羅 弦，陸 涵，袁 雷，賈永霞，武云利，鄧群仙*

(1 四川農(nóng)業(yè)大學 園藝學院，成都 611130；2 四川農(nóng)業(yè)大學 資源學院，成都 611130)

唐菖蒲赤霉素受體基因克隆及表達分析

羅 弦1，陸 涵1，袁 雷1，賈永霞2，武云利1，鄧群仙1*

(1 四川農(nóng)業(yè)大學 園藝學院，成都 611130；2 四川農(nóng)業(yè)大學 資源學院，成都 611130)

以唐菖蒲子球為材料，采用RT-PCR技術(shù)，克隆了1個赤霉素(GA)受體基因，命名為GhGID1a(GenBank登錄號為KU525107)。其開放閱讀框為1 032 bp，編碼343個氨基酸。序列比對結(jié)果表明，GhGID1a推導(dǎo)氨基酸序列與百子蓮、油棕和海棗等植物的GID1的氨基酸序列相似性較高，分別為82%、78%和77%。50 mg/L GA3對子球萌發(fā)具有促進作用，150 mg/L GA3會抑制其萌發(fā)。實時熒光定量PCR結(jié)果顯示，GA3處理對GhGID1a基因表達具有反饋抑制作用，GhGID1a表達量隨著子球休眠解除而逐漸降低，推測唐菖蒲子球休眠解除可能與GA及其受體基因有關(guān)，GA及其受體基因GhGID1a可能參與了調(diào)控唐菖蒲的子球休眠與萌發(fā)過程。

唐菖蒲；GID1；基因克隆；表達分析

唐菖蒲(Gladiolushybridus)又名劍蘭、十三太保，為鳶尾科唐菖蒲屬多年生草本植物，是鮮切花市場上的主要花卉之一，其花色豐富、姿態(tài)優(yōu)美，受到眾多消費者的喜愛。唐菖蒲的地下球莖是其切花生產(chǎn)的主要繁殖器官，然而當年采收的地下母球(直徑>2.5 cm) 和子球(直徑≤2.5 cm)，均需放入4℃冷庫干燥貯藏2～4個月打破休眠(不同品種打破休眠所需的冷藏時間有差異)，此后母球可用于下一輪切花生產(chǎn)，而子球需經(jīng)過1～2年栽培膨大成為商品球后才可用于切花生產(chǎn)。由于球莖休眠期較長，個體之間的休眠狀態(tài)差異較大，有的種球已經(jīng)完全解除休眠，有的種球還存在一定程度的淺休眠，播種往往會造成出苗不整齊，花期不一致、難以集中采收等問題，影響了唐菖蒲切花的批量生產(chǎn)[1]。另外，休眠期較長也為其大棚反季節(jié)切花栽培帶來一定困難。

前人研究表明，植物休眠及萌發(fā)與內(nèi)源激素脫落酸(ABA)和赤霉素(GA)有關(guān)。休眠的誘導(dǎo)和維持主要受ABA調(diào)控，休眠的解除和種子萌發(fā)主要受GA調(diào)控[2-4]。GA通過特定的轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑將GA信號作用于植物細胞，其中GA受體蛋白GID(gibberellin insensitive dwarf)起到關(guān)鍵作用，它與GA特異結(jié)合形成二聚體，通過泛素/蛋白酶途徑使得DELLA蛋白降解或抑制其活性，從而消除DELLA蛋白對下游因子的抑制，激活植物對GA的響應(yīng)，如植物休眠解除、花芽分化及莖稈伸長等[5-7]。擬南芥ga1突變體種子缺少GA生物合成途徑中第一個酶，不能正常發(fā)芽，但其在外源GA處理后可正常萌發(fā)[8]。然而，不管是否用外源GA處理，擬南芥GID缺失突變體種子均不能萌發(fā)[9]，說明GID在種子萌發(fā)過程中起到重要作用。

近年來，唐菖蒲球莖休眠方面的研究主要集中在ABA代謝調(diào)控及信號轉(zhuǎn)導(dǎo)相關(guān)基因表達方面[10-12]，而GA及其受體GID基因與唐菖蒲球莖休眠及萌發(fā)方面的研究未見報道。本研究克隆了唐菖蒲球莖GID1a基因，并分析了休眠解除過程中該基因的表達特性，為進一步研究唐菖蒲球莖休眠的分子機制打下了基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 試驗材料及處理

唐菖蒲(Gladiolushybridus)品種‘鉆石粉’子球于2014年10月15日采收于四川農(nóng)業(yè)大學試驗園區(qū)，洗凈晾干后用網(wǎng)袋包裹，貯藏于4 ℃冰箱中。從貯藏開始后的0、15、30、45、60和75 d分別取樣(取樣的子球直徑為0.5～0.7 cm)，然后用濃度為10、50、100和150 mg/L GA3溶液浸泡24 h，對其進行發(fā)芽試驗和基因表達分析，以蒸餾水浸泡24 h作對照。其中，用于基因表達分析的子球每次取樣用GA3浸泡后放入液氮速凍，再置于-80 ℃冰箱保存，待取樣全部完成后統(tǒng)一提取RNA。

1.2 方 法

1.2.1 總RNA提取及cDNA第一鏈合成 用Mylab植物RNA通用提取試劑盒(北京美萊博生物醫(yī)學科技有限公司)提取子球總RNA，然后用TIANScriptⅡ cDNA試劑盒(天根生化科技有限公司)進行cDNA第一鏈合成，具體操作按說明書進行。

1.2.2 唐菖蒲GID1a基因克隆及氨基酸序列分析 本實驗室對唐菖蒲進行了轉(zhuǎn)錄組測序，在測序得到的數(shù)據(jù)庫中查找注釋為“gibberellin insensitive dwarf”的序列，利用Primer Premier 6.0軟件設(shè)計該基因編碼區(qū)1對特異引物GID1a-f1(5′-TCTTACTTTCCCTCTATTACTCT-3′)和GID1a-r1(5′-GATCTCATCCATAACTTCGTA-3′)。

PCR反應(yīng)體系為50 μL，包含cDNA模板2 μL，上、下游引物各2 μL，Taq聚合酶0.5 μL，10×buffer 5 μL， dNTP 3 μL，ddH2O補齊至50 μL。反應(yīng)程序為94 ℃預(yù)變性5 min，94 ℃變性45 s，52 ℃退火45 s，72 ℃延伸90 s，35個循環(huán)，最后72 ℃延伸10 min。PCR反應(yīng)產(chǎn)物加到1%瓊脂糖凝膠中進行電泳，切膠回收目的條帶，純化后與pMD-18T載體連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細胞，藍白斑篩選后送到上海生物工程有限公司測序。利用Blast在線軟件(http：//www. ncbi. nlm. nih. gov/Blast)和DNAman7.0軟件進行基因序列、氨基酸序列比對和進化樹分析。

1.2.3 外源GA3處理對唐菖蒲子球萌發(fā)的影響 用1.1中GA3處理的子球做發(fā)芽試驗，每個處理將50個子球均勻放入直徑90 mm培養(yǎng)皿中，用濕潤紗布覆蓋，再將培養(yǎng)皿置于光照培養(yǎng)箱中，定期補充蒸餾水保持紗布濕潤。溫度和光周期設(shè)置為22 ℃、12 h光照/15 ℃、12 h黑暗，光照度設(shè)置為1 000 Lx，空氣相對濕度設(shè)置為70%，第20天統(tǒng)計發(fā)芽率。每個處理3次重復(fù)，利用SPSS14.0進行方差分析。

1.2.4 外源GA3處理對唐菖蒲子球GID1a基因表達的影響 用1.1中GA3處理的子球提取RNA，反轉(zhuǎn)錄cDNA為模板，進行GID1a基因熒光定量表達分析。使用Primer Premier 6.0 軟件設(shè)計熒光定量引物為GID1a-f2(5′-GGGATGAAGTTTCCGAAGA-3′)和GID1a-r2(5′-CGGTATTGGGCAAGAAGT-3′)，產(chǎn)物長度160 bp。以唐菖蒲actin基因(GenBank登錄號JF831193.1)為內(nèi)參，引物為actin-f(5′-CTCAACCCTAAGGCGAATAG-3′)和actin-r(5′-CTGACACCATCACCAGAGTC-3′)，產(chǎn)物長度152 bp。按照SYBR Premix Ex Taq 試劑盒(TaKaRa)操作進行。反應(yīng)程序為：95 ℃預(yù)變性3 min，94 ℃變性20 s，55 ℃退火20 s，72 ℃延伸20 s，40 次循環(huán)；每次循環(huán)第3 步進行熒光采集，最后退火至65 ℃，每隔30 s 上升0.5 ℃至95 ℃變性1 min。檢測其熒光值，繪制溶解曲線。內(nèi)參基因actinPCR 擴增反應(yīng)體系及反應(yīng)程序與GID1a基因相同。PCR 反應(yīng)于Bio-RAD C1000 Thermal Cycler上進行，PCR反應(yīng)結(jié)束后分析熒光值變化曲線及融解曲線，通過比較2-ΔΔCt的方法進行基因表達分析，每個樣品3次重復(fù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 唐菖蒲GID1a基因克隆及推導(dǎo)氨基酸序列分析

以子球RNA反轉(zhuǎn)錄的cDNA為模板，以本實驗室對唐菖蒲進行轉(zhuǎn)錄組測序數(shù)據(jù)庫設(shè)計特異引物進行PCR擴增，得到一條大小約1 000 bp特異條帶(圖1)，將其回收后連接于pMD18-T載體，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α，利用氨芐青霉素抗性，挑取單菌落測序。測序結(jié)果表明，克隆得到1 032 bp編碼區(qū)序列，利用BlastX在線軟件比對其推導(dǎo)的氨基酸序列，發(fā)現(xiàn)其與GenBank中多種植物的GID1序列相似，其中與百子蓮(Agapanthuspraecox)GID1a序列(AHV78710.1)相似性為82%，與油棕(Elaeisguineensis，XP_010904836.1)和海棗(Phoenixdactylifera，XP_008795099.1)GID1序列的相似性分別為78%和77%，因此認為擴增得到的條帶為唐菖蒲GID1基因，命名為GhGID1a(GenBank登錄號KU525107)。

采用DNAman 7.0軟件以鄰接法(Neighbor-Joining)對山崳菜、百子蓮、海棗等10種植物的GID1

序列構(gòu)建進化樹，建樹模型采用Observed Divergency法。結(jié)果(圖2)顯示，不同植物的GID1聚類呈兩個大類，一大類均為單子葉植物，包括百子蓮、唐菖蒲、海棗、油棕和小果野蕉(Musaacuminata)，其中唐菖蒲與百子蓮均屬于天門冬目(Asparagales)植物，它們之間的親緣關(guān)系更近，聚類為同一小分支。另一大類包括山崳菜(Eutremasalsugineum)、蕪菁(Brassicarapa)、醉蝶花(Tarenayahassleriana)、巨桉(Eucalyptusgrandis)和梅花(Prunusmume)等，這一類均為雙子葉植物，與唐菖蒲親緣關(guān)系較遠。

M. DL2000；1. 擴增條帶圖1 唐菖蒲GhGID1a基因編碼序列的PCR擴增M. DL2000；1. The fragment of RT-PCRFig.1 Amplification of GhGID1a by RT-PCR from Gladiolus hybridus

標尺上的數(shù)字代表遺傳距離圖2 不同物種GID1氨基酸序列的聚類The number on the ruler indicated the genetic distanceFig.2 Clustering of the GID1 amino acid sequences from different species

黑色加粗方框標出GA或DELLA蛋白結(jié)合位點；HSL家族的HGG和GXSXG保守域由黑色菱形標出；HSL催化相關(guān)的氨基酸用箭頭標出。KC991046.1.百子蓮；XM_008796877.1.海棗；XM_006394917.1. 山崳菜；AMR60825.1.唐菖蒲；XM_009152969.1.蕪菁；XM_010906534.1.油棕；XM_010552660.1.醉蝶花圖3 唐菖蒲GhGID1a基因編碼氨基酸序列與其他植物GID1氨基酸序列比對The numbers in the right indicate positions of the amino acid sequences. Black-bordered boxes indicate the binding sites of GA or DELLA proteins; HGG and GXSXG conserved domains of HSL family are marked by black diamonds; Amino acids related to HSL activity are indicated by arrows. XM_008796877.1: Phoenix dactylifera GID1 protein；XM_006394917.1: Eutrema salsugineum GID1 protein；KC991046.1: Agapanthus praecox GID1a protein；XM_009152969.1: Brassica rapa GID1 protein；XM_010906534.1: Elaeis guineensis GID1 protein；XM_010552660.1: Tarenaya hassleriana GID1 proteinFig.3 Mutiple alignment of deduced amino acid sequences of GhGID1a with GID1 of other plants

利用DNAman 7.0軟件對GhGID1a推導(dǎo)氨基酸序列與其他植物GID1序列進行比對分析(圖3)，發(fā)現(xiàn)克隆得到GhGID1a基因序列可翻譯為343個氨基酸，與其他植物GID1序列長度相近。經(jīng)丙氨酸掃描(Ala scanning)發(fā)現(xiàn)從N端到C端依次包含TWVLIS、DR、FFHGGSF、HS、IYD、YRR、DGW、GDSSGGNI、GNI、MF、LDGKYF、DWY和GFY等各個GAs或DELLA蛋白結(jié)合位點，它們在GhGID1a中均是保守的。另外，GhGID1a氨基酸序列中還具有激素敏感酯酶(hormone sensitive lipase，HSL)家族保守的HGG和GXSXG保守域，與其它植物GID1蛋白相似，HSL催化相關(guān)的3個氨基酸S、D和H中，只有S和D是保守的，而H被I或V取代[13]。這些結(jié)果表明GhGID1a基因可能編碼唐菖蒲中有活性的GA受體，參與唐菖蒲GA信號的識別與轉(zhuǎn)導(dǎo)。

2.2 不同濃度GA3處理對不同冷藏期唐菖蒲子球發(fā)芽率的影響

唐菖蒲子球剛貯藏時(0 d)取樣進行發(fā)芽試驗，對照和10 mg/L GA3處理第20 天的發(fā)芽率均為0，50和100 mg/L GA3處理發(fā)芽率不足3%，150 mg/L GA3處理僅能夠?qū)l(fā)芽率提高到7%，說明此時子球休眠程度深(圖4)。冷藏15～45 d期間，各濃度GA3處理能在一定程度上提高發(fā)芽率，其中50 mg/L GA3處理提高的發(fā)芽率最顯著。如冷藏30 d時，對照發(fā)芽率為22%，50 mg/L GA3處理的發(fā)芽率達41%，是對照的近2倍。冷藏60～75 d期間，10和50 mg/L GA3處理與對照的發(fā)芽率差異不顯著，而100和150 mg/L GA3處理對發(fā)芽有抑制作用，如冷藏60 d時，對照發(fā)芽率為76%，100 mg/L GA3處理的發(fā)芽率為60%，顯著低于對照；冷藏75 d時，對照發(fā)芽率達98%，說明此時子球已完全解除休眠，150 mg/L GA3處理發(fā)芽率僅為15%，抑制發(fā)芽作用顯著。

不同小寫字母表示同一冷藏時間不同GA3處理間差異顯著(P<0.05),下同圖4 GA3處理對不同冷藏期唐菖蒲子球發(fā)芽率的影響The different normal letters mean significant difference at P<0.05, the same as belowFig.4 The effect of GA3 treatments on germination percentage of Gladiolus hybridus cormels cold stored at different time points

圖5 GA3處理對不同冷藏期唐菖蒲子球GhGID1a基因相對表達量的影響Fig.5 The effect of GA3 treatments on relative expression level of GhGID1a of Gladiolus hybridus cormels cold stored at different time points

2.3 GA3處理對不同冷藏期唐菖蒲子球GhGID1a基因表達量的影響

將冷藏6個時期取樣的子球用不同濃度GA3浸泡處理24 h，以蒸餾水浸泡24 h為對照，采用實時熒光定量PCR進行GhGID1a基因的相對表達量檢測。結(jié)果(圖5)顯示，GhGID1a基因在冷藏各個時期的唐菖蒲子球中均有表達，隨著冷藏時間的增加，各處理的表達量逐漸降低(除10 mg/L GA3處理外)，其中150 mg/L GA3處理降低的幅度最大。50 mg/L GA3處理的子球GhGID1a基因表達量在冷藏0～45 d時顯著低于對照，而冷藏60 和75 d時表達量與對照差異不顯著；100和150 mg/L GA3處理的GhGID1a表達量在0～75 d冷藏期間低于50 mg/L GA3處理的表達量，也低于對照。以上結(jié)果說明外源GA3對冷藏過程中的子球GhGID1a表達具有下調(diào)作用，尤其在冷藏后期，GA3濃度越高，下調(diào)作用越明顯。

3 討 論

赤霉素通過特定的轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑將赤霉素信號作用于植物，能夠打破種子休眠并促進萌發(fā)。赤霉素缺陷型突變體番茄種子不能正常發(fā)芽，而在連續(xù)外施活性赤霉素后可恢復(fù)發(fā)芽[14-15]。本研究中，剛冷藏時(0 d)子球休眠程度深，GA3僅能促進少量子球萌發(fā)。在15～45 d期間，隨著冷藏時間的延長，子球休眠程度變淺，GA3促進發(fā)芽的效果逐漸增強，而60～75 d期間，隨著冷藏時間的進一步延長，大部分子球休眠解除，GA3促進發(fā)芽的效果逐漸減弱，低濃度(10 mg/L)GA3處理的發(fā)芽率與對照差異不顯著，而高濃度(150 mg/L)GA3會抑制發(fā)芽，這與前人在唇形科植物Teucriumpolium[16]以及臭椿[17]上的研究結(jié)果相似。說明適宜濃度的GA3能夠打破唐菖蒲子球的休眠，促進萌發(fā)；然而在不同的冷藏時期，子球發(fā)芽率達最高值時的GA3濃度存在差異，這可能與冷藏期唐菖蒲子球ABA、IAA等其它內(nèi)源激素的相互作用有關(guān)[18-19]，其機理有待進一步探討。

GID1編碼GA信號傳遞途徑中的重要受體蛋白，該基因首先從水稻中克隆得到，且只有1個拷貝[20]。擬南芥中存在3種GA受體，分別由AtGID1a、AtGID1b和AtGID1c編碼，它們在植物發(fā)育的不同階段、不同組織器官中響應(yīng)GA信號，這3個受體功能上具有部分冗余性[21]。Voegele等[9]從分子系統(tǒng)發(fā)生的角度把植物GID1基因分為三組，其中雙子葉植物的GID1a基因和GID1c基因歸為一組，GID1b基因歸為一組，單子葉植物GID1基因歸為一組。本研究從唐菖蒲中克隆得到1個GID1基因，命名為GhGID1a，編碼區(qū)序列全長1 032 bp，編碼343個氨基酸，推導(dǎo)的GhGID1a蛋白與百子蓮、油棕、海棗等單子葉植物GID1蛋白的保守區(qū)域高度一致，它包含HSL家族的HGG和GXSXG結(jié)構(gòu)域及與GA和DELLA蛋白相結(jié)合的作用位點，參與GA信號識別與轉(zhuǎn)導(dǎo)。

Voegele等[9]對擬南芥的研究顯示，GA處理擬南芥種子后，發(fā)芽率顯著增加，擬南芥3種GA受體中，AtGID1a和AtGID1c基因表達下調(diào)，AtGID1b基因表達變化不顯著。岳川等[22]研究發(fā)現(xiàn)茶樹越冬芽解除休眠與GA及其受體基因CsGID1a相關(guān)：GA3能夠下調(diào)茶樹CsGID1a的表達，并且CsGID1a表達量隨著茶芽萌動進程逐漸降低。本研究中實時熒光定量PCR結(jié)果表明外源GA3對唐菖蒲GhGID1a基因表達具有下調(diào)作用，這與茶樹[22]、棉花[23]、葡萄[24]、板栗[25]等GID1基因的研究結(jié)果相似。10 mg/L GA3處理GhGID1a基因表達量與對照無差異，在50～150 mg/L濃度范圍內(nèi)，GA3濃度越高，GhGID1a基因下調(diào)表達越明顯，尤其在冷藏中后期這種情況更明顯，這可能是因為在轉(zhuǎn)錄水平上該基因受到GA的負反饋抑制調(diào)節(jié)[20-21]。GhGID1a表達量隨著冷藏過程逐漸降低，子球發(fā)芽率變化趨勢與GhGID1a表達量變化趨勢總體上呈負相關(guān)，推測在冷藏過程中子球內(nèi)源GA含量可能逐漸上升，以促進子球休眠的解除及后續(xù)生長[22]。

此外，植物休眠與萌發(fā)還受到內(nèi)源ABA調(diào)控，ABA主要起到誘導(dǎo)與維持休眠的作用。有研究表明，擬南芥ABA不敏感突變體以及ABA缺陷型突變體種子休眠程度有所降低。在唐菖蒲子球休眠初期內(nèi)源ABA含量較高，使得子球處于休眠狀態(tài)，而到了休眠后期，內(nèi)源ABA含量降低，子球休眠逐漸解除，部分子球開始萌發(fā)[10]。因此，對唐菖蒲種球休眠與萌發(fā)機制解析還需要進一步結(jié)合ABA與GA信號轉(zhuǎn)導(dǎo)及其相關(guān)基因的表達調(diào)控進行深入研究。

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(編輯:宋亞珍)

Cloning and Expression Analysis of Gibberellin Receptor Gene inGladiolushybridus

LUO Xian1，LU Han1，YUAN Lei1，JIA Yongxia2，WU Yunli1，DENG Qunxian1*

(1 College of Horticulture, Sichuan Agricultural University，Chengdu 611130，China; 2 College of Resources, Sichuan Agricultural University, Chengdu 611130，China)

Using RT-PCR technique, we cloned a gibberellin receptor gene from cormels ofGladiolushybridusnamed asGhGID1a(genbank accession number KU525107). The open reading frame ofGhGID1awas 1 032 bp, which encodes 343 amino acids. The sequence alignment results indicated that the deduced amino acid sequence of GhGID1a was similar to the GID amino acid sequences ofAgapanthuspraecox，ElaeisguineensisandPhoenixdactylifera，with the similarity of 82%, 78% and 77%, respectively. 50 mg/L GA3could promote cormel germination, but GA3at 150 mg/L could inhibit germination. Real-time PCR results indicated that GA3treatments caused feedback-inhibition onGhGID1aexpression. TheGhGID1aexpression gradually decreased with cormel dormancy release, which inferred that GA and its receptor geneGhGID1aparticipated in the regulation process ofGladiolushybriduscormel dormancy and germination.

Gladiolushybridus;GID1; clone; expression

1000-4025(2016)11-2152-07

10.7606/j.issn.1000-4025.2016.11.2152

2016-08-05;修改稿收到日期:2016-11-01

國家自然科學基金(31301812)；四川省教育廳基金(13ZB0285)；四川農(nóng)業(yè)大學雙支計劃

羅 弦(1983-)，男，博士，講師，主要從事園藝植物生理與分子生物學研究。E-mail：lawxian@aliyun.com

*通信作者:鄧群仙，博士，教授，主要從事園藝植物種質(zhì)資源與育種研究。E-mail：dqxlwj@sina.com.cn

Q785;Q786

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