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聚焦超聲對(duì)SD外陰慢性單純性苔蘚模型大鼠外陰皮膚P物質(zhì)及P物質(zhì)受體表達(dá)的影響

2016-12-27 08:13:27唐華均李成志
關(guān)鍵詞:肥大細(xì)胞外陰乳頭狀

楊 歡,唐華均,李成志

(重慶醫(yī)科大學(xué)生物醫(yī)學(xué)工程學(xué)院 省部共建國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室培育基地—重慶市超聲醫(yī)學(xué)工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室重慶市生物醫(yī)學(xué)工程學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 重慶市微無(wú)創(chuàng)醫(yī)學(xué)協(xié)同創(chuàng)新中心,重慶 400016)

基礎(chǔ)與實(shí)驗(yàn)研究

聚焦超聲對(duì)SD外陰慢性單純性苔蘚模型大鼠外陰皮膚P物質(zhì)及P物質(zhì)受體表達(dá)的影響

楊 歡,唐華均,李成志*

(重慶醫(yī)科大學(xué)生物醫(yī)學(xué)工程學(xué)院 省部共建國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室培育基地—重慶市超聲醫(yī)學(xué)工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室重慶市生物醫(yī)學(xué)工程學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 重慶市微無(wú)創(chuàng)醫(yī)學(xué)協(xié)同創(chuàng)新中心,重慶 400016)

目的 探討聚焦超聲對(duì)SD外陰慢性單純性苔蘚模型大鼠外陰皮膚中P物質(zhì)(SP)和P物質(zhì)受體(NK1-R)表達(dá)的影響。方法 參考Sally法建造40只雌性SD大鼠外陰慢性單純性苔蘚模型,并隨機(jī)分為治療組(n=20)和對(duì)照組 (n=20)。治療組予以聚焦超聲治療,對(duì)照組采用與治療組相同的方法治療,但儀器無(wú)功率輸出。聚焦超聲治療2周后,取大鼠外陰皮膚,HE染色觀察組織學(xué)改變,甲苯胺藍(lán)染色觀察肥大細(xì)胞總數(shù)及脫顆粒率,免疫組織化學(xué)方法檢測(cè)SP和NK1-R的表達(dá),比較兩組指標(biāo)差異。結(jié)果 聚焦超聲治療2周后,治療組75.00%(15/20)大鼠外陰皮膚轉(zhuǎn)為正常,對(duì)照組10.00%(2/20)大鼠外陰皮膚轉(zhuǎn)為正常,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=17.289,P<0.05)。治療組肥大細(xì)胞總數(shù)及脫顆粒率及外陰皮膚中SP和NK1-R表達(dá)水平均明顯低于對(duì)照組(P均<0.05)。結(jié)論 聚焦超聲可抑制外陰慢性單純性苔蘚大鼠皮膚中SP的釋放及NK1-R的表達(dá),并降低肥大細(xì)胞總數(shù),減少肥大細(xì)胞脫顆粒,減輕局部炎癥反應(yīng)。

超聲療法;外陰慢性單純性苔蘚;P物質(zhì);受體,神經(jīng)激肽1

外陰慢性單純性苔蘚(lichen simplex chronicus, LSC)是一種常見(jiàn)的婦科疾病,常導(dǎo)致外陰皮膚瘙癢[1]。目前臨床治療方式有一般治療、藥物治療、物理治療及手術(shù)治療。藥物治療常采用皮質(zhì)醇激素,但療程長(zhǎng)、患者依從性差,長(zhǎng)期使用可能導(dǎo)致皮膚萎縮;手術(shù)治療可導(dǎo)致皮膚粘連,一般不采用此法。物理治療有光療法、經(jīng)皮神經(jīng)電刺激療法、聚焦超聲治療等[2-4],而聚焦超聲治療具有療效好、復(fù)發(fā)率低,治療時(shí)間短、一般僅需治療1次等優(yōu)點(diǎn)[5]。

P物質(zhì)(substance P, SP)是由11個(gè)氨基酸殘基組成的神經(jīng)肽,屬于速激肽家族成員,大量研究[6]證實(shí)SP是一種瘙癢介質(zhì),參與多種瘙癢性皮膚病的致病過(guò)程。肥大細(xì)胞廣泛存在于皮膚中,是皮膚速發(fā)型過(guò)敏反應(yīng)、宿主防御性免疫反應(yīng)、炎癥反應(yīng)過(guò)程中的主要效應(yīng)細(xì)胞[7]。1954年Salley[8]首次使用二甲基苯并蒽(7,12-Dimethylbenzanthracene, DMBA)成功誘導(dǎo)地鼠頰囊黏膜白斑,之后該模型成為口腔黏膜白斑的經(jīng)典模型。由于口腔黏膜白斑與LSC 病理學(xué)表現(xiàn)相似,故本研究參考口腔黏膜白斑模型的造模方法,建立雌性SD大鼠LSC模型,并采用聚焦超聲進(jìn)行治療,旨在觀察聚焦超聲對(duì)LSC模型大鼠的治療效果及治療前后大鼠外陰皮膚組織中肥大細(xì)胞、SP和P物質(zhì)受體[神經(jīng)激肽1受體(neurokinin-1 receptor, NK1-R)]的變化。

1 材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 雌性SD大鼠40只,體質(zhì)量140~160 g,6~8周齡,由重慶醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。

1.2試劑與儀器 二甲基苯并蒽(Sigma公司),丙酮溶液(上?;瘜W(xué)試劑公司),甲苯胺藍(lán)(上海阿拉丁),SP單抗( Novus公司),P物質(zhì)受體抗體(北京博奧森),PV900、PV9002、DAB(北京中杉金橋)。海極星?CZF 型超聲波婦科治療儀由重慶海扶醫(yī)療科技股份有限公司研制。

1.3實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1動(dòng)物模型的建立及分組 備皮消毒大鼠外陰皮膚后,用硬毛牙刷刷皮膚至充血。用勾線筆蘸0.5%DMBA丙酮溶液涂布于外陰皮膚;每周1、3、5 涂藥,連續(xù)10周后外陰活檢;確定均成功建模后40只大鼠按隨機(jī)數(shù)字表分為治療組(n=20)和對(duì)照組(n=20)。

1.3.2聚焦超聲治療 治療組:1.0%戊巴比妥鈉腹腔麻醉大鼠后,備皮消毒,治療區(qū)域涂超聲耦合劑。CZF治療參數(shù):頻率10 MHz;焦距2~4 mm;功率2 W;根據(jù)皮損的范圍、程度和局部對(duì)超聲輻照的反應(yīng)確定輻照時(shí)間,一般為60~120 s。治療頭緊貼皮膚,輻照方式為連續(xù)直線輻照,速度5~10 mm/s。對(duì)照組:治療過(guò)程與治療組相同,但儀器無(wú)功率輸出。

1.3.3觀察指標(biāo) 觀察DMBA涂布后的皮膚變化(充血、粗糙、增厚、腫瘤)及聚焦超聲治療后皮膚變化(潰瘍、瘢痕、皮下硬結(jié));觀察及觸診大鼠全身是否有腫塊、淋巴結(jié)是否腫大。治療2、4周后取外陰皮膚組織,以4%多聚甲醛固定、脫水、石蠟包埋、切片、HE染色和甲苯胺藍(lán)染色并于顯微鏡下觀察。甲苯胺藍(lán)染色后每個(gè)標(biāo)本觀察3張切片,每張切片于高倍鏡(×400)下觀察10個(gè)視野,取平均值,統(tǒng)計(jì)脫顆粒的肥大細(xì)胞,計(jì)算肥大細(xì)胞脫顆粒率。

1.3.4免疫組織化學(xué)檢測(cè) 取兩組治療2周后的切片,采用超敏二步法作免疫組織化學(xué)染色(按照試劑盒說(shuō)明書步驟進(jìn)行)。SP抗體工作濃度為1∶100,NK1-R抗體工作濃度為1∶50。PBS代替一抗為陰性對(duì)照。SP以細(xì)胞膜和(或)胞漿出現(xiàn)棕黃色顆粒為陽(yáng)性;NK1-R以細(xì)胞膜出現(xiàn)棕黃色顆粒為陽(yáng)性。采用IPP 6.0軟件對(duì)切片的染色信號(hào)進(jìn)行光密度分析,平均光密度值代表蛋白表達(dá)的強(qiáng)度。每張切片在高倍鏡(×400)下隨機(jī)選取5個(gè)視野,計(jì)算其平均光密度值。

1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS 22.0統(tǒng)計(jì)分析軟件。兩組治療后有效率的比較采用χ2檢驗(yàn)。計(jì)量資料以±s表示,采用Shapiro-Wilk法對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行正態(tài)性檢驗(yàn),符合正態(tài)性、方差齊性者采用t檢驗(yàn),不符合者采用秩和檢驗(yàn)。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1肉眼及病理觀察 DMBA干預(yù)10周后,大鼠外陰皮膚顏色稍紅、皮膚增厚、粗糙,彈性降低(圖1A),全身無(wú)腫塊形成、淋巴結(jié)無(wú)腫大。治療組:聚焦超聲治療后即刻外陰皮膚充血水腫明顯、稍硬,無(wú)明顯的皮下硬結(jié),皮溫升高;治療2周后皮膚充血水腫消退,所有大鼠外陰皮膚完整,無(wú)潰瘍形成(圖1B);治療4周后除2只大鼠外陰形成乳頭狀瘤外,其余大鼠外陰皮膚恢復(fù)正常。對(duì)照組:聚焦超聲治療后即刻外陰皮膚無(wú)明顯改變,治療2周后4只大鼠外陰形成乳頭狀瘤,治療4周后11只形成乳頭狀瘤(圖1C)。

表1 兩組外陰LSC大鼠的病理學(xué)檢查結(jié)果(只,n=20)

組別治療前正常LSC乳頭狀瘤治療2周后正常LSC乳頭狀瘤治療4周后正常LSC乳頭狀瘤治療組020015501802對(duì)照組020021444511

圖1 SD大鼠外陰皮膚形態(tài)學(xué) A.造模成功的大鼠外陰皮膚、增厚、粗糙; B.治療組治療2周后大鼠外陰皮膚呈正常皮色,富有彈性; C.對(duì)照組治療4周后,大鼠外陰形成乳頭狀瘤(箭),表面可見(jiàn)出血壞死

圖2 兩組外陰組織中肥大細(xì)胞總數(shù)和脫顆粒率比較的柱形圖 A.兩組肥大細(xì)胞總數(shù)比較; B.兩組肥大細(xì)胞脫顆粒率比較 ( *:與對(duì)照組比較, P<0.05)

病理學(xué)檢查結(jié)果見(jiàn)表1。治療2周后,治療組75.00%(15/20)大鼠外陰皮膚轉(zhuǎn)為正常,對(duì)照組10.00%(2/20)轉(zhuǎn)為正常,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=17.289,P<0.05);治療4周后,治療組90.00%(18/20)大鼠外陰皮膚轉(zhuǎn)為正常,對(duì)照組20.00%(4/20)轉(zhuǎn)為正常,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=19.798,P<0.05)。

2.2肥大細(xì)胞總數(shù)及脫顆粒率 紫紅色肥大細(xì)胞主要位于真皮上層。對(duì)照組肥大細(xì)胞數(shù)量增多,邊緣模糊不清,脫顆粒明顯,治療組經(jīng)聚焦超聲治療后肥大細(xì)胞數(shù)量減少,脫顆?,F(xiàn)象不明顯(圖2、3)。

2.3SP和NK1-R的表達(dá) 對(duì)照組外陰皮膚中SP和NK1-R表達(dá)較多,呈棕黃色顆粒,著色較深,陽(yáng)性表達(dá)主要位于表皮層;治療組僅有少量表達(dá),且著色較淺(圖4)。與對(duì)照組相比,治療組SP表達(dá)量明顯降低(0.061 1±0.021 5 vs 0.025 9±0.011 0,t=6.526,P<0.05)、NK1-R的表達(dá)量也明顯降低(0.060 7±0.012 5 vs 0.021 8±0.008 9,t=11.357,P<0.05)。

3 討論

LSC是導(dǎo)致外陰瘙癢的原發(fā)病因之一,可繼發(fā)于任何外陰瘙癢性疾病[9]。研究[10]顯示,該病的常見(jiàn)誘因是出汗(41.9%)、遠(yuǎn)距離行走時(shí)大腿間的摩擦(9.5%)及心理壓力(5.7%)。這些誘因或某些明確的瘙癢性疾病(外陰陰道假絲酵母菌病、硬化性苔癬等)的作用下可形成LSC,皮膚的屏障功能被破壞并刺激皮膚的周圍神經(jīng)末梢,進(jìn)而發(fā)展為瘙癢-搔抓循環(huán)[11-12],進(jìn)一步導(dǎo)致皮膚增厚及苔癬樣變,使瘙癢癥狀更嚴(yán)重,最終發(fā)展為頑固性瘙癢-搔抓循環(huán)。且瘙癢常在夜間加重,影響患者睡眠[9]。

聚焦超聲是將體外低能量的超聲波在穿過(guò)組織時(shí)進(jìn)行聚焦,將焦點(diǎn)放置于靶區(qū),利用超聲波的熱效應(yīng)、機(jī)械效應(yīng)和空化效應(yīng)等使生物組織發(fā)生一系列變化來(lái)達(dá)到治療目的。目前在我國(guó),聚焦超聲已廣泛用于治療外陰上皮內(nèi)非瘤樣病變,并具有較好的有效性及安全性。近期的一項(xiàng)研究[4]發(fā)現(xiàn)聚焦超聲治療LSC的有效率和治愈率分別為54.0%和44.1%,而復(fù)發(fā)率僅為8.4%。本研究參照口腔黏膜白斑的造模方法,成功建造了在形態(tài)學(xué)和病理學(xué)上與人外陰LSC相似的動(dòng)物模型,且停止干預(yù)后4周,對(duì)照組55.00%(11/20)大鼠繼續(xù)進(jìn)展為乳頭狀瘤,25.00%(5/20)仍表現(xiàn)為L(zhǎng)SC,僅20.00%(4/20)恢復(fù)正常。本研究觀察時(shí)間內(nèi),無(wú)惡變表現(xiàn)的模型鼠,可能與DMBA濃度、作用時(shí)間和大鼠抵抗力有關(guān)。經(jīng)聚焦超聲治療4周后的治療組大鼠中,僅10.00%(2/20)繼續(xù)進(jìn)展為乳頭狀瘤,90.00%(18/20)外陰皮膚恢復(fù)正常,未出現(xiàn)潰瘍和明顯的瘢痕,提示聚焦超聲可安全有效地阻斷病變進(jìn)展。

圖3 外陰皮膚中肥大細(xì)胞的病理圖(TB,×200) A.治療組; B.對(duì)照組 (箭示肥大細(xì)胞) 圖4 SP和NK1-R在外陰皮膚中的表達(dá)情況 A.對(duì)照組外陰皮膚中SP染色較深(箭),主要位于表皮層(二步法,×400); B.治療組外陰皮膚中SP染色淺(箭),且陽(yáng)性細(xì)胞明顯減少(二步法,×400); C.對(duì)照組外陰皮膚中NK1-R染色較深(箭),主要位于表皮層(二步法,×400); D.治療組外陰皮膚中NK1-R染色淺(箭),且陽(yáng)性細(xì)胞明顯減少(二步法,×400)

研究[13]發(fā)現(xiàn),LSC的主要病理改變是真皮層微血管病變引起的表皮退行性變。真皮內(nèi)微血管閉塞或減少可能導(dǎo)致組織細(xì)胞缺氧,影響酪氨酸酶功能,減少黑色素合成,最終導(dǎo)致色素缺失和皮膚變白;同時(shí)還可能導(dǎo)致繼發(fā)炎癥并釋放炎癥介質(zhì),刺激神經(jīng)末端引起外陰瘙癢。聚焦超聲可有效治療頑固性外陰瘙癢,研究[14]報(bào)道,經(jīng)聚焦超聲治療12個(gè)月后,僅11.2%的患者仍存在明顯的外陰瘙癢癥狀。但關(guān)于聚焦超聲逆轉(zhuǎn)疾病瘙癢癥狀的分子機(jī)制鮮見(jiàn)研究。

P物質(zhì)是一種重要的瘙癢介質(zhì),其在特應(yīng)性皮炎、銀屑病等瘙癢性皮膚病中表達(dá)增加[15]。SP可與表皮層的NK1-R結(jié)合,通過(guò)激活傳導(dǎo)癢覺(jué)的無(wú)髓C纖維上NK1受體直接引起瘙癢;還可促進(jìn)白三烯B4釋放或一氧化氮合成而引起或增強(qiáng)瘙癢[15]。目前研究[16]發(fā)現(xiàn),NK-1R拮抗劑治療特應(yīng)性皮炎、結(jié)節(jié)性癢疹等瘙癢性皮膚病有效。皮內(nèi)注射SP可誘導(dǎo)肥大細(xì)胞釋放組胺,但組胺受體拮抗劑不能完全抑制SP誘發(fā)的皮膚瘙癢,且組胺受體抑制劑對(duì)瘙癢性疾病的療效有限,提示肥大細(xì)胞釋放的組胺可能在SP誘發(fā)的瘙癢中不起主要作用。但SP可誘導(dǎo)肥大細(xì)胞脫顆粒釋放其他的炎癥介質(zhì),如白三烯B4、前列腺素D2和TNF-α,這些炎性介質(zhì)可進(jìn)一步誘導(dǎo)感覺(jué)神經(jīng)末梢釋放SP,進(jìn)一步激活更多的肥大細(xì)胞[17]。同時(shí),肥大細(xì)胞脫顆粒釋放的類胰蛋白酶,是瘙癢介質(zhì)蛋白酶活化受體最有效的激活劑[18]。已有研究[19]發(fā)現(xiàn),人LSC中脫顆粒肥大細(xì)胞增加,肥大細(xì)胞脫顆粒釋放大量的細(xì)胞因子和趨化因子等,與疾病的發(fā)病機(jī)制有關(guān)。本研究中,建模成功的大鼠SP和NK1-R表達(dá)明顯增加,且主要表達(dá)于表皮層,真皮層少量表達(dá)。對(duì)照組模型鼠肥大細(xì)胞增多,特別是脫顆粒的肥大細(xì)胞,而治療組經(jīng)聚焦超聲治療后組織中肥大細(xì)胞總數(shù)減少,且脫顆粒的肥大細(xì)胞也明顯減少,同時(shí),治療組SP和NK1-R的表達(dá)均減少,考慮聚焦超聲治療通過(guò)改善局部微循環(huán),改善微血管和神經(jīng)末梢的營(yíng)養(yǎng)狀態(tài)和功能,促使神經(jīng)末梢分泌的SP恢復(fù)正常,減輕局部的炎癥介質(zhì)的釋放,從而減輕局部炎癥反應(yīng)[20]。

總之,聚焦超聲治療可有效改善外陰LSC患者的瘙癢癥狀;動(dòng)物模型研究也證實(shí)聚焦超聲治療后肥大細(xì)胞、SP及NK1-R的表達(dá)改變可能與聚焦超聲治療有關(guān)。

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Effects of focused ultrasound on expression of substance P and neurokinkin 1 receptor in genital skin of SD rats with vulvar lichen simplex chronicus

YANGHuan,TANGHuajun,LIChengzhi*

(StateKeyLaboratoryofUltrasoundEngineeringinMedicineCo-FoundedbyChongqingandtheMinistryofScienceandTechnology,CollegeofBiomedicalEngineering,ChongqingKeyLaboratoryofBiomedicalEngineering,ChongqingCollaborativeInnovationCenterforMinimally-invasiveandNoninvasiveMedicine,ChongqingMedicalUniversity,Chongqing400016,China)

Objective To explore the effects of focused ultrasound on the expression of Substance P (SP) and Neurokinin-1 receptor (NK1-R) in the genital skin of SD rats with vulvar lichen simplex chronicus (LSC). Methods Fourty female rat models of LSC were established by Sally method, and then the rats were randomly divided into treatment group (n=20) and control group (n=20). The rats in treatment group were treated by focused ultrasound, and those in control group received sham treatment. After focused ultrasound intervention, the histological changes of vulva were observed by using HE staining. The total number and the degranulated number of mast cells were identified by staining slides with toluidine blue. Immunohistochemistry was used to test the expression of SP and NK1-R. Differences between the groups were compared. Results After 2 weeks of focused ultrasound treatment, the rate of normal in treatment group was 75.00% (15/20) and that in control group was 10.00% (2/20), there was statistically significant between two groups (χ2=17.289,P<0.05). The total number and the degranulated number of mast cells, the expression of SP and NK1-R in treatment group were significantly lower than those in control group (allP<0.05). Conclusion Focused ultrasound can treat LSC through inhibiting SP and NK1-R expression, decreasing the total number and the degranulated number of mast cells and reducing the inflammatory reaction of tissues.

Ultrasonic therapy; Vulvar lichen simplex chronicus; Substance P; Receptors, neurokinin-1

國(guó)家重點(diǎn)基礎(chǔ)研究發(fā)展計(jì)劃(973計(jì)劃)項(xiàng)目(2011CB707900)。

楊歡(1989—),女,四川南充人,在讀碩士。研究方向:外陰上皮內(nèi)非瘤樣病變。E-mail: yanghuan1822@foxmail.com

李成志,重慶醫(yī)科大學(xué)生物醫(yī)學(xué)工程學(xué)院 省部共建國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室培育基地—重慶市超聲醫(yī)學(xué)工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 重慶市生物醫(yī)學(xué)工程學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 重慶市微無(wú)創(chuàng)醫(yī)學(xué)協(xié)同創(chuàng)新中心,400016。E-mail: lichengzhi@cqmu.edu.cn

2016-08-16

2016-10-17

R711.72; R454.3

A

1672-8475(2016)12-0757-05

10.13929/j.1672-8475.2016.12.011

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