程春梅，黃偉朵，張 偉

(浙江水利水電學(xué)院 測(cè)繪與市政工程學(xué)院，杭州 310018)

水體浮游植物葉綠素a濃度測(cè)定方法比較

程春梅，黃偉朵，張 偉

(浙江水利水電學(xué)院 測(cè)繪與市政工程學(xué)院，杭州 310018)

葉綠素a是反映水體中浮游植物生物量的重要指標(biāo)，其含量的準(zhǔn)確測(cè)定具有十分重要的意義.以實(shí)驗(yàn)室培養(yǎng)的銅綠微囊藻為例，比較了常用的四種提取方法和三種測(cè)量方法對(duì)葉綠素a濃度測(cè)量結(jié)果的影響.實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：使用熱丙酮法提取葉綠素a濃度效率最高；不同測(cè)量方法得到的葉綠素a濃度結(jié)果，分光光度計(jì)三色法>分光光度計(jì)單色法>熒光法.測(cè)量方式不同對(duì)葉綠素a濃度結(jié)果的影響大于提取方式的不同對(duì)濃度結(jié)果的影響，并且不同提取或者測(cè)量方法得到的結(jié)果之間具有極好的線性關(guān)系.

葉綠素a濃度；分光光度計(jì)法；熒光法；微囊藻

葉綠素a(Chlorophyll a,簡稱Chla)是反映水體中浮游植物生物量的常用指標(biāo)之一.從藻類細(xì)胞中提取色素可以在超聲破碎[1]、組織研磨[2]，或超聲破碎和組織研磨同時(shí)進(jìn)行[3]的情況下進(jìn)行.由于研磨方法容易導(dǎo)致色素的丟失，出現(xiàn)了很多改進(jìn)的方法，如凍融法[4]和熱浴法[5]等.很多學(xué)者都進(jìn)行了各種提取方法的比較研究；然而，由于藻類組成的不同，各種萃取劑提取Chla的結(jié)果均不相同[6-7].提取的Chla可以使用分光光度計(jì)法和熒光法進(jìn)行測(cè)量，其中分光光度計(jì)法分為三色法[8]和單色法[9]兩種.一些學(xué)者針對(duì)Chla濃度的提取和測(cè)定方法進(jìn)行了比較研究，例如：陳宇煒等[10]通過對(duì)比丙酮萃取與熱乙醇萃取后認(rèn)為，在單色方法中，熱乙醇與丙酮具有很好的相關(guān)性，熱乙醇法具有操作簡便、快捷,萃取完全,低毒害等優(yōu)點(diǎn)；李振國[11]對(duì)丙酮三色法與乙醇單色法進(jìn)行了比較，結(jié)果表明，乙醇法的萃取效率高于丙酮法，但由于乙醇法實(shí)驗(yàn)條件的難以控制，其結(jié)果的方差較大；陳明華[12]對(duì)比了丙酮法和熱乙醇法測(cè)定Chla的結(jié)果，發(fā)現(xiàn)二者之間有較好的線性關(guān)系，相比丙酮法，熱乙醇法更具優(yōu)勢(shì).

然而，當(dāng)前的研究多側(cè)重于提取方法或測(cè)量方法單獨(dú)比較，而較少將二者結(jié)合起來討論，并且較少討論熒光測(cè)量與分光光度測(cè)量的差異.本文以實(shí)驗(yàn)室培養(yǎng)的微囊藻(Microcystis aeruginosa)為例，使用目前常用的丙酮直接浸提、凍融方法、熱乙醇法和熱丙酮方法進(jìn)行Chla的提取，提取液采用分光光度法和熒光法進(jìn)行測(cè)量，討論不同濃度梯度下各種提取和測(cè)量方法對(duì)濃度結(jié)果的影響.

1 材料與方法

1.1 材料

微囊藻購自中國科學(xué)院水生生物所淡水藻種庫.在實(shí)驗(yàn)室培養(yǎng)微囊藻樣品，樣品選自其對(duì)數(shù)生長期.

化學(xué)試劑：90%丙酮、90%乙醇、10% HCL、1 mol/L HCL；

實(shí)驗(yàn)儀器與材料：UV分光光度計(jì)、Turner Designs 700熒光儀；冰箱、水浴鍋、抽濾裝置、鑷子、10 mL具塞玻璃管、比色皿、滴管、三角瓶、定性濾紙、GF/C濾膜.

1.2 實(shí)驗(yàn)方案

首先用超聲震蕩儀將待測(cè)樣品進(jìn)行勻化，以保證待測(cè)樣品的均一性.本實(shí)驗(yàn)共分為兩個(gè)階段：第一個(gè)階段是高濃度樣品的測(cè)量，第二個(gè)階段是低濃度樣品的測(cè)量.其中高濃度樣品直接選取培養(yǎng)的原始微囊藻濃度為初始濃度，并依次將其稀釋2倍和4倍，得到三個(gè)不同濃度梯度的樣品.低濃度樣品是根據(jù)已知Chla濃度的樣品進(jìn)行稀釋得到，稀釋后使得各梯度的中心濃度值分別為120 μg/L、60 μg/L、30 μg/L和15 μg/L，得到4個(gè)濃度梯度.對(duì)7個(gè)不同濃度梯度的樣品各設(shè)置三個(gè)平行樣，然而對(duì)21個(gè)樣本分別使用四種方法提取，提取的結(jié)果分別用三種不同的方式測(cè)量.

對(duì)于高濃度樣本，隨濃度梯度由高至低，抽濾體積依次為20 ml、25 ml、30 ml；低濃度所有樣品抽濾體積均為20 ml.由于不同的濾膜對(duì)結(jié)果影響不大[13]，所有樣品均用Whatman GF/C濾膜過濾，并用定性濾紙吸干后置于-20 ℃的冰箱中低溫干燥保存.

1.3 葉綠素提取方法

本文使用目前常用的四種方法進(jìn)行Chla含量的提取，其中丙酮直接浸提參照文獻(xiàn)[14]，凍融法參照文獻(xiàn)[15]，熱乙醇法參照文獻(xiàn)[9]，熱丙酮參照文獻(xiàn)[16].

1.4 葉綠素濃度測(cè)量和濃度計(jì)算

分別使用分光光度和熒光光度法對(duì)萃取后的液體進(jìn)行測(cè)量.分光光度測(cè)量采用單色和三色兩種方法，具體步驟為：取上清液進(jìn)行比色測(cè)量并讀取波長750 nm、663 nm、645 nm、630 nm和665 nm處的吸光度；再向液體中加入1滴l mol/L的鹽酸進(jìn)行酸化，搖勻后再次測(cè)定665 nm、750 nm處吸光度.熒光測(cè)量使用TD700熒光儀，測(cè)量時(shí)先直接讀取萃取液的熒光值Fa，然后向液體中添加一滴10%的稀HCL，讀取液體的熒光值Fb.TD700已使用Chla標(biāo)準(zhǔn)樣品定標(biāo)，可以直接讀取出酸化后的Chla濃度值.

Chla濃度的三色法計(jì)算公式參見國家行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)，單色法計(jì)算公式參見湖泊富營養(yǎng)化測(cè)量規(guī)范.數(shù)據(jù)的處理和分析使用Matlab7.0和SPSS16.0進(jìn)行.

2 結(jié)果與討論

2.1 不同提取方法對(duì)濃度結(jié)果的影響

將測(cè)量結(jié)果剔除由于操作誤差產(chǎn)生的異常值，之后計(jì)算各樣本的三個(gè)平行樣測(cè)量結(jié)果的平均值和標(biāo)準(zhǔn)差.同時(shí)，為了衡量測(cè)量結(jié)果的穩(wěn)定性，計(jì)算各平行樣品的變異系數(shù).考慮每種測(cè)量方法條件下，不同的提取方法對(duì)Chla結(jié)果的影響，以及該種影響在不同濃度梯度上的表現(xiàn)，其結(jié)果(見表1).

表1 各平行樣品所測(cè)得濃度結(jié)果的變異系數(shù)

注：濃度1-7分別代表濃度梯度從高至低的7個(gè)等級(jí).

由表1可以看出，除了個(gè)別樣品外，在高濃度和低濃度樣品下，不同平行樣結(jié)果的變異系數(shù)均低于0.1.說明三個(gè)平行樣的結(jié)果具有較好的一致性，測(cè)量操作誤差較小.因此，可取各樣本三個(gè)平行樣的平均值用于分析.

由圖1可以看出，在單色法測(cè)量結(jié)果中，熱丙酮法萃取效果最好，其它三種方法結(jié)果差異不大，并且熱丙酮法測(cè)量結(jié)果顯著偏高的趨勢(shì)在高濃度梯度下表現(xiàn)得更為明顯.其中濃度梯度二中凍融法和直接浸提法結(jié)果優(yōu)于熱丙酮法，該異常是由操作誤差引起.單色法測(cè)量中，高濃度梯度下不同提取結(jié)果相差94 ug/L，低濃度梯度下不同提取結(jié)果相差10.8 ug/L.

圖1 各種測(cè)量方法下不同方法提取結(jié)果差異

在三色法測(cè)量結(jié)果中，高濃度梯度下，凍融法萃取效果最好，而低濃度梯度下，熱丙酮效果更優(yōu).直接浸提、熱乙醇法、熱丙酮法和凍融法提取結(jié)果依次升高，并且該趨勢(shì)在高濃度下表現(xiàn)得更為明顯.三色法測(cè)量中，高濃度梯度下不同提取結(jié)果相差98 ug/L，低濃度梯度下不同提取結(jié)果相差25 ug/L.

在熒光法測(cè)量結(jié)果中，高濃度梯度下，直接浸提、熱乙醇法、熱丙酮法和凍融法提取結(jié)果依次降低；在低濃度梯度下，熱丙酮法結(jié)果最好.在濃度梯度一中熱丙酮法測(cè)量顯著偏低是由于操作誤差導(dǎo)致.熒光法測(cè)量中，高濃度梯度下不同提取結(jié)果相差94 ug/L，低濃度梯度下不同提取結(jié)果相差1 ug/L.

可以看出，熱丙酮法萃取的單色測(cè)量結(jié)果較好；凍融法或熱丙酮法萃取的三色法測(cè)量結(jié)果較好；直接浸提或熱丙酮法萃取的熒光法測(cè)量結(jié)果最好.其中，在各種測(cè)量方法中熱丙酮法提取均可取得較高的效率.

2.2 不同測(cè)量方法對(duì)濃度結(jié)果的影響

分別考慮每種提取條件下，不同測(cè)量方法對(duì)結(jié)果濃度產(chǎn)生的影響，以及該種影響在不同濃度梯度上的表現(xiàn).四種不同的提取方法下各種測(cè)量方法所得的Chla結(jié)果(見圖2).

由圖2可以看出，對(duì)于單色法測(cè)量和三色法測(cè)量的結(jié)果比較，直接浸提法得到的二者結(jié)果相差不大，且三色法結(jié)果略高于單色法；熱乙醇法得到的結(jié)果，三色法結(jié)果高于單色法，并且三色法比單色法結(jié)果高的趨勢(shì)在高濃度梯度下表現(xiàn)得更明顯；熱丙酮法得到的結(jié)果，三色法結(jié)果高于單色法，并且三色法比單色法結(jié)果高的趨勢(shì)在低濃度梯度下表現(xiàn)得更明顯；凍融法結(jié)果中，三色法結(jié)果顯著高于單色法，并且在高濃度和低濃度梯度下該趨勢(shì)均較明顯.

三色法和熒光法的差異，在每種提取方法均表現(xiàn)為三色法遠(yuǎn)大于熒光法，且該差異在高濃度梯度下表現(xiàn)得較為明顯.分光光度計(jì)單色法與熒光法測(cè)量結(jié)果的差異與三色法與熒光法的結(jié)果差異相似，但在低濃度樣品下，單色法與熒光法的結(jié)果具有可比性.因此，不同測(cè)量方法得到的結(jié)果濃度，分光光度計(jì)三色法>分光光度單色法>熒光法.

圖2 四種提取方法下各種測(cè)量方法的Chla濃度梯度結(jié)果差異

2.3 提取和測(cè)量對(duì)結(jié)果濃度的影響分析

由分析可知，使用同一種測(cè)量方法時(shí)，不同的提取方法得到的結(jié)果濃度相差不大，其中在高濃度下相差值為98 ug/L，相對(duì)誤差為6.2%；在低濃度下相差值為25 ug/L，相對(duì)誤差為44.9%.

使用同一種提取方法時(shí)，不同的測(cè)量方法得到的結(jié)果濃度相差較大，其中三色測(cè)量與熒光測(cè)量的結(jié)果相差最為顯著，在高濃度下二者相差值為779 ug/L，相對(duì)誤差為49.5%；在低濃度下相差值為24 ug/L，相對(duì)誤差為66%.產(chǎn)生這種現(xiàn)象的原因是熒光測(cè)量與分光光度計(jì)的三色測(cè)量方法所使用的儀器與計(jì)算方法均不相同.無論樣品濃度梯度高低，采用何種提取方法，不同的測(cè)量方法對(duì)結(jié)果濃度的影響均較大.

由于二類湖泊水體的Chla濃度范圍多在5～150 μg/L內(nèi)，濃度范圍較低，不同的提取方法和不同的測(cè)量方法對(duì)結(jié)果濃度的影響均較為顯著.因此，平時(shí)的實(shí)驗(yàn)工作中，應(yīng)盡量選擇同一種提取和測(cè)量方法，從而使結(jié)果具有可比性.

2.4 不同提取方法與測(cè)量方法結(jié)果間的關(guān)系

首先考慮不同的提取方法測(cè)量得到的濃度間的關(guān)系.將各種提取方法下7個(gè)濃度梯度所測(cè)得的Chla結(jié)果作矩陣散點(diǎn)圖(提取液體的三種不同測(cè)量方式近似作為三個(gè)樣本，因此共有7×3=21個(gè)樣本).然后考慮不同測(cè)量方法所得結(jié)果的關(guān)系，同樣將不同的提取方法作為樣本進(jìn)行分析.得到的矩陣散點(diǎn)圖(見圖3).

由圖3可以看出，四種提取方式所得到的結(jié)果濃度之間具有較高的相關(guān)性.相關(guān)系數(shù)矩陣中顯示，兩兩之間的相關(guān)系數(shù)均在0.96以上，其中直接浸提、熱乙醇法和熱丙酮法三者間相關(guān)系數(shù)均在0.99以上.凍融法測(cè)量結(jié)果中一個(gè)樣點(diǎn)由于操作誤差而導(dǎo)致相關(guān)系數(shù)較低.同時(shí)，由測(cè)量得到的Chla矩陣散點(diǎn)圖看出，低濃度的樣點(diǎn)偏離直線較小，而高濃度樣點(diǎn)偏離直線較大，說明濃度越大，不同提取方法的相關(guān)性越不明顯.

三色法、熒光法與單色法測(cè)量得到的Chla之間的相關(guān)系數(shù)均在0.97以上，三種測(cè)量方法所得的結(jié)果具有可比性.根據(jù)圖3，如果不考慮異常樣點(diǎn)的影響，分光光度計(jì)的單色法和三色法相關(guān)系數(shù)最好，而熒光測(cè)量與分光光度測(cè)量的相關(guān)系數(shù)較低，這是由于不同的測(cè)量儀器對(duì)測(cè)量結(jié)果的影響較大.

圖3 不同提取與測(cè)量結(jié)果的矩陣散點(diǎn)圖

綜上所述，不同提取方法、不同測(cè)量方法所得到的Chla濃度雖然不同，但各種方法的結(jié)果卻具有良好的線性關(guān)系.在實(shí)際工作過程中，同一種提取和測(cè)量方法所得的結(jié)果有利于數(shù)據(jù)的對(duì)比分析，而不同的提取和測(cè)量方法得到的結(jié)果也可以相互換算.

3 結(jié) 論

(1)熱丙酮法萃取Chla并使用單色測(cè)量結(jié)果較好；凍融法或熱丙酮法萃取并用三色法測(cè)量結(jié)果較好；直接浸提或熱丙酮法萃取的熒光法測(cè)量結(jié)果最好.熱丙酮法提取的結(jié)果在各種測(cè)量方法中均可取得較好的效果.不同測(cè)量方法得到的結(jié)果濃度，分光光度計(jì)三色法>分光光度單色法>熒光法.

(2)如果固定測(cè)量方式，不同的提取方法對(duì)結(jié)果濃度影響較小，且在低濃度條件下影響較為顯著.如果固定提取方式，無論樣品濃度的高低，不同的測(cè)量方法對(duì)結(jié)果濃度的影響均較為顯著.

(3)不同的提取方法或測(cè)量方法得到的結(jié)果之間具有一定的相關(guān)性，其結(jié)果值可以相互轉(zhuǎn)換.

[1] NELSON DL. Improved Chlorophyll Extraction Method [J]. Science，1960，132 (132):351-351.

[2] FEDERATION WE. Standard Methods for the Examination of Water and Wastewater[M]. 18th Edition. Washington, DC: American Public Health Association (APHA), 1992.

[3] DOWNES MT, HRSTICH L, VINCENT WF. Extraction of Chlorophyll and Carotenoid Pigments from Antarctic Benthic Mats for Analysis by HPLC [J]. Journal of Applied Phycology, 1993,5(5):623-628.

[4] GOODWIN TW. Chemistry and Biochemistry of Plant Pigments [J]. Chemistry and Biochemistry of Plant Pigments, 1976,1(1):2-37.

[5] HOLM-HANSEN O. Chlorophyll a Determination: Improvements in Methodology [J].Oikos, 1978,30(3):438-447.

[6] 宋曉蘭,段學(xué)花,呂偉民,等.江陰地區(qū)主要內(nèi)河葉綠素a動(dòng)態(tài)特征及其與環(huán)境因子的相關(guān)分析[J].環(huán)境監(jiān)控與預(yù)警,2012,4(3):40-44.

[7] MARKER AFH. The Use of Acetone and Aethanol in the Estimation of Chlorophy ll in the Presence of Phaeophytin [J]. Freshwater Biology, 1972,2(2):361-385.

[8] 王 建,王 驥.浮游植物葉綠素與脫鎂葉綠素的測(cè)定方法[J].武漢植物學(xué)研究，1984,2(2)：321-328.

[9] 陳宇煒，陳開寧，胡耀輝.浮游植物葉綠素a測(cè)定的熱乙醇法及其測(cè)量誤差的探討[J].湖泊科學(xué)，2006,18(5)：550-552.

[10] 陳宇煒，高錫云.浮游植物葉綠素a含量測(cè)定方法的比較[J].湖泊科學(xué)，2000,12(2)：185-188.

[11] 李振國，盧 軍，王國祥，等.分光光度法測(cè)定浮游植物葉綠素a的比較研究[J].中國環(huán)境監(jiān)測(cè)，2006,22(2)：21-23.

[12] 陳明華,謝良國,付志強(qiáng),等.丙酮法和熱乙醇法測(cè)定浮游植物葉綠素a的方法比對(duì)[J].環(huán)境監(jiān)測(cè)管理與技術(shù),2016,28(2):46-48.

[13] 黃昌妙,葉樹才,王 潮.浮游植物葉綠素a測(cè)定方法的比較分析[J].福建分析測(cè)試,2013,22(4):23-27.

[14] 趙 辛.葉綠素a測(cè)定方法改進(jìn)的探討[J].福建分析測(cè)試，2007,16(1)：31-32.

[15] 林少君，賀立靜,黃沛生，等.浮游植物中葉綠素a提取方法的比較與改進(jìn)[J].生態(tài)科學(xué)，2005，24(1)：9-11.

[16] 吳志旭.葉綠素a測(cè)定方法的改進(jìn)及最優(yōu)提取時(shí)間探討[J].甘肅環(huán)境研究與監(jiān)測(cè)，2003,2(2)：150-152.

ComparisonofDifferentMeasurementsonChlorophyllaConcentrationofPhytoplanktoninWater

CHENG Chun-mei, HUANG Wei-duo, ZHANG Wei

(College of Surveying and Municipal Engineering, Zhejiang University of WaterResources and Electric Power, Hangzhou 310018, China)

Chlorophyll a is an important indicator of phytoplankton biomass in water, and accurate determination of its content is of great significance. Taking Microcystis aeruginosa cultivated in the laboratory as the research object, this paper compares four different extraction methods and three different measurements used currently. Experimental results show that chlorophyll a concentration extracted by hot ethanol method is most effective, and chlorophyll a concentration measured by different methods, three-color spectrophotometry>single-color spectrophotometry>fluorescence method. Measurement difference has more effects on the chlorophyll a concentration result than extraction difference, and chlorophyll a concentration extracted or measured by different methods has high linear relationship.

Chlorophyll a concentration; spectrophotometry; fluorescence method; Microcystis aeruginosa

2016-08-23

浙江省教育廳科研基金資助項(xiàng)目(Y201534666)；浙江水利水電學(xué)院大學(xué)生創(chuàng)新訓(xùn)練項(xiàng)目(20150525018)

程春梅(1987-)，女，湖北武漢人，博士，講師，主要研究方向?yàn)樗h(huán)境遙感與地理信息系統(tǒng).

Q948.8

A

1008-536X(2016)12-0059-05