董 云，王 毅，靳豐蔚，孫萬倉，劉自剛，方 彥，徐妙云，王 磊

(1.甘肅省農(nóng)科院 作物研究所，蘭州 730070; 2. 甘肅省油菜工程技術(shù)研究中心，蘭州 730070；3.中國農(nóng)科院 生物技術(shù)研究所，北京 100081)

油菜 Bna-miR169d基因的分離與過表達初步分析

董 云1，王 毅1，靳豐蔚1，孫萬倉2，劉自剛2，方 彥2，徐妙云3，王 磊3

(1.甘肅省農(nóng)科院 作物研究所，蘭州 730070; 2. 甘肅省油菜工程技術(shù)研究中心，蘭州 730070；3.中國農(nóng)科院 生物技術(shù)研究所，北京 100081)

miRNA是一類長度約為21～24 nt的內(nèi)源性非編碼RNA，在基因表達調(diào)控網(wǎng)絡(luò)中起著重要作用。miR169家族是植物中最大的miRNA家族，其成員在植物的生長發(fā)育過程中發(fā)揮重要的調(diào)控作用。但至今仍缺乏系統(tǒng)研究，為了探究油菜miR169的功能，本研究從油菜栽培種‘Westar’中克隆了miR169d前體基因，并構(gòu)建了miR169d的過表達載體，通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)法將其轉(zhuǎn)化到甘藍型油菜‘Westar’品種中，經(jīng)PCR法鑒定獲得4株陽性株，其中2株T0代表現(xiàn)早花，較對照生育期縮短10～12 d。初步推測，油菜miR169d可能通過調(diào)控靶基因的表達參與了油菜的早花發(fā)育。

油菜；開花；早熟；miR169；遺傳轉(zhuǎn)化

油菜(Brassicanapus)是重要的油料作物，對油菜性狀的改良是育種家們長期追求的目標。早熟是許多油菜產(chǎn)區(qū)和多熟制地區(qū)的育種目標之一，早熟油菜成熟早，可以避免生育后期的高溫逼熟或干熱風等災(zāi)害的危害，或減輕受害程度，且能為后茬作物及早騰地，保證后茬作物的高產(chǎn)穩(wěn)產(chǎn)，從而提高糧油周年產(chǎn)量。甘藍型油菜產(chǎn)量高、適應(yīng)性強，在世界各地廣泛種植，其種植面積已占全國油菜總種植面積的85%以上[1]，培育甘藍型早熟油菜是當前油菜育種的一個主攻方向。近十幾年來，隨著分子生物學(xué)和生物技術(shù)的飛速發(fā)展，F(xiàn)PF1(flowering promoting factor 1)、CO(CONSTANS)、LFY(LEAFY)和AP1(APETALA1)等一些控制植物開花時間的基因相繼被克隆[2]。已有文獻[2-3]報道，前人用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法將外源的FPF1、AP1基因?qū)敫仕{型油菜品種中,獲得的轉(zhuǎn)基因油菜株較野生型油菜提前開花。譚小力等[4]用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的方法將克隆的藍細菌血紅蛋白基因SLR2097轉(zhuǎn)化到甘藍型油菜中，使油菜的生育期縮短，引起早熟。

miRNAs是一類在進化上保守的長約21～24 nt的非編碼單鏈RNA，在生物體生長發(fā)育過程、抗生物或者非生物脅迫中起著非常重要的作用，在基因表達調(diào)控的網(wǎng)絡(luò)中處于核心位置[5-6]，通過有效地抑制其靶基因編碼的蛋白質(zhì)的合成，或以其他調(diào)節(jié)機制來抑制靶基因的表達。miR169家族在植物的生長發(fā)育過程中處于重要的調(diào)控地位，但至今仍缺乏系統(tǒng)研究，到目前為止，只有部分miR169家族成員的功能被解析。在擬南芥中，miR169家族有14個成員，即：miR169a-miR169n，其中miR169a靶向NF-YA5，在抗旱方面表現(xiàn)負反饋作用[7]；miR169d在擬南芥中過表達能引起提前開花1～2周[8]；還有研究表明擬南芥miR169參與調(diào)控脂肪酸的合成代謝和氮代謝[9-10]。對水稻的17個miR169家族成員分析發(fā)現(xiàn)，一些成員與干旱誘導(dǎo)、鹽脅迫相關(guān)[11]。豆科植物中，miR169通過靶向MtHAP2-1調(diào)控共生瘤的生長發(fā)育[12]。XU等[13]對油菜miRNA測序分析發(fā)現(xiàn)油菜miR169家族有 16 個成員，是油菜miRNA家族中成員最多的家族。油菜miR169家族基因克隆和功能研究均未見報道。前期研究表明，擬南芥miR169d參與植物逆境誘導(dǎo)的開花調(diào)控[14]，鑒于油菜和擬南芥較高的同源性和研究油菜早熟的重要意義，本研究分離克隆了油菜miR169d前體序列，并構(gòu)建植物過表達載體轉(zhuǎn)化甘藍型春油菜品種，以期闡明Bna-miR169d表達調(diào)控機制。

1 材料與方法

1.1 材 料

1.1.1 油菜品種 甘藍型油菜(BrassicanapusL.)栽培品種‘Westar’。

1.1.2 菌株和載體 根癌農(nóng)桿菌LBA4404、植物表達載體pPZP212均由中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院生物技術(shù)研究所植物代謝工程實驗室提供。克隆載體pEASY-T1 Cloning Vector (10 ng/μL)和大腸桿菌(Escherichiacoli)感受態(tài)細胞Trans 1-T1購自北京全式金生物公司。

1.1.3 酶、試劑盒和主要的化學(xué)試劑TaqDNA聚合酶購自北京澤星生物公司；各種限制性內(nèi)切酶購自NEB公司；Toyobo 反轉(zhuǎn)錄試劑盒購自廣州美津生物技術(shù)有限公司；Go3S 柱離心式PCR產(chǎn)物回收試劑盒V3.1 K141購自申能博彩生物科技公司；Trizol購自上海生物工程有限公司； IPTG、X-gal、RQ1 RNase-Free DNase、T4DNA連接酶購自Promege公司。普通的化學(xué)藥品均為國產(chǎn)分析純試劑。

1.2 方 法

1.2.1 油菜Bna-miR169d基因的擴增 根據(jù)Bna-miR169d前體序列設(shè)計引物(圖1)，上游引物5′端添加BamHⅠ酶切位點，下游引物5′端添加SacⅠ酶切位點，引物序列分別為Bna-miR169dFw:GGATCCTAGAAGGAGATGTC; Bna-miR169dRv: GAGCTCTTGCTAGCGAAG-GT，引物由上海生工生物工程有限公司合成。以CTAB法從油菜幼苗中提取的DNA為模板，PCR擴增243 bp的Bna-miR169d前體序列片段。PCR反應(yīng)體系：Taq(2 U/μL) 0.5 μL，10×Taqreaction buffer 2.0 μL，dNTP mix (10 mmol/L each) 0.5 μL，Bna-miR169d Fw (10 μmol/L) 0.5 μL，Bna-miR169d Rv (10 μmol/L) 0.5 μL，油菜DNA 1.0 μL，dH2O 15 μL。PCR反應(yīng)條件：94 ℃預(yù)變性4 min；94 ℃變性40 s，55.9 ℃退火40 s,72 ℃延伸40 s，共35個循環(huán)；72 ℃延伸10 min。

紅色堿基為 miR169d成熟序列 Mature nucleotides of miR169d are red nucleotides

1.2.2 油菜Bna-miR169d基因的過表達載體構(gòu)建 取2.0 μL PCR產(chǎn)物進行15 g/L的瓊脂糖凝膠電泳，粗略估計PCR產(chǎn)物的擴增量。根據(jù)PCR產(chǎn)物量，按照載體pEASY - T1 Cloning Vector使用說明進行T連接反應(yīng)，反應(yīng)結(jié)束后轉(zhuǎn)化大腸桿菌Trans1-T1。通過藍白斑篩選得到的單克隆經(jīng)PCR和雙酶切鑒定后送北京中科希林生物公司用引物M13+進行測序驗證。用限制性內(nèi)切酶BamH Ⅰ和SacⅠ對pPZP212質(zhì)粒和測序正確的pEASY-T1-miR169d質(zhì)粒進行雙酶切，凝膠電泳切膠回收10 099 bp和243 bp的DNA片段，膠回收后的Bna-miR169d基因前體片段和pPZP212載體片段用T4DNA連接酶按照摩爾比6∶1，在恒溫16 ℃條件下連接過夜。取2 μLBna-miR169d基因前體片段與pPZP212載體片段連接的溶液，轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)Trans1-T1，再PCR和酶切鑒定陽性重組子35S∷Bna-miR169d(圖2)，對鑒定正確的陽性重組子搖菌后送北京中科希林生物公司用引物NOS70進行測序驗證。測序驗證正確的陽性重組子35S∷Bna-miR169d 電擊轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌LBA4404。

1.2.3 油菜的轉(zhuǎn)化及陽性植株鑒定 按照Bhalla等[15]的方法(略有改變)，通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)浸染油菜子葉柄法轉(zhuǎn)化油菜。經(jīng)Kanamycin不同梯度培養(yǎng)篩選到的生根壯苗煉苗移栽后，用CTAB法提取其DNA，以35SFw/Bna-mi-R169dRv2和35S50/ Bna-miR169dRv1兩對鑒定引物分別進行PCR擴增，15 g/L瓊脂糖凝膠電泳檢測，擴增出555 bp和305 bp條帶的為陽性株，PCR陽性對照模板為質(zhì)粒35S∷Bna-miR169d;陰性對照為未經(jīng)轉(zhuǎn)化的油菜基因組DNA。鑒定引物序列分別為35SFw：GGATTCCATTGCCCAGCTATCTGTC；Bna-miR169dRv2：GCT- AGCGAAGGTAAAATGTCTG；35S50：CAAGACCCTTCCTCTATATAAGG；Bna-miR169dRv1：GAGCTCTTGCTAGCGAAGGT。

圖2 表達載體35S∷Bna-miR169d T-DNA區(qū)結(jié)構(gòu)

1.2.4 過表達35S∷Bna-miR169d的T0代轉(zhuǎn)化株表型分析 以野生型油菜作對照，對PCR鑒定呈陽性的過表達35S∷Bna-miR169d的T0代轉(zhuǎn)化株進行生育期記載和表型觀察，包括葉片形態(tài)、花器結(jié)構(gòu)、株型等，并統(tǒng)計分析株高、分枝數(shù)、主花序長度、全株有效角果數(shù)、單株生產(chǎn)力和千粒質(zhì)量等。

2 結(jié)果與分析

2.1 油菜Bna-miR169d基因的分離

選取Bna-miR169d(MI0006460)為研究對象。以油菜DNA為模板，Bna-miR169dFw為正向引物，Bna-miR169dRv為反向引物進行PCR擴增Bna-miR169d基因的前體序列，片段長243 bp，電泳結(jié)果如圖3-a。PCR產(chǎn)物與pEASY - T1 Cloning Vector連接后，利用引物Bna-miR169dFw/Bna-miR169dRv、酶EcoRⅠ/HindⅢ分別對質(zhì)粒pEASY-T1-miR169d進行PCR、雙酶切鑒定，結(jié)果質(zhì)粒PCR條帶243 bp(圖3-b)，酶切條帶大小均為264 bp(圖3-c)，說明Bna-miR169d基因的前體序列PCR產(chǎn)物成功連接到克隆載體。并對pEASY-T1-miR169d測序驗證，序列長243 bp，與miRbase 21.0中比對結(jié)果一致，證明PCR擴增產(chǎn)物為Bna-miR169d基因的前體序列。

a.以油菜DNA為模板擴增 Bna-miR169d基因片段 PCR amplification for precursor fragments of Bna-miR169d from DNA of Brassica napus;b.pEASY-T1-miR169d的PCR鑒定 Identification of pEASY-T1-miR169d by PCR;c.EcoRⅠ/HindⅢ雙酶切鑒定 pEASY-T1- miR169d Identification of pEASY-T1- miR169d by EcoRⅠ/Hind Ⅲ double enzyme digestion；A、B.PCR擴增產(chǎn)物 PCR fragments；C.酶切產(chǎn)物 Enzyme digestion fragments；M.DNA分子量標準 Marker；N.陰性對照 Negative control

2.2 油菜Bna-miR169d基因植物過表達載體的構(gòu)建

用BamH Ⅰ和SacⅠ分別雙酶切植物表達載體質(zhì)粒pPZP212和測序驗證正確的克隆質(zhì)粒pEASY-T1-miR169d，切膠回收目的片段(圖4-a、4-b)，并連接。先用引物Bna-miR169d Fw和Bna-miR169d Rv 進行PCR擴增，再用酶EcoR Ⅰ，SacⅠ/XbaⅠ分別進行單酶切和雙酶切，酶切鑒定結(jié)果見圖5-a、5-b。EcoR Ⅰ單酶切產(chǎn)生的片段大小為474 bp，SacⅠ/XbaⅠ雙酶切產(chǎn)生的片段大小是247 bp，兩次酶切片段大小符合理論值。PCR和酶切均鑒定為陽性的重組子35S∷Bna-miR169d經(jīng)測序驗證獲得最終的植物表達載體pPZP212-Bna-miR169d。

2.3 農(nóng)桿菌介導(dǎo)浸染油菜子葉柄轉(zhuǎn)化油菜

帶有植物表達載體35S∷Bna-miR169d的農(nóng)桿菌LBA4404(OD650nm=0.5)懸浮液共計浸染200個附帶2 mm葉柄的油菜子葉(表1，圖6-a)，在恢復(fù)培養(yǎng)3 d后，進行愈傷誘導(dǎo)，總共誘導(dǎo)出愈傷155個(表1，圖6-b)，出愈率77.5%。選取無褐化、無污染的培養(yǎng)皿中的愈傷120個，在低質(zhì)量濃度25 mg/L Kanamycin抗性的芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基中生長，誘導(dǎo)出芽47個(表1，圖6-c)，芽誘導(dǎo)率 39.2%。挑取40個生長健壯、無污染和無褐化的發(fā)生芽在低質(zhì)量濃度25 mg/L Kanamycin抗性的芽生長培養(yǎng)基中繼續(xù)生長4周，然后轉(zhuǎn)移至高質(zhì)量濃度50 mg/L Kanamycin抗性的篩選培養(yǎng)基中生長4周，篩選出綠苗數(shù)20個，白化苗17個，壞死和污染的苗3個。將所有綠苗轉(zhuǎn)接到生根培養(yǎng)基上，1月后發(fā)生根的苗數(shù)為14株(表1，圖6-d)，出根率為70%。通過高質(zhì)量濃度50 mg/L Kanamycin抗性篩選后，將初步確定為陽性的14株抗性轉(zhuǎn)化植株苗煉苗后，移栽在花盆中進行培養(yǎng)。

a.pEASY-T1-miR169d酶切后膠回收的 Bna-miR169d片段 Fragment of Bna-miR169d recovered from pEASY-T1-miR169d after enzyme digestion;b.pPZP212酶切片段的膠回收 Fragment of pPZP212 recovered after enzyme digestion

a.EcoRⅠ單酶切鑒定35S∷Bna-miR169d Identification of 35S∷Bna- miR169d by EcoR Ⅰ digestion；b.SacⅠ/XbaⅠ雙酶切鑒定35S∷Bna-miR169d Identification of 35S∷Bna-miR169d by SacⅠ/Xba Ⅰ digestion;C.酶切產(chǎn)物 Enzyme digestion fragments；M.分子量標準 Marker

表1 農(nóng)桿菌介導(dǎo)浸染油菜子葉柄轉(zhuǎn)化油菜效率統(tǒng)計

a.恢復(fù)培養(yǎng) Recovery culture；b.愈傷誘導(dǎo) Callus induction；c.芽誘導(dǎo) Bud induction；d.根誘導(dǎo) Root induction

2.4 轉(zhuǎn)化35S∷Bna-miR169d油菜株的PCR鑒定

以提取的14株轉(zhuǎn)化35S∷Bna-miR169d的油菜苗基因組DAN為模板，利用35SFw/ Bna-miR169d Rv2和35S50/ Bna-miR169d Rv1兩對引物分別對這些DNA進行PCR擴增，結(jié)果表明，35SFw/Bna-miR169d Rv2和35S50/Bna-miR169d Rv1均有4株擴增出目的條帶(圖7-a，7-b)，條帶大小分別為預(yù)期的555 bp和305 bp，從而最終確定過表達Bna-miR169d基因的轉(zhuǎn)基因油菜共4株。

2.5 轉(zhuǎn)化35S∷Bna-miR169d油菜株T0代表型分析

以野生型油菜作對照，對PCR鑒定呈陽性的過表達35S∷Bna-miR169d的T0代轉(zhuǎn)化株進行表型觀察，結(jié)果顯示過表達Bna-miR169d油菜株葉片形態(tài)、花器結(jié)構(gòu)與對照相比沒有明顯變化，其中有2株過表達Bna-miR169d油菜株開花期提前(圖8),較其他2株轉(zhuǎn)Bna-miR169d油菜株及野生型對照株生育期縮短10～12 d。

a.35SFw/ Bna- miR169dRv2擴增 PCR amplification by primers 35SFw/Bna- miR169dRv2;b.35S50/ Bna- miR169dRv1擴增 PCR amplification by primers 35S50/Bna- miR169dRv1;P.陽性對照 Positive control;N.陰性對照 Negative control；M.DNA分子量標準 Marker

圖8 轉(zhuǎn)基因油菜表型

3 討論與結(jié)論

miRNA是一類長度約為21～24 nt的內(nèi)源性非編碼RNA，在轉(zhuǎn)錄后水平切割mRNA或抑制翻譯來調(diào)控靶基因的表達，幾乎參與了動植物體內(nèi)所有重要的生命活動，調(diào)控相關(guān)基因的表達[16]，目前發(fā)現(xiàn)植物miRNA靶標中的50%左右是在發(fā)育模式中起重要作用的轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子[17]。目前miRBase中油菜miR169家族有 16 個成員，關(guān)于油菜miR169家族基因克隆和功能研究均未見報道。雖然對油菜進行了早熟相關(guān)基因的克隆與轉(zhuǎn)化研究，并在擬南芥中也已鑒定了幾個參與調(diào)控早花發(fā)育的miRNAs，如miR156、miR169d，但是目前的研究結(jié)果仍是支離破碎，各個靶基因是獨立的，還沒有建立起miRNA調(diào)控早花的遺傳控制網(wǎng)絡(luò)。相對于模式植物擬南芥，miRNA參與油菜早花發(fā)育的分子機制研究幾乎是一片空白，目前還沒有從油菜中克隆出任何控制早熟相關(guān)的miRNA，這與早熟在油菜育種中的重要地位極不相符。因此，亟需進一步探索油菜早熟相關(guān)miRNA基因表達的調(diào)控機制。

本研究克隆了油菜Bna-miR169d基因前體序列，并將構(gòu)建的植物表達載體35S∷Bna-miR169d在油菜中進行了轉(zhuǎn)化研究，初步鑒定了油菜Bna-miR169d基因的功能。轉(zhuǎn)化35S∷Bna-miR169d的4株T0代油菜陽性株中有2株表現(xiàn)早花現(xiàn)象，生育期縮短，其他2株陽性株與野生型油菜表型一致。至于該2株過表達35S∷Bna-miR169d未表現(xiàn)變異的陽性株油菜，分析可能是35S∷Bna-miR169d在受體中插入位點不同或轉(zhuǎn)化拷貝數(shù)低，具體原因還須通過Northern blotting等分子實驗手段進一步驗證，并繼續(xù)進行遺傳轉(zhuǎn)化，以獲得更多的陽性株系，最終確定miR169d過表達引起的表型變化。通過表型分析，初步推測油菜miR169d可能通過調(diào)控靶基因的表達參與油菜的早花發(fā)育。利用生物信息學(xué)預(yù)測到一個Bna-miR169d的靶基因NF-YA，是一種結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子，與NF-YB和NA-YC結(jié)合形成三聚體，參與下游基因的調(diào)控。在擬南芥中，miR169家族有14個成員，有4種不同的序列。miR169靶向的NF-YA基因，是NF-YA的家族成員，是一類CCAAT-box結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子，據(jù)報道[18]，在擬南芥中過表達HAP3b (NF-YB)、HAP2a(NF-YA)會延遲開花時間。油菜中NF-YA是否為Bna-miR169d真正的靶基因，過表達NF-YA是否會延遲油菜開花，還有待于進一步研究。

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(責任編輯：潘學(xué)燕 Responsible editor:PAN Xueyan)

Isolation and Preliminary Overexpression ofBna-miR169dGene in Oilseed Rape

DONG Yun1，WANG Yi1，JIN Fengwei1，SUN Wancang2，LIU Zigang2, FANG Yan2， XU Miaoyun3and WANG Lei3

(1.Crop Research Institute, Gansu Academy of Agricultural Sciences, Lanzhou 730070, China; 2. Research Center for Rapeseed Engineering Technology of Gansu, Lanzhou 730070, China； 3.Biotechnology Research Institute, Chinese Academy of Agricultural Sciences, Beijing 100081, China)

Micrornas (miRNAs) are endogenous 21-24 nt nucleotide of non-coding RNA, which play an important role in regulating gene expression.miR169family is the largest plant miRNA family and its family members can regulate plant growth and development. But little systematic research has done in this area. In order to explore the regulating functionmiR169in rape, the pre-miR169dwas cloned from rape variety ‘Westar’ by PCR , and successfully constructed the plant expression vector of pre-miR169dinto vector pPZP212, and then was transformed into variety ‘Westar’ by Agrobacterium tumefaciens mediated approach. Four positive transgenic lines were obtained, two of them flowered early, growth period was 10-12 days’ shorter than the control. The results showwed thatBna-miR169dmay regulate the expression of target genes by flowering pathways.

Rapeseed; Flowering；Early maturity;miR169; Genetic transformation

DONG Yun, male,Ph.D,associate research fellow.Research area:rapeseed breeding. E-mail:dongyungs@163.com

XU Miaoyun，female,Ph.D,associate research fellow.Research area:maize functional genomics of flowering and seed development.E-mail:xumiaoyun76@163.com

2016-02-18

2016-03-20

國家自然科學(xué)基金(31260334)；甘肅省自然科學(xué)基金(1308RJZA205)；甘肅省農(nóng)科院創(chuàng)新專項(2013GAAS16)；甘肅省油菜工程技術(shù)研究中心項目(1306NTGA022)。

董 云，男，博士，副研究員,主要從事油菜育種研究。E-mail:dongyungs@163.com

徐妙云，女，博士，副研究員，從事植物開花時間和種子發(fā)育調(diào)控機制研究。E-mail:xumiaoyun76@163.com 王 磊，男，博士，研究員，從事玉米抗逆與生殖發(fā)育調(diào)控及玉米基因工程研究。E-mail：caaswlwl@163.com

日期：2016-12-12

網(wǎng)絡(luò)出版地址：http://www.cnki.net/kcms/detail/61.1220.S.20161212.1114.018.html

S565.4

A

1004-1389(2016)12-1809-07

Received 2016-02-18 Returned 2016-03-20

Foundation item The National Science Foundation of China (No.31260334);Science Foundation of Gansu Province(No.1308RJZA205)；the Special Innovation Program of Gansu Academy of Agricultural Sciences(No.2013GAAS16);the Program of Research Center for Rapeseed Engineering Technology (No.1306NTGA022).

WANG Lei，male, Ph.D,research fellow.Research area:functional genomics of stress resistance and reproductive development.E-mail：caaswlwl@163.com