楊凱鈞 朱斌 潘衛(wèi)兵 謝禮仁

聯(lián)合使用脫甲基化藥物和紫杉醇對腎癌細胞的侵襲能力影響機制研究

楊凱鈞 朱斌 潘衛(wèi)兵 謝禮仁

目的 觀察聯(lián)合使用脫氧雜胞苷(DAC)與紫杉醇(PTX)對腎患細胞是否存在協(xié)同作用，并探究其機制。方法離體培養(yǎng)腎透明細胞癌ACHN細胞株，將120培養(yǎng)皿隨機分為空白對照組、DAC組、PTX組、聯(lián)合組，每組30個。DAC組：用DAC：0.5、1、2、4、8 μmol/L處理 3 d；PTX組：用 PTX：1、2、4、8、16 nmol/L處理 3 d；聯(lián)合組：用DAC+ PTX處理 3 d。使用高速分選流式細胞儀觀察T肽協(xié)同樹突狀細胞對腎癌細胞的凋亡率；通過ELISA檢測淋巴細胞增強因子(LEF1)和E-cadherin在腎癌細胞中的表達；通過ELISA技術檢測凋亡蛋白caspass-3在腎癌細胞中的表達。結果DAC組、PTX組以及聯(lián)合組對腫瘤細胞的抑制作用明顯，其中聯(lián)合組對腫瘤細胞的抑制作用最強(P<0.05)，而且DAC和PTX對腫瘤細胞的抑制作用與藥物濃度成正比(P<0.05)。與DAC組、PTX組比較，聯(lián)合組中LEF1的表達水平最低(P<0.05)，E-cadherin、caspass-3的表達水平最高(P<0.05)，而且DAC和PTX對LEF1表達的抑制作用、對E-cadherin、caspass-3的表達的促進作用與藥物濃度成正比(P<0.05)。結論DAC與 PTX聯(lián)合干預腎癌細胞，具有協(xié)同作用，而且 LEF1是新的腎癌治療靶點，DAC與 PTX合用可以提高腎癌細胞的凋亡率，并且降低腎癌細胞的侵襲轉移能力。

脫甲基化藥物；紫杉醇；腎癌；侵襲能力；分子機制

腎細胞癌(renal cell carcinoma，RCC)是最常見的泌尿系統(tǒng)惡性腫瘤[1-3]，其發(fā)病率僅略低于膀胱腫瘤。基因甲基化的功用是穩(wěn)定基因結構的堿基序列，使其能夠編碼正常的基因。如果基因組的基因甲基化和去甲基化的平衡發(fā)生異常變化，造成染色質復制不穩(wěn)定，可引起細胞突變，造成生長失控，從而誘發(fā)腫瘤。脫氧雜氮胞苷亦稱地西他濱(5-aza-2 deoxycytidine，DAC)是經典的去甲基化藥物，其可有效抑制胞嘧啶甲基化的過程，隨著細胞分裂逐漸減低DNA甲基化的程度[4-6]。紫杉醇(paclitaxel，PTX)屬于抗微管藥，其能下調細胞漿內的IkB-α水平，使得可以誘導和促進微管蛋白聚合，抑制微管解聚，使得NF-κB被激活，其轉移至細胞核內參與調節(jié)多種參與凋亡蛋白，如半胱天冬酶(caspase)家族，使癌細胞凋亡[7-9]。若聯(lián)合使用DAC 和PTX ，除了兩者皆具有的細胞毒效應影響癌細胞的凋亡外，很可能通過干擾癌細胞的細胞黏附分子從而對腫瘤細胞的侵襲能力產生間接影響。本研究即觀察聯(lián)合使用DAC 與PTX對腎患細胞是否存在協(xié)同作用，并探究其分子機制。

1 材料與方法

1.1 主要試劑及儀器 地西他濱(DAC；美國 Sigma公司)； Paclitaxel (PTX；美國 Sigma公司)；人腎癌細胞株(美國 ATCC公司)FACSArill型高速分選流式細胞儀(美國 BD公司)；Freedom EVO 75 全自動酶聯(lián)免疫吸附分析儀(瑞士 Tecan公司)。

1.2 研究方案

1.2.1 細胞復蘇：腎透明細胞癌ACHN細胞株均置于-80℃保存。復蘇時置37℃水浴解凍，加RPMI-1640 培養(yǎng)液，1 500 r/min，5 min離心，去上清，加Rpmi-1640 培養(yǎng)基液，置5%CO2、37℃的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.2.2 細胞培養(yǎng)：細胞培養(yǎng)基選用10%胎牛血清、100 U/ml青霉素、RPMI-1640、100 mg/ml鏈霉素，5%CO2、37℃的培養(yǎng)箱中孵育，ACHN腎癌細胞株為單層粘壁生長類型，將細胞培養(yǎng)濃度1×107/ml。

1.2.3 試驗設計和分組：通過隨機數(shù)字發(fā)生器將120培養(yǎng)皿隨機分為4組(n=30)：空白對照組；DAC組，脫甲基化藥物 DAC干預；PTX組，化療藥物PTX干預；聯(lián)合組，DAC聯(lián)合PTX干預。

1.2.4 試驗干預措施：PTX溶于DMSO之中，濃度10 mg/ml，使用無血清 RPMI-1640 配制樣品(1 mg/ml)濃度為 1 000、100、10、1、0.1 μg/ml，500 nmol/L PBS 稀釋，0.22 μm濾膜過濾，置-80℃。DAC 500 μmol/L PBS 稀釋，0.22 μm濾膜過濾，置-80℃。①DAC干預方案：用DAC 0.5、1、2、4、8 μmol/L處理3 d。 ②PTX干預方案：用 PTX 1、 2、4、8、16 nmol/L處理 3 d。③DAC聯(lián)合PTX治療方案：用DAC+ PTX處理 3 d。

1.3 觀察指標 (1)使用高速分選流式細胞儀觀察T肽協(xié)同樹突狀細胞對腎癌細胞的凋亡率；(2)通過酶聯(lián)免疫吸附測定(enzyme linked immunosorbent assay，ELISA)檢測淋巴細胞增強因子(lymphoid enhance facter 1，LEF1)和E-cadherin在腎癌細胞中的表達；(3)通過ELISA技術檢測凋亡蛋白caspass-3在腎癌細胞中的表達。

2 結果

2.1 腎癌細胞凋亡率比較 DAC組、PTX組以及聯(lián)合組對腫瘤細胞的抑制作用明顯，其中聯(lián)合組對腫瘤細胞的抑制作用最強，而且DAC和PTX對腫瘤細胞的抑制作用與藥物濃度呈正比，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。見表1。

組別0.5μmol/L1μmol/L2μmol/L4μmol/L8μmol/LP值空白對照組23.89±2.7524.10±2.0124.27±2.2125.09±3.9525.55±3.69>0.05DAC組25.78±4.4935.57±3.0946.87±3.2758.15±4.5561.82±.88<0.05PTX組25.78±4.4935.57±3.0946.87±3.2758.15±4.5575.90±2.88<0.05聯(lián)合組26.02±1.5442.28±2.0258.68±2.2579.30±3.5092.08±2.50<0.05 P值<0.05<0.05<0.05<0.05<0.05-

2.2 LEF1在腎癌細胞中的表達比較 聯(lián)合組中LEF1的表達水平最低，而且DAC和PTX對LEF1表達的抑制作用與藥物濃度呈正比，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。見表2。

組別0.5μmol/L1μmol/L2μmol/L4μmol/L8μmol/LP值空白對照組14.39±0.2914.77±0.3214.52±2.2114.09±0.3514.21±0.49>0.05DAC組9.18±0.536.43±0.475.06±0.284.58±0.243.42±0.36<0.05PTX組7.75±0.295.89±0.494.35±0.213.67±0.383.11±0.19<0.05聯(lián)合組6.52±0.355.41±0.234.05±0.163.15±0.252.79±0.34<0.05 P值<0.05<0.05<0.05<0.05<0.05-

2.3 E-cadherin在腎癌細胞中的表達比較 聯(lián)合組中E-cadherin的表達水平最高，而且DAC和PTX對E-cadherin表達的促進作用與藥物濃度呈正比，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。見表3。

2.4 caspass-3在腎癌細胞中的表達的比較：比較DAC組、PTX組以及聯(lián)合組中caspass-3在腎癌細胞中的表達，其中聯(lián)合組中caspass-3的表達水平最高，而且DAC和PTX對LEF1表達的促進作用與藥物濃度呈正比，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。見表4。

3 討論

腫瘤發(fā)生的特征是生長失控，癌細胞基因組中的一種腫瘤發(fā)生誘因是基因組超甲基化，即抑癌基因(tumor suppressor gene)的超甲基化(hyper methylation)，使該基因失活，不能轉錄復制，誘發(fā)腫瘤發(fā)生[10-12]。目前在腎癌中，已發(fā)現(xiàn)多個基因存在超甲基化的變化，例如腫瘤抑制蛋白 RDA32、凋亡相關蛋白激酶 1、蛋白分化酶 3的抑制因子等。近年，DNA甲基化的作用受到關注，因為甲基化水平同時影響腫瘤細胞的凋亡和轉移能力，而腫瘤細胞的絕對數(shù)目以及是否容易從瘤體脫落是決定腫瘤細胞侵襲能力的關鍵，尤其是甲基化(methylation)在腫瘤的發(fā)展的影響成為腫瘤研究的熱點[13-15]。

組別0.5μmol/L1μmol/L2μmol/L4μmol/L8μmol/LP值空白對照組1.76±0.311.79±0.291.75±0.321.74±0.261.82±0.39>0.05DAC組1.82±0.221.95±0.352.22±0.282.45±0.333.45±0.36<0.05PTX組1.77±0.321.88±0.332.14±0.202.34±0.163.33±0.24<0.05聯(lián)合組1.76±0.172.24±0.183.15±0.223.94±0.254.21±0.34<0.05 P值<0.05<0.05<0.05<0.05<0.05-

組別0.5μmol/L1μmol/L2μmol/L4μmol/L8μmol/LP值空白對照組14.39±0.2914.77±0.3214.52±2.2114.09±0.3514.21±0.49>0.05DAC組9.18±0.536.43±0.475.06±0.284.58±0.243.42±0.36<0.05PTX組7.75±0.295.89±0.494.35±0.213.67±0.383.11±0.19<0.05聯(lián)合組6.52±0.355.41±0.234.05±0.163.15±0.252.79±0.34<0.05 P值<0.05<0.05<0.05<0.05<0.05-

淋巴細胞增強因子(lymphoid enhance facter 1，LEF1)在胚胎組織細胞中多為高表達，其在出生后迅速下降[16-18]。LEF1通過和β-catenin結合激活靶基因調控細胞增殖和凋亡，繼而干預腫瘤的發(fā)展過程。LEF-1在腎腫瘤中的表達多增高，其通過β-catenin信號通路抑制 E-cadherin在腫瘤細胞內的表達水平，繼而促進腫瘤細胞遷移。E-cadherin屬于鈣依賴性細胞間黏附分子，其可以維持組織細胞的完整性。β-catenin的一端與鈣依賴性黏附分子(calcium-dependent cell adhesion molecule，E-cadherin)末端進行耦聯(lián)，繼而形成 E-cadherin/β-catenin復合物，β-catenin的另一端通過與胞內肌動蛋白連接，穩(wěn)定細胞間的連接。E-cadherin蛋白表達下調可以會誘發(fā)該復合體功能障礙，使細胞間形成穩(wěn)定連接失去功能，最終誘發(fā)腫瘤細胞發(fā)生浸潤和轉移。

脫甲基化藥物 DAC可以和 DNA結合，繼而抑制DNA甲基化轉移酶的活性，使甲基化胞嘧啶去甲基，使DNA低甲基化。目前，DAC 已用于臨床造血系統(tǒng)腫瘤、轉移性肺癌和轉移性前列腺癌的臨床治療。

單獨使用DAC 或者PTX治療腎患細胞的臨床效果并不佳，其總緩解率僅達到 5%，其原因與腎癌細胞的增殖和侵襲能力沒有得到有效遏制有關[19]。本研究證實， DAC和 PTX單獨使用可以抑制腎癌細胞的生長，即誘發(fā)caspass-3在腎癌細胞中的高表達，使得腎癌細胞的凋亡率上調。其具有劑量依賴性。尤為重要的是，實驗發(fā)現(xiàn)聯(lián)合應用 DAC與 PTX，其對腫瘤細胞的生長抑制顯著高于單獨使用的效果，也即聯(lián)合治療能夠比較低的濃度達到較好的療效。

本研究發(fā)現(xiàn)，LEF1的表達水平在DAC和PTX干預腎癌癥細胞之后明顯下調，而且聯(lián)合作用后 LEF1表達水平的下降幅度更大，即兩種藥物呈現(xiàn)協(xié)同作用。本實驗結果還發(fā)現(xiàn)，DAC和PTX聯(lián)合處理腎癌細胞之后 LEF1的表達顯著低于單一藥物的作用。本研究結果表明，LEF1是在DAC和PTX聯(lián)合作用的靶點，即LEF1所在的Wnt信號通路密切參與腎癌的發(fā)展過程，并且其是調控腎癌細胞生長的重要通路。

綜上所述，本研究證實了 DAC與 PTX聯(lián)合干預腎癌細胞，具有協(xié)同作用，而且 LEF1是新的腎癌治療靶點，DAC與 PTX合用可以提高腎癌細胞的凋亡率，并且降低腎癌細胞的侵襲轉移能力。

1 Aguiar P Jr,Padua TC,Guimaraes DP.Brazilian data of renal cell carcinoma in a public university hospital. Int Braz J Urol,2016,42:29-36.

2 Zhang S, Hong Z, Li Q, et al. Effect of MicroRNA-218 on the viability, apoptosis and invasion of renal cell carcinoma cells under hypoxia by targeted downregulation of CXCR7 expression. Biomed Pharmacother,2016,80:213-219.

3 Mitash N, Agnihotri S, Mittal B, et al. Molecular cystoscopy: Micro-RNAs could be a marker for identifying genotypic changes for transitional cell carcinoma of the urinary bladder. Indian J Urol,2015,32:149-153.

4 Jiang J, Yi BO, Ding S, et al. Demethylation drug 5-Aza-2'-deoxycytidine-induced upregulation of miR-200c inhibits the migration, invasion and epithelial-mesenchymal transition of clear cell renal cell carcinoma in vitro.Oncol Lett,2016,11:3167-3172.

5 Anders NM,Liu J,Wanjiku T,et al.Simultaneous quantitative determination of 5-aza-2'-deoxycytidine genomic incorporation and DNA demethylation by liquid chromatography tandem mass spectrometry as exposure-response measures of nucleoside analog DNA methyltransferase inhibitors.J Chromatogr B Analyt Technol Biomed Life Sci,2016,1022:38-45.

6 Zhu X, Yi F, Chen P, et al. 5-Aza-2'-Deoxycytidine and CDDP Synergistically Induce Apoptosis in Renal Carcinoma Cells via Enhancing theAPAF-1 Activity. Clin Lab,2015,61:1821-1830.

7 Luan X, Guan YY, Lovell JF, et al.Tumor priming using metronomic chemotherapy with neovasculature-targeted, nanoparticulate paclitaxel. Biomaterials,2016,95:60-73.

8 Wang W, Shi Y, Li J, et al.Up-regulation of KIF14 is a predictor of poor survival and a novel prognostic biomarker of chemoresistance to paclitaxel treatment in cervical cancer. Biosci Rep,2016,36:315.

9 Najlah M, Kadam A, Wan KW, et al. Novel paclitaxel formulations solubilized by parenteral nutrition nanoemulsions for application against glioma cell lines. Int J Pharm,2016,506:102-109.

10 Cheedipudi S, Puri D, Saleh A,et al. A fine balance: epigenetic control of cellular quiescence by the tumor suppressor PRDM2/RIZ at a bivalent domain in the cyclin a gene.Nucleic Acids Res,2015,43:6236-6256.

11 Li Z, Ding Y, Zhu Y, et al. Both gene deletion and promoter hyper-methylation contribute to the down-regulation of ZAC/PLAGL1 gene in gastric adenocarcinomas: a case control study.Clin Res Hepatol Gastroenterol,2015,38: 744-750.

12 Tahara T, Shibata T, Yamashita H, et al. Chronic nonsteroidal anti-inflammatory drug (NSAID) use suppresses multiple CpG islands hyper methylation (CIHM) of tumor suppressor genes in the human gastric mucosa.Cancer Sci,2009,100:1192-1197.

13 Chun HJ, Lim EL, Heravi-Moussavi A, et al. Genome-Wide Profiles of Extra-cranial Malignant Rhabdoid Tumors Reveal Heterogeneity and Dysregulated Developmental Pathways.Cancer Cell,2016,29:394-406.

14 Richter AM, Walesch SK, Dammann RH. Aberrant Promoter Methylation of the Tumour Suppressor RASSF10 and Its Growth Inhibitory Function in Breast Cancer. Cancers (Basel),2016,25:26.

15 Cohen DO, Duchin S, Feldman M, et al. Engineering of Methylation State Specific 3xMBT Domain Using ELISA Screening. PLoS One, 2016, 11:154-207.

16 Kennedy MW, Chalamalasetty RB, Thomas S, et al. Sp5 and Sp8 recruit β-catenin and Tcf1-Lef1 to select enhancers to activate Wnt target gene transcription.Proc Natl Acad Sci U S A, 2016, 113:3545-3350.

18 Jia M, Zhao HZ, Shen HP, et al. Overexpression of lymphoid enhancer-binding factor-1 (LEF1) is a novel favorable prognostic factor in childhood acute lymphoblastic leukemia.Int J Lab Hematol,2015,37:631-640.

19 Chandel N, Ayasolla KS, Lan X, et al. Epigenetic Modulation of Human Podocyte Vitamin D Receptor in HIV Milieu.J Mol Biol,2015,427:3201-3215.

Effects of demethylation drugs combined with paclitaxel on invasion ability of renal carcinoma cells and their action mechanism

YANGKaijun,ZHUBin,PANWeibing,etal.

DepartmentofUrinarySurgery,People’sHospitalofPingshanDistrict,Guangdong,Shenzhen518118,China

Objective To observe whether combination application of deoxidation cytidine (DAC) with paclitaxel (PTX) has a synergistic effect on renal carcinoma cells, and to explore their action mechanism. Methods The renal clear cell carcinoma-ACHN cell line was cultured in vitro. The 120 culture dishes were randomly divided into 4 groups:blank control group,DAC group,PTX group,combination group (DAC+PTX),with 30 dishes in each group. The cells in DAC group were treated by DAC 0.5, 1, 2, 4, 8 μmol/L, respectively for 3 days;the celles in PTX group were treated by PTX 1, 2, 4, 8, 16 nmol/L, respectively for 3 days; the cells in combination group were treated by DAC+PTX for 3 days. The apoptosis rates of renal carcinoma cells induced by T peptide combined with dendritic cells were detected by flow cytometry,and the expression levels of lymphocyte enhancement factor (LEF1),E-cadherin and Caspass-3 in renal carcinoma cells were detected by ELISA. Results The inhibitory effects on tumor cells in DAC group,PTX group and combination group were obvious,in which the inhibitory effects in combination group were the most obvious (P<0.05). Moreover the inhibitory effects on tumor cells in DAC group and PTX group were in direct proportion to the drug concentrations (P<0.05). As compared with those in DAC group and in PTX group,the expression levels of LEF1 in combination group were the lowest (P<0.05), however, the expression levels of E-cadherin and Caspass-3 were the highest. Moreover the inhibitory effects of DAC and PTX on the expressions of LEF1 as well as the promotive effects on the expressions of E-cadherin,Caspass-3 were in opposite proportion to the drug concentrations (P<0.05).Conclusion The combination intervention of DAC and PTX on renal carcinoma cells has a synergistic effect.Moreover LEF1 is an new therapeutic target for renal carcinoma.The combination application of DAC with PTX can increase the apoptosis rate of renal carcinoma cells, and can decrease the abilities of invasion and metastasis of renal carcinoma cells.

demethylation drugs; paclitaxel; renal carcinoma; invasive ability; molecular mechanism

10.3969/j.issn.1002-7386.2016.24.009

518118 廣東省深圳市坪山新區(qū)人民醫(yī)院泌尿外科

R 737.11

A

1002-7386(2016)24-3717-04

2016-06-08)