宋 聰， 黃亞麗*， 謝晨星， 賈振華， 宋水山

(1.河北省科學(xué)院 生物研究所，河北 石家莊 050081；2.河北省主要農(nóng)作物病害微生物控制工程技術(shù)研究中心，河北 石家莊 050081；3.河北工業(yè)大學(xué) 化工學(xué)院，天津 300130)

河北省冬棗黑斑病病原菌的分離鑒定及生物防治初探

宋 聰1,2， 黃亞麗1,2*， 謝晨星1,3， 賈振華1,2， 宋水山1,2

(1.河北省科學(xué)院 生物研究所，河北 石家莊 050081；2.河北省主要農(nóng)作物病害微生物控制工程技術(shù)研究中心，河北 石家莊 050081；3.河北工業(yè)大學(xué) 化工學(xué)院，天津 300130)

冬棗黑斑病是冬棗重要病害之一，目前多以化學(xué)農(nóng)藥進(jìn)行防治，給自然環(huán)境和人類健康帶來了嚴(yán)重的威脅。河北省是冬棗種植大省，進(jìn)行冬棗黑斑病病原菌的分離鑒定對冬棗黑斑病的有效防治具有重要意義。2014年8月至10月從河北省滄州、衡水、邯鄲、邢臺等地采集冬棗黑斑病病果，采用PDA培養(yǎng)基進(jìn)行病原菌分離，從病樣中共分離出2株分離頻率較高的真菌，經(jīng)過回接和再分離實(shí)驗(yàn)篩選出河北省冬棗黑斑病的致病菌株，經(jīng)形態(tài)學(xué)和ITS序列分析初步確定該菌為細(xì)交鏈格孢(Alternariaalternata)。以枯草芽胞桿菌J18進(jìn)行冬棗采后黑斑病的防治，濃度為1×108cfu/mL的菌液對病害的防效為80.67%。

冬棗；黑斑??；細(xì)交鏈格孢；鑒定；生物防治

冬棗是我國稀有的優(yōu)質(zhì)晚熟鮮食棗果品種，其營養(yǎng)豐富、品質(zhì)優(yōu)良，倍受消費(fèi)者青睞。冬棗市場供不應(yīng)求，種植效益十分可觀，促使冬棗栽培面積迅速擴(kuò)大、產(chǎn)量逐年遞增，成為我國河北、山東、新疆等地農(nóng)業(yè)經(jīng)濟(jì)又一重要支柱。隨著冬棗種植業(yè)的發(fā)展，冬棗病害也普遍發(fā)生。黑斑病是一種危害非常嚴(yán)重的冬棗病害，使棗果產(chǎn)量、品質(zhì)下降，不能貯存，嚴(yán)重影響了棗果的商品性，多數(shù)發(fā)病棗園的直接經(jīng)濟(jì)損失在20%以上，嚴(yán)重制約了冬棗產(chǎn)業(yè)的健康發(fā)展[1]。探明冬棗黑斑病的病原菌，是冬棗果實(shí)黑斑病有效控制和生物防治的前提。隨著冬棗黑斑病的蔓延，對不同地區(qū)冬棗黑斑病病原菌進(jìn)行分離鑒定的相關(guān)研究逐漸增多，然而相關(guān)的研究結(jié)果存在很大的差異[2-4]。河北省是我國冬棗的重要產(chǎn)區(qū)，明確黑斑病病原菌對河北冬棗產(chǎn)業(yè)的健康發(fā)展和有效防治具有重要意義。本研究從河北省不同冬棗產(chǎn)區(qū)進(jìn)行黑斑病病果的采集和病原菌分離，并以本實(shí)驗(yàn)室分離保存的拮抗菌株枯草芽胞桿菌J18[5]對冬棗采后黑斑病進(jìn)行防治，旨在為冬棗采后黑斑病的有效防治提供理論依據(jù)和菌種資源。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 樣品采集 2013年8月5日至10月10日在冬棗黑斑病的主要發(fā)病期內(nèi)，于河北省滄州、衡水、邯鄲、邢臺4個地區(qū)的冬棗果園采集冬棗黑斑病病果。

1.1.2 培養(yǎng)基 冬棗黑斑病病原菌分離培養(yǎng)基為PDA培養(yǎng)基(含有濃度為300 μg/mL的慶大霉素)。

1.1.3 生防菌株 枯草芽胞桿菌J18 (BacillussubtilisJ18)，由本實(shí)驗(yàn)室分離鑒定。

1.2 方法

1.2.1 病原菌分離 將冬棗病果用75%的酒精表面消毒30 s后，滅菌水沖洗3次，用滅菌手術(shù)刀從病健交界處切取2～3 mm的組織塊，取病斑5塊置于PDA培養(yǎng)基中，28 ℃培養(yǎng)5 d，觀察記錄分離菌的菌落形態(tài)、種類和數(shù)量，統(tǒng)計(jì)各種菌的分離頻率即各菌的個數(shù)占所有菌數(shù)的百分比。將分離獲得的菌落劃線純化后編號，接種到PDA試管斜面培養(yǎng)基4 ℃冰箱保存。

1.2.2 分離物的致病性測定 挑取分離真菌菌塊接種到PDA培養(yǎng)基上，28 ℃培養(yǎng)7 d，用含有0.05%Tween-80的無菌水沖洗菌落表面，3層紗布過濾后收集孢子懸液，并將孢子濃度調(diào)整為1×105cfu/mL備用。病原菌接種方式分為刺傷接種和無傷接種。刺傷接種方法：挑選健康的冬棗果實(shí)30個，75%酒精消毒30 s，無菌水洗滌3次，用直徑5 mm的打孔器在果腰部位打孔，孔內(nèi)接種10 μL孢子懸液；無傷接種方法：采用噴壺將病原菌孢子液直接噴灑到經(jīng)酒精和無菌水清洗過的冬棗果實(shí)上，以冬棗表面均勻覆蓋液滴為標(biāo)準(zhǔn)。處理后的果實(shí)分別裝入塑料袋中，置于25 ℃培養(yǎng)箱中，每天觀察果實(shí)的發(fā)病癥狀，統(tǒng)計(jì)7 d后致病率。對發(fā)病果實(shí)進(jìn)行再分離，觀察菌落及孢子形態(tài)是否與所接種真菌相同。

1.2.3 冬棗黑斑病病原菌的形態(tài)學(xué)特征 將篩選所得的病原菌接種到PDA培養(yǎng)基上進(jìn)行活化，28 ℃培養(yǎng)3 d后，在菌落邊緣打取直徑5 mm的菌塊轉(zhuǎn)接到PDA培養(yǎng)基的中央，每天定時觀察記錄菌落形態(tài)及測定菌落直徑。菌落產(chǎn)孢后，挑取少量菌絲用光學(xué)顯微鏡觀察菌絲和孢子形態(tài)。

1.2.4 冬棗黑斑病病原菌的IST序列擴(kuò)增及系統(tǒng)發(fā)育樹構(gòu)建 將供試菌株轉(zhuǎn)接到PDA平板上活化培養(yǎng)5 d，用滅菌水沖洗菌落表面并收集孢子液。吸取1 mL 孢子液接種到50 mL PDA液體培養(yǎng)基中，28 ℃、150 r/min 培養(yǎng) 3 d，過濾收集菌絲，采用北京天根生物科技有限公司的真菌DNA提取試劑盒進(jìn)行基因組DNA的提取。以病原真菌DNA 為模板，以ITS1：5′-TCCGTAGGTGAACCT-GCGG-3′和 ITS4：5′-GCATATCAATAAGCGGAGG-A-3′為引物，進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR程序：94 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃ 1 min，54 ℃ 1 min，72 ℃ 1.5 min，35 個循環(huán)；72 ℃延伸10 min。將PCR擴(kuò)增片段送上海生物工程有限公司測序，采用 MEGA 4.0 軟件進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育樹構(gòu)建。

1.2.5 生防菌株J18對冬棗黑斑病的抑菌效果 在PDA平板中央接種直徑為5 mm 的病原真菌(2-6a)的菌塊，在距平板中央 3 cm 處均勻接種4處J18菌，28 ℃培養(yǎng) 5 d 后，測量抑菌帶寬度。

1.2.6 生防菌株J18對冬棗采后黑斑病的防治效果 用直徑5 mm的打孔器在冬棗健康果實(shí)的中部打孔，分別在果實(shí)傷口處接種濃度為1×108、1×107、1×106cfu/mL的J18菌懸液10 μL，以無菌水為對照，2 h后再加入10 μL濃度為1×105cfu/mL的病原菌孢子懸浮液。將果實(shí)放入400 mm×700 mm×280 mm塑料筐內(nèi)，筐口封保鮮膜保濕，25 ℃恒溫放置。7 d后測定果實(shí)的發(fā)病率和病斑直徑，每處理30個果實(shí)，3次重復(fù)，試驗(yàn)重復(fù)2次。

2 結(jié)果與分析

2.1 冬棗黑斑病病果中真菌的分離

從河北省滄州、衡水、邯鄲、邢臺四個地區(qū)共采集黑斑病病棗260個，從病健交界部位進(jìn)行病原菌分離，得到2株分離頻率較高的真菌(表1)，分別命名為2-3a、2-6a，其中2-6a分離頻率最高，四個地區(qū)均在65%以上，以滄州地區(qū)最高，達(dá)到91.5%。

表1 冬棗黑斑病病果中分離的真菌 及各種真菌的分離頻率Table 1 The fungi and ration screened from Dongzao Fruit with black spot disease

2.2 分離真菌的致病性測定

采用刺傷和無傷接種兩種方法進(jìn)行分離真菌的回接。刺傷回接試驗(yàn)結(jié)果表明，菌株2-6a回接到冬棗果實(shí)上3 d后出現(xiàn)病斑，病斑直徑約5～10 mm，圓形或半圓形，病部色澤為灰褐色，病斑下為軟爛組織，發(fā)病癥狀與自然情況下黑斑病癥狀相似；接種7 d時，致病率為75.6%。無傷接種2-6a，發(fā)病慢且輕，接種7 d后冬棗黑斑病致病率為40%。對出現(xiàn)典型癥狀的果實(shí)再次分離病原菌，分離到的真菌與2-6a菌落形態(tài)相同，再分離頻率在80%以上。刺傷和無傷接種2-3a在冬棗上均不能引起黑斑病發(fā)生(表2)。

表2 冬棗黑斑病分離物回接健康 果實(shí)的致病率Table 2 The pathogenicity rate of fungi screened from Dongzao Fruit with black spot disease

2.3 冬棗黑斑病病原真菌的鑒定

2.3.1 病原菌形態(tài)特征 菌株2-6a接種到PDA培養(yǎng)基上，首先長出白色絨狀菌絲，隨著菌落的擴(kuò)展，菌落中央成為墨綠色，外緣白色，平均生長速度為1.02 cm/d。(圖1A)。顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn)菌絲有隔，分生孢子為紡錘狀、深褐色、中間有隔、頂部有鳥嘴狀突起(圖1B)。

圖1 菌株2-6a的菌落及分生孢子顯微照片F(xiàn)ig.1 The photo of 2-6a colony and conidiosporeA：菌落照片；B：400倍顯微鏡照片A：GOLONG;B:400×Photomicrograph

圖2 菌株2-6a系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.2 Neighbour-joining tree based on 16S rRNA gene sequences of strain 2-6a

2.3.2 2-6a的分子生物學(xué)鑒定 以2-6a基因組DNA為模板，利用引物ITS1/ITS4 擴(kuò)增出長度約650 bp的條帶，經(jīng)測序并在GenBank中BLAST比對，證實(shí)該P(yáng)CR產(chǎn)物為真菌核糖體 ITS 特異片段，與鏈格孢霉屬(Alternariasp.)的親緣關(guān)系較近，同源性達(dá)到 99%以上。系統(tǒng)發(fā)育樹分析顯示，該菌與細(xì)交鏈格孢(Alternariaalternata)、細(xì)極鏈格孢(Alternariatenuis)聚合于同一分支，結(jié)合形態(tài)學(xué)特征[6]鑒定該菌為細(xì)交鏈格孢(Alternariaalternata)，見圖2。

2.4 枯草芽胞桿菌J18對冬棗黑斑病菌的抑制作用及其對采后黑斑病的防效

2.4.1 枯草芽胞桿菌J18對冬棗黑斑病菌的抑制作用 J18是本實(shí)驗(yàn)室分離保存的一株具有拮抗作用的枯草芽胞桿菌，該菌對梨黑斑病及采后病害具有良好的防效[5]。對冬棗黑斑病的拮抗試驗(yàn)表明(圖3)，J18也能夠顯著抑制冬棗黑斑病菌的生長，抑菌帶寬度為11.2 mm。

圖3 J18對冬棗黑斑病菌的拮抗作用Fig.3 The antagonistic on Dongzao Fruit black spot disease by J18A：對照平板;B:J18與黑斑病病原菌的拮抗平板A：CK；B：J18 antagonist with black spot disease on plate

2.4.2 J18對冬棗采后黑斑病的防治效果 與對照相比，3種濃度的拮抗菌J18均能降低冬棗黑斑病的致病率，控制病斑直徑的擴(kuò)展，所有J18噴施處理的冬棗發(fā)病率和病斑直徑均與清水對照存在顯著差異(P≤0.05)。分析各處理冬棗黑斑病致病率發(fā)現(xiàn)，J18菌液濃度與冬棗致病率呈反比，菌液濃度越高，其致病率越低，其中濃度為1×108cfu/mL的處理防病效果最好，為80.67%，病斑直徑比對照小8.41 mm,見表3。

表3 不同濃度J18菌液對冬棗采后 黑斑病的抑制作用Table 3 The control efficiency on postharvest Dongzao Fruit black spot disease by J18 at

注：單因素方差分析，P≤0.05，不同字母表示差異顯著

3 討 論

對從河北省滄州、衡水、邯鄲、邢臺四個地區(qū)采集的冬棗黑斑病果實(shí)進(jìn)行分離，得到2株分離頻率較高的菌株，其中菌株2-6a分離頻率最高，四個地區(qū)均在65%以上，其中滄州地區(qū)最高為91.5%。回接健康冬棗果實(shí)發(fā)現(xiàn)，真菌2-6a的刺傷接種致病率為75.6%，無傷接種的致病率為40%；而真菌2-3a則不能引起冬棗果實(shí)黑斑病的發(fā)生，初步確定2-6a是冬棗黑斑病的病原菌，而2-3a可能是一種冬棗黑斑病腐生真菌。通過形態(tài)學(xué)和ITS序列分析進(jìn)行2-6a的分類鑒定，確定該菌為細(xì)交鏈格孢(Alternariaalternata)。吳玉柱等[2]對山東冬棗黑斑病的病原菌進(jìn)行分離鑒定，證實(shí)細(xì)極鏈格孢(Alternariatenuissima)為山東冬棗黑斑病的主要病原菌；王軍等[3]通過回接健康果實(shí),確定了導(dǎo)致山東沾化縣和東營市河口區(qū)冬棗黑斑病的致病菌為細(xì)交鏈格孢菌(Alternariaalternata)；宗淑萍等[4]則確定桑殼小圓孢菌(Coniothyriumfucsidulum)、仁果 莖 點(diǎn) 霉(Phomapomirum)以 及 細(xì) 交 鏈 格 孢(Alternariaalternata)是冬棗黑斑病的病原菌，其中細(xì)交鏈格孢只參與混合侵染，在單獨(dú)侵染時不具備治病能力。目前，對引起冬棗黑斑病的病原菌還沒有統(tǒng)一的結(jié)論，因此潛在的危害性巨大。明確不同地區(qū)冬棗黑斑病病原菌的種類，對該病的有效防治具有重要意義。

冬棗黑斑病不僅危害生長期的冬棗果實(shí)，對冬棗采后貯藏品質(zhì)影響更大，冬棗黑斑病菌侵染的果實(shí)在常溫下放置 10 d，腐爛率高達(dá)80%，低溫貯藏 60 d 左右，果實(shí)腐爛嚴(yán)重，采取安全有效的冬棗黑斑病防治方法成為當(dāng)務(wù)之急。生物防治是目前水果采后病害防治的研究熱點(diǎn)，然而冬棗采后病害生物防治的研究相對較少，目前在國內(nèi)僅有從冬棗果實(shí)表面1株酵母菌[7]、1株成團(tuán)泛菌[8]以及從土壤中篩選出1株枯草芽胞桿菌[9]進(jìn)行冬棗采后黑斑病防治的報(bào)道，本研究利用具有優(yōu)良拮抗作用的J18菌株進(jìn)行冬棗黑斑病的防治，在濃度為1×108cfu/mL的情況下病害防效達(dá)到80.67%。該拮抗菌株能否跟其他的果疏貯藏保鮮措施相結(jié)合，及其拮抗原理尚需進(jìn)一步研究。

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Isolation and Identification of the Pathogen Causing Black Spot Disease in Dongzao Fruits and Study on the Biocontrol

SONG Cong1,2, HUANG Ya-li1,2, XIE Chen-xing1,3, JIA Zhen-hua1,2, SONG Shui-shan1,2

(1.Inst.ofBiol.,HebeiProv.Acad.,Shijiazhuang050081; 2.HebeiProv.MicrobialControlEngin.Tech.Res.Ctr.forMainCropDis.,Shijiazhuang050081; 3.Coll.ofChem.Engin.,HebeiEngin.Uni. ，Tianjin300130)

Winter jujube of Dongzao (Zizyphus jujuba Mill cv. Dongzao) black spot disease is one of important diseases, at present it is control mainly by chemical pesticide which causes serious threat of natural environment and human health. Hebei province is major province in Dongzao cultivation, therefore, the isolation and characterization of pathogens of Dongzao black spot disease possesses important significance for controlling the disease. Samples of sick fruit with black spot disease were collected from August to October in 2014 in Cangzhou, Hengshui, Handan, and Xingtai and other areas of Hebei Province, two fungal strains with high isolation rate were isolated from the samples. Back inoculation and re-isolation experiment had screened the pathogen that caused Dongzao black spot disease in Hebei Province. The pathogen was identified initially asAlternariaalternatabased on the morphology and ITS sequencing analysis of the fungus.BacillussubtilisJ18 was taken to carry out the control the postharvest black spot disease of Dongzao fruit. The controlling efficiency was 80.67% with 1×108cfu/mL bacterial suspension.

Dongzao (Zizyphus jujuba Mill cv. Dongzao); black spot disease;Alternariaalternate; identification; biocontrol

河北省科技計(jì)劃項(xiàng)目(14226501D)；河北省科技條件建設(shè)項(xiàng)目(15963203D)

宋聰 女，碩士。主要從事植物病害的生物防治研究。Tel：0311-83014618，E-mail：songcong1982@126.com

*通訊作者。女，博士，研究員，碩士生導(dǎo)師。研究方向?yàn)橹参锊『Φ纳锓乐?。Tel: 0311-83014618，E-mail：huangyali2291@163.com

2015-10-14；

2016-01-27

Q78

A

1005-7021(2016)05-0085-05

10.3969/j.issn.1005-7021.2016.05.015