張慧慧，李春榮*，王文科，鄧紅章，張徽，韓楓

（1.旱區(qū)地下水文與生態(tài)效應(yīng)教育部重點實驗室，長安大學環(huán)境科學與工程學院，西安 710054；2.中國地質(zhì)調(diào)查局水文地質(zhì)環(huán)境地質(zhì)調(diào)查中心，河北 保定 071051）

高通量測序助力地質(zhì)封存CO2泄漏情景下土壤細菌群落信息的挖掘

張慧慧1，李春榮1*，王文科1，鄧紅章1，張徽2，韓楓1

（1.旱區(qū)地下水文與生態(tài)效應(yīng)教育部重點實驗室，長安大學環(huán)境科學與工程學院，西安 710054；2.中國地質(zhì)調(diào)查局水文地質(zhì)環(huán)境地質(zhì)調(diào)查中心，河北 保定 071051）

CO2地質(zhì)封存過程復雜，存在CO2泄漏風險，進而會影響土壤生態(tài)系統(tǒng)，為研究地質(zhì)封存CO2泄漏應(yīng)對措施，以玉米為研究對象，采用人工控制釋放CO2系統(tǒng)研究了玉米對地質(zhì)封存CO2泄漏的響應(yīng)特征，并應(yīng)用高通量測序技術(shù)分析了玉米土壤細菌群落結(jié)構(gòu)及遺傳多樣性。結(jié)果表明：土壤CO2濃度為30×104μL·L-1（30 cm埋深處CO2濃度）時，玉米表現(xiàn)出較好的適應(yīng)能力，當CO2泄漏量增加到40×104μL·L-1以上時，玉米葉片等各項生長指標均表現(xiàn)為受脅迫特征；高通量測序結(jié)果顯示試驗共獲得4個土壤樣本的70 948個OTUs，但僅3.32%為4種泄漏條件下土壤所共有；遺傳信息表明土壤細菌多樣性和豐富度變化與CO2泄漏濃度密切相關(guān)；變形菌門、擬桿菌門和酸桿菌門等為土壤優(yōu)勢菌群，而酸桿菌門在土壤CO2濃度達40×104μL·L-1下相對豐度大幅增加，暗示其可用作地質(zhì)封存CO2泄漏對土壤生態(tài)系統(tǒng)影響的指示菌?？梢娦孤┑腃O2會影響農(nóng)作物生長及土壤細菌群落特征，而變化的土壤細菌多樣性會影響農(nóng)田生態(tài)系統(tǒng)功能等。

CO2地質(zhì)封存；CO2泄漏；玉米；生理特征；高通量測序；土壤細菌群落

自1950年以來，全球氣候變暖已是毋庸置疑的事實，它將成為21世紀人類所要面臨的一項巨大挑戰(zhàn)，嚴重制約著人類社會和經(jīng)濟的可持續(xù)發(fā)展。在導致氣候變化的自然因素和人為因素中，大量人為排放的溫室氣體如CO2、CH4和N2O等已引起各國的廣泛關(guān)注，尤其是CO2作為最重要的人為溫室氣體，其排放量及對全球氣候變暖的貢獻遠超過其他溫室氣體[1]。預(yù)計我國2015—2030年期間，CO2排放量的年均增長率為3.3%，2030年將排放CO2114Gt[2]。在以此為背景的氣候條件下，尋求新興的、具有巨大規(guī)模碳減排潛力的技術(shù)已刻不容緩。目前，CO2捕集與儲存（Carbon capture and storage，CCS）技術(shù)被認為是最有效的且最具有前景的CO2減排方法之一，并且各國在CO2地質(zhì)儲存技術(shù)方面的研究已經(jīng)實現(xiàn)了工程化[3]。但是，從埋存的安全角度來考慮，該方法并不是一勞永逸的，仍存在泄漏的風險。滲漏的CO2可能會導致地下水污染，誘發(fā)地震等自然災(zāi)害，對植被、土壤等產(chǎn)生不同程度的負面影響，進而威脅到人類的生存和健康[4]。因此，研究地質(zhì)儲存CO2泄漏對生態(tài)環(huán)境的影響顯得至關(guān)重要。目前國內(nèi)有關(guān)CO2濃度升高對土壤環(huán)境及植物生長影響的報道較多，但關(guān)于CCS泄漏對土壤生態(tài)環(huán)境的影響卻鮮見報道，尤其是關(guān)于高濃度CO2對土壤微生態(tài)環(huán)境的影響及其作用機制的研究尚未得到一致結(jié)論[5-6]。

近年來，分子生物學和高通量測序技術(shù)的飛速發(fā)展，為這一領(lǐng)域的研究提供了極大的便利。土壤宏基因組學尤為值得關(guān)注。它使得人類對環(huán)境微生物的研究已不再局限于傳統(tǒng)的實驗室培養(yǎng)，而是結(jié)合豐富的生物學技術(shù)和方法，揭示微生物與環(huán)境之間、微生物之間相互作用的規(guī)律，為從群落結(jié)構(gòu)水平上深入解析微生物的結(jié)構(gòu)和功能以及微生物對氣候變化的響應(yīng)和反饋研究提供了全新的視角[7]。

本文通過人工模擬封存CO2泄漏試驗，探討了玉米對封存CO2泄漏的耐受性并在確定作物閾值上限的前提下，采用高通量測序技術(shù)系統(tǒng)地分析了CO2泄漏條件下土壤細菌群落組成以及遺傳多樣性的變化，旨在為封存CO2泄漏的風險評估提供理論支持。

1 材料與方法

1.1 試驗點概況

試驗在“旱區(qū)地下水文與生態(tài)效應(yīng)教育部重點實驗室”及“陜西省地下水與生態(tài)環(huán)境工程中心”進行。模擬試驗供試土壤樣品采自鄂爾多斯靖邊境內(nèi)未擾動黃土，土壤置室外堆放約數(shù)月。試驗前測得土壤pH值為8.28，全氮0.240 g·kg-1，全磷0.505 g·kg-1，全鉀18.60 g·kg-1，速效磷13.24 mg·kg-1，速效鉀109.0 mg· kg-1，銨態(tài)氮0.73 mg·kg-1，硝態(tài)氮18.09 mg·kg-1。試驗周期為2015年7月至2015年9月。

1.2 模擬試驗平臺設(shè)計

1.2.1 CO2控制釋放裝置

試驗采取桶栽植株底部通CO2的處理方式，工藝流程如圖1。每個試驗桶直徑60 cm，高70 cm，距桶底5 cm設(shè)進氣連接閥，距桶底10 cm處內(nèi)埋設(shè)氣體分布盤支架并平置多孔性氣體分布盤，分布盤管上鋪墊雙層80目的樹脂網(wǎng)。稱取50 kg供試土壤分別裝入各個試驗桶、壓實，使得土壤厚度均為50 cm，在距土層表面30 cm處埋設(shè)土壤氣相CO2濃度監(jiān)測探頭，監(jiān)測耕作層土壤中CO2濃度。充分噴淋潤濕土層，使土壤含水率處于9%～11%，放置48 h，下種。玉米幼苗生長10 d后，人工控制CO2氣體以不同速率和通量由試驗桶底向土壤中釋放。

1.2.2 CO2泄漏濃度的設(shè)置

為了系統(tǒng)考查高濃度CO2入侵條件下，玉米對封存CO2泄漏的耐受性并確定作物的閾值上限，把CO2入侵濃度作為衡量其泄漏程度的重要指標[8]。結(jié)合國內(nèi)外相關(guān)研究成果[9-10]，盡量將玉米對泄漏CO2的耐受閾值包含在內(nèi)的原則，四個試驗區(qū)之間的CO2濃度施加梯度設(shè)置得較寬，即：對照Y0（不通CO2）、Y1 50×104μL·L-1、Y2 70×104μL·L-1、Y3 100×104μL·L-1。運行過程中，3個泄漏處理利用二氧化碳氣罐作為供氣源，連接氣體流量計控制流量，各試驗桶均自處理之日起至試驗結(jié)束整個過程中不間斷通入CO2。通過調(diào)節(jié)球閥氣壓大小和各試驗桶流量計的注入速率使植株下部到達的CO2氣體濃度盡量保持在設(shè)定范圍內(nèi)。試驗中，利用便攜式CO2測定儀監(jiān)測土壤30 cm埋深處CO2濃度，發(fā)現(xiàn)各組泄漏情景實測CO2濃度近似，依次為：0.05×104μL·L-1（對照Y0）、30×104μL·L-1（Y1）、40×104μL·L-1（Y2）、92×104μL·L-1（Y3）。

圖1 人工模擬CO2釋放流程圖Figure 1 Flow chart of manual simulation for CO2leakage

1.3 測定指標及分析方法

1.3.1 植物生長形態(tài)及生理指標測定

采用常規(guī)方法測量玉米株高、葉片數(shù)與根長。在玉米生長不同時段開展4次株高和葉片數(shù)測定，選擇每個試驗桶長勢較均勻的20株進行測量，取其平均值作為該處理下玉米的株高和葉片數(shù)。待試驗結(jié)束時，按相同方法測定玉米根長。對玉米的葉綠素、可溶性蛋白含量以及過氧化物酶活性等主要生理生化指標按照文獻方法[11]進行監(jiān)測分析。

1.3.2 土壤細菌群落的分子生物學分析

（1）土壤樣品細菌DNA的制備

按照土壤基因組快速抽提試劑盒（生工SK8233）提取基因組。離心收集菌體，溶于5 mL提取緩沖液（100 mmol·L-1Tris·Cl，100 mmol·L-1EDTA-Na2，200 mmol·L-1NaCl，2%CTAB，pH 8.0）中，37℃振蕩45 min；加入0.75 mL 20%SDS，65℃水浴1 h；12 000 r· min-1、10 min離心，收集上清液。上清液用等體積的酚∶氯仿∶異戊醇（25∶24∶1）抽提2次，加入終濃度0.3 mol·L-1的NaAC（pH5.2）及2倍體積的無水乙醇，室溫沉淀1 h；4℃下12 000 r·min-1離心20 min，收集沉淀，并用70%乙醇漂洗2次，晾干后溶于50 μL TE緩沖液中。DNA的純化采用純化試劑盒GeneClean Turbo Kit（Qbiogene公司），純化后保存于-20℃。

（2）16S rRNA基因序列V3可變區(qū)的PCR擴增選用引物F357-GC（5′-CCTACGGGAGGCAGCAG -3′）和R518（5′-ATT ACC GCG GCT GCT GG-3′）進行PCR擴增。反應(yīng)體系總體積為20 μL：5×FastPfu Buffer 4 μL，dNTPs（2.5 mmol·L-1）1 μL，F(xiàn)357-GC（5 μmol·L-1）0.8 μL，R518（5 μmol·L-1）0.8 μL，F(xiàn)astPfu聚合酶（5 U/μL）0.4 μL，模板DNA 0.5 μL，最后補加ddH2O至20 μL。PCR反應(yīng)條件為：94℃預(yù)變性5 min；94℃變性30 s，56℃退火1 min，72℃延伸30 s，共30個循環(huán)；最后72℃終延伸10 min結(jié)束。通過PCR聚合酶鏈式反應(yīng)得到不同土壤樣品細菌的PCR產(chǎn)物后，取PCR產(chǎn)物各3 μL，用1.5%瓊脂糖凝膠（加5%Goldview染液），于1×TAE緩沖液中，120 V穩(wěn)壓條件下電泳30 min，通過UVI凝膠成像系統(tǒng)進行分析，針對目標條帶進行割膠回收，獲得純化的PCR產(chǎn)物，進行高通量測序和分析。

（3）基于高通量測序的細菌群落分析

操作分類單元（Operationaltaxonomicunits，OTUs）：試驗采用Miseq雙端測序，獲得最終用于分析的16S rRNA序列。在此基礎(chǔ)上，應(yīng)用軟件QIIME（Quantitative insights into microbial ecology）統(tǒng)計各個土壤樣本含有OTUs情況。其中，每個OTU對應(yīng)于一個不同的16S rRNA序列，即每個OTU對應(yīng)于一個不同的細菌種。選取序列相似度在97%條件下的OUT生成Venn圖，研究樣品OTUs之間的相關(guān)性[12]。

樣品間Alpha多樣性分析：通過Mothur軟件，對多樣性指數(shù)Simpson和Shannon指數(shù)、豐富度指數(shù)Chao1和均勻度指數(shù)ACE以及覆蓋度指數(shù)（Good′s coverage）等指標進行Alpha多樣性分析，用以比較各試驗區(qū)樣品的細菌多樣性和豐度變化特征。

樣品間Beta多樣性分析：利用Unifrac metric對樣品進行Beta多樣性分析，主要包括樣本距離計算、樣本聚類、樣本PCA分析，用來衡量樣本間物種組成的相似度。Unifrac metric是通過計算不同環(huán)境樣本間Unique branch長度總和獲得。Unifrac metric值在0～1之間，值越小說明樣本間相似度越高。最后根據(jù)分類學分析結(jié)果，繪制菌群分布條形圖，直觀地觀測樣品在不同分類水平的菌群相對豐度變化，并觀察樣本與樣本之間的菌群結(jié)構(gòu)。

2 結(jié)果與分析

2.1 高濃度CO2入侵對玉米生理系統(tǒng)及代謝功能的影響

2.1.1 玉米株高、葉片數(shù)及根長對CO2脅迫的響應(yīng)

玉米播種幼苗生長10 d后，對照區(qū)Y0、泄漏區(qū)Y1、Y2、Y3玉米長勢較為均一，自7月24日開始通入CO2氣體，在玉米生長不同時期監(jiān)測其主要生長性狀指標。觀察發(fā)現(xiàn)，92×104μL·L-1CO2處理下玉米在通氣15 d后開始出現(xiàn)葉片發(fā)黃、卷曲等現(xiàn)象，第20 d大面積萎縮、倒伏接近死亡。通過對生長時段玉米株高、葉片數(shù)以及植株死亡閾值條件下的根長進行統(tǒng)計，結(jié)果見圖2?？梢钥闯?，隨著CO2泄漏量的增大，玉米平均株高有降低的趨勢；葉片數(shù)在泄漏初期隨濃度變化規(guī)律不是非常明顯，但當施加濃度足夠長時發(fā)現(xiàn)各泄漏情景下玉米的葉片數(shù)均低于對照；當土壤CO2濃度達40×104μL·L-1時根系明顯變短，根系生長受到負面影響，表明高濃度CO2入侵，玉米株高對CO2泄漏濃度反應(yīng)敏感；92×104μL·L-1的泄漏濃度已達到玉米瀕臨死亡的閾值上限，且泄漏通量越大，生長受抑制程度越明顯。原因可能是土壤CO2濃度升高，改變了土壤原有生態(tài)環(huán)境，使得植物生長所需的營養(yǎng)供給不足，導致植株長勢矮小、葉片增長減緩，最終可能會造成糧食作物大幅減產(chǎn)[13]。

2.1.2 玉米主要生理生化指標對CO2脅迫的響應(yīng)

葉綠素在植物光合作用中起著重要的傳遞作用，玉米葉片中葉綠素含量的高低是表征其光合能力的關(guān)鍵指標[14]。在玉米的耐受閾值濃度下監(jiān)測植物的各項生理生化指標見表1。可以看出，高濃度CO2脅迫下，玉米葉片葉綠色含量整體都很低，而葉片中類胡蘿卜素含量略有增加后保持穩(wěn)定。這表明高濃度CO2脅迫對玉米整個生長期葉片葉綠素的合成具有抑制作用。

植物體內(nèi)的可溶性蛋白質(zhì)含量是一個重要的生理生化指標，是植物體內(nèi)氮素存在的主要形式，其含量的多少與植物體代謝和衰老有密切的關(guān)系，不僅反映植株氮素代謝水平，而且常被作為衡量葉片衰老程度的重要指標[15]。表1顯示，對照區(qū)玉米葉片中可溶性蛋白含量最高，Y1、Y2、Y3試驗區(qū)的可溶性蛋白含量較對照情景依次降低了21.25%、33.28%、60.94%。可見，高濃度CO2入侵土壤會導致植物氮代謝功能減弱，植株衰老加快。

圖2 不同濃度CO2對玉米株高、葉片數(shù)以及根長的影響Figure 2 Height，leaf number，and root length of maize under different CO2concentrations

過氧化物酶（POD）被稱為保護植物細胞免受自由基傷害的第三道防線，在清除超氧自由基、H2O2和過氧化物以及阻止或減少羥基自由基形成等方面發(fā)揮重要作用[16]。植物在正常的情況下，體內(nèi)自由基維持在濃度很低的水平[17]，但當植物遭受某種環(huán)境脅迫時體內(nèi)自由基就會增多。一般情況下，POD活性隨植物受逆境脅迫程度的增強而呈現(xiàn)先增大后減小的趨勢[18]。表1數(shù)據(jù)揭示當土壤CO2超過40×104μL·L-1時，POD酶活性開始大幅下降，此時玉米細胞清除過氧化物的能力降低，植物的呼吸代謝功能受到抑制，衰老速度加快。

表1 不同濃度CO2對玉米葉片主要生理生化指標的影響Table 1 Physiological and biochemical indexes of maize leaf under different CO2concentrations

2.2 高通量測序下土壤樣品細菌群落相關(guān)性分析

以各樣品中分布的OTUs數(shù)為計算依據(jù)，構(gòu)建韋恩圖（圖3）。依據(jù)圖3中的數(shù)據(jù)可以看出，4種不同泄漏情景下玉米試驗區(qū)土壤中總OTUs為70 948個，其中有83.60%分布于個別樣本中；13.08%同時分布于兩種或兩種以上泄漏土壤中；僅3.32%為4種泄漏情景下土壤所共有，共有OTUs數(shù)目為2355個，表明不同濃度CO2脅迫對這2355個OTUs所代表的微生物種群影響不大。經(jīng)統(tǒng)計還發(fā)現(xiàn)，隨著CO2泄漏濃度的升高，每種泄漏情景下土壤總OUTs相比于對照主要表現(xiàn)為降低趨勢，依次降了27.11%、62.69%、3.11%；高、中、低濃度即Y3、Y2、Y1土壤樣品與對照樣品Y0中各相關(guān)OTUs分別為6831、3684、5963個，分別占兩兩相關(guān)OTUs的22.93%、12.36%和20.01%。可見，隨著CO2泄漏濃度的增高，Y3（土壤CO2濃度92×104μL·L-1）土壤樣品與對照樣品中微生物群落相關(guān)性更高，Y2（土壤CO2濃度40×104μL·L-1）最低，其原因可能與高濃度CO2脅迫下玉米生長代謝調(diào)節(jié)物的產(chǎn)生在植物體內(nèi)受到抑制的同時，根系分泌物、根系生物量、細根周轉(zhuǎn)、地下碳分配量[19]可能降低等因素有關(guān)；根系分泌物的降低勢必會導致根際土壤細菌C、N源在數(shù)量和結(jié)構(gòu)方面的平衡被打破[20]，從而可能會導致細菌群落分布發(fā)生相應(yīng)改變。

2.3 高濃度CO2入侵對土壤細菌群落豐富度和遺傳多樣性的影響

圖3 各試驗區(qū)土壤樣品共有和特有OUTs分析Figure 3 Analysis of soil samples′shared and unique OTUs in each test area

利用Alpha多樣性分析試驗區(qū)土壤細菌群落的豐富度和多樣性。各土壤樣本的豐富度指數(shù)Chao1、均勻度指數(shù)ACE、覆蓋度指數(shù)（Good′s coverage）和多樣性指數(shù)Simpson/Shannon如表2所示?？梢姡煌孤┣榫跋峦寥赖奈锓N豐富度和均勻度變化規(guī)律是一致的。對照區(qū)Y0土壤樣本中細菌豐富度指數(shù)Chao1數(shù)值和均勻度指數(shù)ACE數(shù)值遠遠比Y1和Y2兩個泄漏區(qū)大，進一步提升CO2濃度使之達作物致死的閾值濃度（Y3區(qū)，CO2濃度92×104μL·L-1）時，細菌豐富度指數(shù)和ACE指數(shù)與對照相比非但沒有降低反而略有增加。這一結(jié)果表明，土壤微生物是土壤中敏感而又活躍的部分，玉米在生長過程中，30×104～40×104μL·L-1通量的CO2處理可能抑制了土壤細菌中某些菌類的發(fā)育，使得土壤細菌豐富度大幅降低，細菌種類減少甚至消亡；同時ACE指數(shù)結(jié)果也表明30×104～ 40×104μL·L-1的CO2泄漏情景下土壤細菌群落中某些細菌種群發(fā)育較好，在群落中的優(yōu)勢度上升。土壤細菌種群優(yōu)勢度的變化可能與土壤細菌群落豐富度的變化有關(guān)，這就意味著30×104～40×104μL·L-1通量的CO2泄漏不僅會影響土壤細菌豐富度，而且還有可能為某些菌類提供良好的生長與繁殖環(huán)境，使得某些菌類成為優(yōu)勢菌種。閾值條件（92×104μL·L-1通量的CO2泄漏）下土壤的物種豐富度和均勻度表現(xiàn)出略微增大的趨勢，其原因可能是土壤的環(huán)境較為復雜，CO2作為脅迫因子，使得部分細菌被活化，抗逆性增強，通過其種群結(jié)構(gòu)、組成和代謝功能的變化對土壤環(huán)境的高CO2濃度做出積極響應(yīng)，并通過生理性調(diào)控和遺傳變異來適應(yīng)不斷變化的環(huán)境[21-22]。

表2 各樣本Alpha多樣性統(tǒng)計表Table 2 Statistics of soil samples′Alpha diversity

Simpson和Shannon指數(shù)表明，玉米生長過程中對照區(qū)土壤細菌群落多樣性最大，其他泄漏區(qū)土壤細菌群落多樣性指數(shù)相比于對照分別降低32.30%、15.74、4.59%（Simpson指數(shù)法）。

2.4 高濃度CO2入侵對土壤樣本物種組成的影響

Heatmap可以用顏色變化來反映菌群的豐度信息，可以直觀地將菌群豐度值用定義的顏色深淺來表示。同時將樣品以及菌群信息進行聚類并重新排布，將聚類之后的結(jié)果顯示在Heatmap中。因此，可以很好地反映各分類水平上菌群組成的異同。為進一步探討不同CO2泄漏情景下土壤樣本與樣本之間的距離關(guān)系，也就是表明樣本與樣本之間的相似程度，對土壤樣本進行Beta多樣性分析，并采用樣本間Unifrac距離矩陣繪制距離熱圖，顏色塊代表Unifrac metric值，顏色越紅表示樣本間距離越近，相似度越高，顏色越藍則距離越遠。圖4a顯示，各泄漏區(qū)樣本與對照區(qū)的相似度存在明顯差異，其中Y3與對照相似度最大，Y1次之，Y2最低。結(jié)合樣品相似性聚類分析結(jié)果（圖4b）可見，試驗區(qū)Y2的分類位置較遠于其他區(qū)，對照Y0介于泄漏區(qū)Y1、Y3與Y2之間，且Y1與Y3聚類位置異常接近。隨著CO2濃度增加，各泄漏區(qū)土壤細菌群落與對照區(qū)細菌群落相似性系數(shù)分別為16.90%、0%、16.90%，表明高濃度CO2對土壤樣本物種組成及土壤細菌群落結(jié)構(gòu)產(chǎn)生一定影響。

對細菌群落組成的變化進行PCA分析（圖5），結(jié)果顯示：主成分1（PC1）和主成分2（PC2）分別在樣品差異性貢獻率上達到66.50%和19.80%，合計達到86.30%，是差異的主要來源。樣品Y1和Y3均位于PC2的負值區(qū)域，分別位于PC1坐標軸正負兩側(cè)，位置較為靠近，說明兩樣品間的主成分變化不顯著；而樣品Y0與樣品Y2均位于PC2坐標軸正值區(qū)域，但分處于PC1的正負值間隔較遠的位置，同時與樣品Y1、Y3分布較遠，進一步說明不同試驗區(qū)土壤的CO2濃度對土壤樣品的影響情況。這表明，不同濃度CO2脅迫下土壤細菌群落在分布上存在較大差異。

圖4 樣本距離熱圖（a）及細菌群落結(jié)構(gòu)相似性聚類分析（b）Figure 4 Heat map of sample distance（a）and cluster analysis of soil bacterial community structure similarity（b）

圖5 不同CO2泄漏情景下土壤細菌群落主成分分析Figure 5 PCA results of soil bacterial communities under different CO2leakage scenarios

2.5 高濃度CO2入侵對土壤樣本細菌相對豐度的影響在門水平上對土壤樣本主要菌群的相對豐度進行分析，結(jié)果如圖6所示?？梢钥闯?，土壤樣本細菌類型較為豐富，主要包含有變形菌門（Proteobacteria）、擬桿菌門（Bacteroidetes）、綠屈撓菌門（Chloroflexies）、酸桿菌門（Acidobacteria）、放線菌門（Actinobacteria）、浮霉菌門（Planctomycetes）、硬壁菌門（Firmicutes）、疣微菌門（Verrucomicrobia）、芽單胞菌門（Gemmatimonadetes）、藍菌門（Cyanobacteria）、硝化螺旋菌門（Nitrospira）、未分類菌群、TM7、奇異球菌-棲熱菌門（Deinococcus-Thermus）等菌群。其中，變形菌門、擬桿菌門、綠屈撓菌門、酸桿菌門、放線菌門為最主要菌群，在土壤細菌中相對豐度較高。不同濃度CO2脅迫下土壤樣品中變形桿菌門、擬桿菌門相對豐度出現(xiàn)先下降后提高的趨勢；綠屈撓菌門、酸桿菌門和放線菌門相對豐度變化規(guī)律相反，呈現(xiàn)出先顯著上升后下降趨勢，尤其是在中濃度土樣（土壤CO2濃度為40×104μL·L-1）中，上述比例分布變化特別明顯；土壤浮霉菌門、硬壁菌門、疣微菌門相對豐度則無明顯變化。

由于CO2是酸性氣體，泄漏的CO2一旦溶解于土壤水中與基質(zhì)中，會使得土壤介質(zhì)環(huán)境發(fā)生改變[23]。自養(yǎng)菌是利用空氣中的CO2或碳酸鹽作為合成細胞中有機物的唯一碳源。因此，CO2濃度升高可能有利于某些自養(yǎng)菌的生長，從而使其微生物相對豐度增加。與此同時，CO2濃度升高會驅(qū)替土壤中的空氣，導致土壤氣相O2分壓降低，對一些好氧微生物生長產(chǎn)生抑制，甚至使其消亡，從而引起微生物豐度降低。如40×104μL·L-1泄漏情景下土壤變形菌門和擬桿菌門細菌相對豐度降至最低，而92×104μL·L-1情景下又有回升，可能是由于α變形菌中好氧細菌減少，部分自養(yǎng)菌增加引起的，具體的原因還有待進一步研究。另外，土壤酸桿菌和放線菌門相對豐度的增加可能與封存CO2持續(xù)泄漏導致土壤酸堿性及其他理化性質(zhì)和營養(yǎng)成分發(fā)生變化有關(guān)[5]。土壤的酸化對嗜酸菌屬的生長繁殖有刺激作用，對某些適宜在中性或偏堿性環(huán)境中生長的細菌屬有抑制作用，細菌一般在土壤pH值為6.5～7.5時表現(xiàn)出高的活性，放線菌最適的土壤pH值為7.5～8.0，嗜堿菌必須在土壤pH值高于8的環(huán)境中生存。擬桿菌門和酸桿菌門細菌相對豐度分別在土壤CO2濃度達40×104μL·L-1時的顯著下降和上升，有望作為地質(zhì)封存CO2泄漏對農(nóng)田土壤生態(tài)系統(tǒng)影響的生物監(jiān)測指標。

圖6 門（phylum）水平上各土壤樣本菌群分布圖Figure 6 Relative abundance of phylum in microbial communities from samples

3 討論

本文主要通過人工模擬封存CO2泄漏桶栽植株試驗，采用耐酸能力強的玉米對不同泄漏情景的閾值響應(yīng)實現(xiàn)對地質(zhì)封存CO2泄漏的影響評估，在此基礎(chǔ)上，通過第二代高通量測序技術(shù)探討CCS泄漏對土壤微生物群落的影響。試驗發(fā)現(xiàn)，地質(zhì)封存CO2泄漏對近地表作物的影響可通過株高、葉片數(shù)、地下部根長等植物生理形態(tài)和光合作用、代謝功能等生化指標因素的改變初步被識別。在CO2泄漏量較小的條件下（CO2濃度為30×104μL·L-1），玉米對環(huán)境脅迫具有較好的適應(yīng)能力，作物長勢較好，各項指標均受到促進；當CO2泄漏量達40×104μL·L-1以上，玉米作物的生長發(fā)育開始受到抑制；92×104μL·L-1CO2為植物生長耐受性的極限值（閾值上限），此泄漏情景下玉米出現(xiàn)光合作用下降、植株早衰、枯萎、死亡等狀況。這一結(jié)論與Pfanz等[24]、劉義玲等[25-26]、郭超等[27]研究發(fā)現(xiàn)的作物根際CO2達到一定濃度后會抑制作物的生長，對作物株高、莖粗、生物量（地上部/地下部）、莖塊產(chǎn)量和果實發(fā)育產(chǎn)生負面影響的研究結(jié)論一致；也與Patil等[28]、Kruger等[29]得出的地下控制釋放CO2試驗引起植物葉綠素含量和生物量下降，植被顏色呈現(xiàn)不健康跡象，作物死亡數(shù)上升等研究成果相一致。導致該變化的原因可能是泄漏的高濃度CO2入侵土壤，使得土壤中CO2濃度不斷上升并很快達到最大值[30]。土壤中大量CO2的存在置換了土壤O2，導致O2分壓不斷降低，形成O2匱乏的土壤環(huán)境，進一步使得土壤原有氧化還原反應(yīng)條件發(fā)生改變，這種土壤環(huán)境的長期作用致使土壤中氧化礦物減少，還原礦物增加，同時還原性氣體通量有增加趨勢[31]。再則，高濃度CO2作為脅迫因子，促使植物體內(nèi)產(chǎn)生特定的抗性物質(zhì)以抵抗外界環(huán)境變化所帶來的影響，而這些抗性物質(zhì)會消耗土壤部分氮，從而導致土壤C、N源結(jié)構(gòu)平衡被打破。而所有條件的變化最終對地表農(nóng)作物的光合作用以及生長代謝等功能造成不利影響，同時也會間接作用于土壤細菌群落的活性和種群數(shù)量，影響到土壤固碳、固氮能力。

關(guān)于土壤微生物群落和物種遺傳多樣性信息的研究結(jié)果顯示，土壤主要菌群的變化不僅與作物生長發(fā)育密切相關(guān)，同時也與土壤環(huán)境中CO2泄漏的強度有關(guān)，特別是土壤酸桿菌門細菌在土壤CO2泄漏濃度達40×104μL·L-1時相對豐度達到最大值得思考。酸桿菌屬于嗜酸菌，在發(fā)生CO2泄漏的土壤中大量出現(xiàn)可能與土壤pH降低密切相關(guān)[5，32]。酸化的土壤為酸桿菌提供了適宜的生存環(huán)境，促使酸桿菌大量繁殖，但是進一步提升濃度達閾值CO2濃度（92×104μL·L-1），酸桿菌相對豐度非但沒有繼續(xù)下降反而有所增加。這一結(jié)果與土壤細菌群落結(jié)構(gòu)和菌群間親緣關(guān)系方面的分析結(jié)果相一致，可能的原因是微生物生物量本身就存在高度的變異性（變異系數(shù)為193%[34]），閾值濃度處理下，土壤CO2可能使得部分細菌的遺傳物質(zhì)發(fā)生改變，通過生理性調(diào)控和遺傳變異來適應(yīng)不斷變化的環(huán)境，即有可能影響到微生物的活性而不改變其豐度，或改變了豐度而沒有影響到種群結(jié)構(gòu)，或增強了群落功能而破壞了它的遺傳，這些都會影響到對實驗結(jié)果的判斷，還有待進一步分析和論證。

同時也有研究指出根瘤菌、氨化細菌、褐色固氮菌和硝化細菌等菌群在酸性土壤中難以存活[34]。可見土壤高CO2濃度引起菌群組成發(fā)生改變的同時，會對土壤功能帶來巨大影響，使得糧食作物明顯減產(chǎn)。雖然現(xiàn)有研究已初步模擬了地質(zhì)封存CO2泄漏的各種情景，并且對CO2泄漏所可能會造成的一系列農(nóng)業(yè)生態(tài)和環(huán)境影響指標進行了試驗分析，結(jié)果亦證實影響非常顯著，但是對其響應(yīng)機理仍有待進一步深入研究。

4 結(jié)論

（1）根際土層下部發(fā)生40×104μL·L-1以上的封存CO2泄漏，會對玉米的生長發(fā)育產(chǎn)生不利影響，可能導致植株矮小，葉片卷曲、枯黃、生長遲緩，光合作用受到極大阻礙，玉米細胞清除過氧化物能力降低，植物的呼吸代謝功能受到抑制，衰老加快，并且隨著泄漏濃度增大，影響程度越嚴重。

（2）高濃度CO2入侵對土壤微生物群落多樣性影響較大，主要表現(xiàn)為原有細菌豐度和多樣性的增加或被削弱。

（3）土壤細菌群落中的優(yōu)勢菌群有變形菌門、擬桿菌門和酸桿菌門等，其中土壤酸桿菌門在土壤CO2濃度達40×104μL·L-1時相對豐度的大幅增加可能用作地質(zhì)封存CO2泄漏對土壤生態(tài)系統(tǒng)響應(yīng)的指示菌。

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Study on soil bacterial community under sealed CO2leakage scenarios by high-throughput sequencing technology

ZHANG Hui-hui1,LI Chun-rong1*,WANG Wen-ke1,DENG Hong-zhang1,ZHANG Hui2,HAN Feng1
（1.Key Laboratory of Subsurface Hydrology and Ecological Effect in Arid Region,Ministry of Education,School of Environmental Science and Engineering,Chang′an University,Xi′an 710054,China;2.Center for Hydrogeology and Environmental Geology Survey,China Geological Survey,Baoding 071051,China）

The CO2geological storage technology carries a risk of the sealed CO2leakage due to the complexity of the storage process,which might affect soil ecosystem.The response of maize to the leakage scenarios of sealed CO2was studied by an artificial CO2release system,and the bacterial community and genetic diversity in soils were analyzed by high-throughput sequencing technology.The results showed that：Maize adapted to 30×104μL·L-1CO2scenarios;but more than 40×104μL·L-1CO2showed a stress on some physiological indexes of maize leaves and so on.There were a total of 70948 OTUs for four soil samples by high-throughput sequencing technology,but only 3.32%of OTUs were common under different CO2leakage scenarios.Changes in soil bacterial diversity and richness were related to CO2leakage levels. Proteobacteria,Bacteroidetes,and Acidobacteria etc.were dominant species in soils.A significant increase in relative abundance of Aci－dobacteria under 40×104μL·L-1CO2concentration suggested that it might be an indicator bacteria for the impact of sealed CO2leakage on soil ecosystem.Overall,CO2leakage would affect crop growth and soil microbial community,and changes in microbial diversity might affect functions of agro-ecosystem.This study is important for the establishment of geological CO2sequestration leakage coping technology.

geological storage of CO2;CO2leakage;maize;physiological characteristics;high-throughput sequencing;soil bacterial community

S154.3

A

1672-2043（2016）12-2440-09

10.11654/jaes.2016-0835

張慧慧，李春榮，王文科，等.高通量測序助力地質(zhì)封存CO2泄漏情景下土壤細菌群落信息的挖掘[J].農(nóng)業(yè)環(huán)境科學學報,2016,35（12）：2440-2448.

ZHANG Hui-hui,LI Chun-rong,WANG Wen-ke,et al.Study on soil bacterial community under sealed CO2leakage scenarios by high-throughput sequencing technology[J].Journal of Agro-Environment Science,2016,35（12）:2440-2448.

2016－06－22

國家自然科學基金項目（41302207）；陜西省自然科學基金項目（2014JM5212）；準噶爾等盆地二氧化碳地質(zhì)儲存綜合地質(zhì)調(diào)查（DD20160307）

張慧慧（1991—），女，陜西榆林人，碩士研究生，從事污染土壤生物修復研究。E-mail：1640923810@qq.com

*通信作者：李春榮E-mail：changanl@163.com