng)膜的滲透性，緩解由滲透壓變化而造成的細(xì)胞膜損傷[18]。機(jī)體細(xì)胞在應(yīng)激、缺氧、低溫等情況下會產(chǎn)生過多活性氧[19]，能快速直接使其他分子發(fā)生氧化，進(jìn)而使其結(jié)構(gòu)和功能發(fā)生改變，最終導(dǎo)致細(xì)胞損傷[20]。BSA能清除氧化應(yīng)激產(chǎn)生的氧化自由基，保護(hù)細(xì)胞膜免受熱應(yīng)激和脂質(zhì)過氧化[21]。另外，在睪丸組織平衡過程中(4 ℃)，BSA可能為睪丸組織內(nèi)的不同細(xì)胞提供一些有益成分，例如能量物質(zhì)或小分子[22]。因此，在滲透性冷凍保護(hù)劑中添加BSA顯著提高凍后睪丸組織的細(xì)胞活率，可能是由于BSA增加細(xì)胞膜的流動性，減少細(xì)胞的氧化損傷以及在組織平衡過程中為細(xì)胞提供一些有益成分。細(xì)胞活率的提高必然會加固細(xì)胞之間的連接作用，因此，曲細(xì)精管完整率也會相應(yīng)提高。睪酮是血液循環(huán)中最主要的雄性激素，主要由睪丸間質(zhì)細(xì)胞分泌，抑制素能特異地作用于垂體，抑制卵泡刺激素的合成和分泌，主要由睪丸的支持細(xì)胞分泌。本研究中，DMSO+BSA組的睪酮濃度和抑制素質(zhì)量濃度均顯著高于其他組，說明BSA的添加對睪丸間質(zhì)細(xì)胞和支持細(xì)胞具有很好的保護(hù)作用，從而提高睪酮濃度和抑制素質(zhì)量濃度。滲透性冷凍保護(hù)劑對細(xì)胞或者組織有一定的毒害作用，導(dǎo)致組織或者細(xì)胞不能長時間暴露在保護(hù)劑中，因為滲透性冷凍保護(hù)劑會破壞細(xì)胞通路，導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)的酶變性，產(chǎn)生具有毒性的甲醛等[23-24]。AKP的活性在精原細(xì)胞和早期發(fā)育時期的初級精母細(xì)胞較強(qiáng)，與睪丸內(nèi)生精細(xì)胞的分裂活動及葡萄糖向各級生精細(xì)胞的轉(zhuǎn)運(yùn)有關(guān)[25]。ACP 主要分布于睪丸支持細(xì)胞的胞漿內(nèi)，是支持細(xì)胞溶酶體的特異酶，可使己糖磷酸酯脫磷酸成果糖[26]。本研究中，DMSO組和EG組的AKP和ACP 活性降低，可能是由于滲透性冷凍保護(hù)劑的毒性導(dǎo)致AKP和ACP的變性。而DMSO+BSA組的AKP和ACP活性較高，可能是由于DMSO和BSA發(fā)生互補(bǔ)和協(xié)作效應(yīng)，降低DMSO的毒性。

4 結(jié) 論

本研究結(jié)果表明，在φ=10%的DMSO 中添加5 g/L的BSA顯著增加羔羊睪丸組織冷凍解凍后的細(xì)胞活率、曲細(xì)精管完整率、睪酮濃度、抑制素質(zhì)量濃度以及AKP和ACP活性，說明在滲透性冷凍保護(hù)劑中添加BSA能夠有效改善睪丸組織的冷凍效果。

Reference：

[1] THUWANUT P,CHATDARONG K.Cryopreservation of cat testicular tissues:effects of storage temperature,freezing protocols and cryoprotective agents[J].ReproductioninDomesticAnimals,2012,47(5):777-781.

[2] KANEKO H,KIKUCHI K,NAKAI M,etal.Generation of live piglets for the first time using sperm retrieved from immature testicular tissue cryopreserved and grafted into nude mice[J].PLoSONE,2005,8(7):1-8.

[3] KEROS V,ROSENLUND B,HULTENBY K,etal.Optimizing cryopreservation of human testicular tissue:comparison of protocols with glycerol,propanediol and dimethylsulphoxide as cryoprotectants[J].HumanReproduction,2005,20(6):1676-1687.

[4] YILDIZ C,MULLEN B,JARVI K,etal.Effect of different cryoprotectant agents on spermatogenesis efficiency in cryopreserved and grafted neonatal mouse testicular tissue[J].Cryobiology,2013,67(1):70-75.

[5] YANG Y F,JORDON S,ALI H.The effects of tissue sample size and media on short-term hypothermic preservation of porcine testis tissue[J].CellandTissueResearch,2010,340(2):397-406.

[6] 唐立新,江 芳,范雙喜,等.比較四種冷凍保護(hù)劑對大鼠睪丸組織結(jié)構(gòu)的保護(hù)作用[J].中國男科學(xué)雜志,2009,23(4):10-13.

TANG L X,JIANG F,FAN SH X,etal.Analysis of the influence of four different cryoprotectants on the morphological structure of rat testicular tissue[J].ChineseJournalofAndrology,2009,23(4):10-13(in Chinese with English abstract).

[7] JAHNUKAINEN K,EHMCHE J,HERGENROTHER S D,etal.Effect of cold storage and cryopreservation of immature non-human primate testicular tissue on spermatogonial stem cell potential in xenografts[J].HumanReproduction,2007,22(4):1060-1067.

[8] WYNS C,CURABA M,MARTINEZ-MADRID B,etal.Spermatogonial survival after cryopreservation and short-term orthotopic immature human cryptorchid testicular tissue grafting to immunodeficient mice[J].HumanReproduction,2007,22(6):1603-1611.

[9] ABRISHAMI M,ANZAR M,YANG Y,etal.Cryopreservation of immature porcine testis tissue to maintain its developmental potential after xenografting into recipient mice[J].Theriogenology,2010,73(1):86-89.

[10] 洪潔赟,王春偉,尚 華,等.冷凍保護(hù)劑對犢牛睪丸組織標(biāo)志性酶活性的保護(hù)作用[J].西北農(nóng)業(yè)學(xué)報,2014,23(10):29-37.

HONG J Y,WANG CH W,SHANG H,etal.Protective effect of cryoprotectants on the activities of calf testicular tissue iconic enzymes[J].ActaAgriculturaeBoreali-OccidentalisSinica,2014,23(10):29-37(in Chinese with English abstract).

[11] NAIJIAN H R,KOHARAM H,ZARE SHAHNEH A,etal.Effects of various concentrations of BSA on microscopic and oxidative parameters of Mahabadi goat semen following the freeze-thaw process[J].SmallRuminantResearch,2013,113(2/3):371-375.

[12] LEE Y A,KIM Y H,HA S J,etal.Cryopreservation of porcine spermatogonial stem cells by slow-freezing testis tissue in trehalose[J].JournalofAnimalScience,2014,92(3):984-995.

[13] 王曉英.不同冷凍保護(hù)劑對未成熟小鼠睪丸組織的保護(hù)作用[D].石家莊:河北醫(yī)科大學(xué),2010.

WANG X Y.The protective effects of different cryoprotectants on mice immature testicular tissue[D].Shijiazhuang:Heibei Medical University,2010(in Chinese with English abstract).

[14] 昝林森,張鶯鶯,耿繁軍,等.海藻糖和牛血清白蛋白對牛精液的冷凍效果[J].西北農(nóng)林科技大學(xué)學(xué)報(自然科學(xué)版),2008,36(10):53-58.

ZAN L S,ZAHNG Y Y,GENG F J,etal.Effects of trehalose and BSA on bull sperm cryopreservation[J].JournalofNorthwestA&FUniversity(NaturalScienceEdition),2008,36(10):53-58(in Chinese with English abstract).

[15] FULLER B J.Cryoprotectants:the essential antifreezes to protect life in the frozen state[J].Cryoletters,2004,25(6):375-388.

[16] ANCHORDOGUY T J,RUDOLPH A S,CARPENTER J F,etal.Modes of interaction of cryoprotectants with membrane phospholipids during freezing[J].Cryobiology,1987,24(4):324-331.

[17] WASTON P F.The roles of lipid and protein in the protection of ram spermatozoa at 59 ℃ by egg yolk lipoprotein[J].Reproduction,1981,62(2):483-492.

[18] 關(guān) 沫,楊世華,司 維,等.牛血清白蛋白對小鼠原核期胚胎玻璃化冷凍的影響[J].動物學(xué)研究,2005,26(2):197-202.

GUAN M,YANG SH H,SI W,etal.Effect of bovine serum albumin on vitrification of pronuclear-Stage mouse embryo[J].ZoologicalResearch,2005,26(2):197-202(in Chinese with English abstract).

[19] TATONE C,AMICARELLI F.The aging ovary-the poor granulosa cells[J].FertilityandSterility,2013,99(1):12-17.

[20] AGARWAL A,GUPTA S,SHARMA R K.Role of oxidative stress in female reproduction[J].ReproductiveBiologyandEndocrinology,2005,3(1):1-21.

[21] UYSAL O,KORKMAZ T,TOSUN H.Effect of bovine serum albumine on freezing of canine semen[J].IndianVeterinaryJournal,2005,82(1):97-98.

[22] BAVISTER B D,LEIBFRIED M L,LIEBERMAN G.Development of preimplantation embryos of the golden hamster in a defined culture medium[J].BiologyofReproduction,1983,28(1):245-247.

[23] SHALUEI F,IMANPOOR M R,SHABANI A,etal.Effect of different concentrations of permeable and non-permeable cryoprotectants on the hatching rate of goldfish(Carassiusauratus) embryos[J].AsianPacificJournalofReproduction,2013,2(3):185-188.

[24] JENNIFER L,JACQUELINE M,LUKE K,etal.Inhibiting ice recrystallization and optimization of cell viability after cryopreservation[J].Glycobiology,2012,22(1):123-133.

[25] 季宇彬,蔣 暉,郎 朗,等.甲苯二異氰酸酯致小鼠睪丸脂質(zhì)過氧化損傷及標(biāo)志酶活力的變化[J].毒理學(xué)雜志,2005,19(3):225-226.

JI Y B,JIANG H,LANG L,etal.The effect of toluene diisocyanate on lipid peroxidative damage and marker enzyme of mouse testicular tissue[J].JournalofToxicology,2005,19(3):225-226(in Chinese).

[26] 駱永偉,施 暢,楊保華,等.MC004對大鼠睪丸組織結(jié)構(gòu)和酶活力的影響[J].毒理學(xué)雜志,2009,23(5):345-348.

LUO Y W,SHI CH,YANG B H,etal.Effects of MC004 on activities of enzymes and histological structure in testes of rats[J].JournalofToxicology,2009,23(5):345-348(in Chinese with English abstract).

(責(zé)任編輯：顧玉蘭 Responsible editor:GU Yulan)

Effect of Different Cryoprotectants on Activity of Cryopreserved Lamb Testicular Tissue

ZHU Qingchao1, GUO Qiqi1, WANG Yanhua1,2, JIANG Xuemei1,FANG Qian1, LI Hao1and HU Jianhong1

(1. College of Animal Science and Technology, Northwest A&F University, Yangling Shaanxi 712100, China;2. Animal Disease Prevention and Control Center of Lhasa City,Tibet 850000, China)

In order to research the effects of non-permeating cryoprotectants and permeating cryoprotectants combination on lamb testicular tissue cryopreservation, four cryoprotectants (φ=10% DMSO,φ=10% EG,φ=10% DMSO+5 g/L BSA andφ=10% EG+5 g/L BSA) were used in this experiment. The cell viability, integrity of seminiferous tubule, concentration of testosterone, mass concentration of inhibin, activity of alkaline phosphatase (AKP) and acid phosphatase (ACP) were detected both before and after the cryopreservation of lamb testicular tissue. The result showed that the cell viability, rate of seminiferous tubule integrity, concentration of testosterone, mass concentration of inhibin, activity of AKP and ACP inφ=10% DMSO+5 g/L BSA group were significantly higher than in other frozen-thawed groups, while significantly lower than in control group (fresh tissue). Inφ=10% DMSO group andφ=10% EG+5 g/L BSA group, all the parameters were significantly higher than inφ=10% EG group, and there was no significant difference between these two groups. In conclusion, combining 5 g/L BSA andφ=10% DMSO could improve the cryoprotective effects of lamb testicular tissue.

Lamb; Testicular tissue; Cryopreservation; Cryoprotectant

ZHU Qingchao, male, master student. Research area: animal reproductive and physiological regulation. E-mail: 1040203697@qq.com

HU Jianhong, male, professor,doctoral supervisor. Research area:scientific research on livestock reproductive and physiological regulation. E-mail: hjh19732008@126.com

2016-02-26

2016-05-13

國家絨毛用羊產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系(CARS-40-13)；陜西省科技統(tǒng)籌創(chuàng)新工程計劃(2015KTTSNY04-03)。

朱慶超，男，碩士研究生，從事動物生殖生理調(diào)控研究。E-mail: 1040203697@qq.com

胡建宏，男，教授，博士生導(dǎo)師，主要從事家畜生殖生理調(diào)控研究。E-mail: hjh19732008@126.com

日期：2016-12-12

網(wǎng)絡(luò)出版地址：http://www.cnki.net/kcms/detail/61.1220.S.20161212.1114.006.html

S814.8

A

1004-1389(2016)12-1762-06

Received 2016-02-26 Returned 2016-05-13

Foundation item Sheep for Cashmere and Wool Industry Technology System (No.CARS-40-13); Shaanxi Science and Technology Co-ordinate Innovation Project (No.2015KTTSNY04-03).