桂 茜， 蔣 昊， 阮 穎 (湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)，湖南長沙 410128)

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7種蕓香科植物的RAPD分析

桂 茜， 蔣 昊， 阮 穎*(湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)，湖南長沙 410128)

[目的]構(gòu)建蕓香科植物7個種12個材料的聚類分析樹狀圖，為蕓香科植物系統(tǒng)學(xué)的研究提供分子水平上的證據(jù)。[方法]以蕓香科植物7個種12個材料為研究對象，利用RAPD技術(shù)對其親緣關(guān)系進行分析。[結(jié)果]在建立適合蕓香科植物PCR-RAPD反應(yīng)體系的基礎(chǔ)上，從21條隨機引物(10 mer)中篩選出10個，對所有供試材料進行擴增，共獲得10張DNA指紋圖譜，85條DNA譜帶，其中84條為多態(tài)帶，多態(tài)性譜帶比例為98.82%。[結(jié)論]建立了基于RAPD的蕓香科植物親緣關(guān)系樹狀圖，該結(jié)果與經(jīng)典的蕓香科植物的起源、分類基本一致。

蕓香科；RAPD；親緣關(guān)系分析

蕓香科是雙子葉植物中一個較大的科，全世界共有7個亞科，約150屬1 700種，分布于全球熱帶和亞熱帶地區(qū)，少數(shù)分布在溫帶。其中，我國野生及引種栽培的共有4個亞科29屬151種28變種，分布于全國各地，主產(chǎn)于西南和南部[1-2]。由于蕓香科植物的異花授粉特性，以及長期的引種選擇，其變異較大，中間類型多，種的界限不清楚[3-4]。加之以往對蕓香科植物親緣關(guān)系的確定主要根據(jù)形態(tài)標(biāo)記、生殖特性及染色體核型，結(jié)果不盡一致，這給蕓香科植物種質(zhì)資源的篩選、鑒定和利用帶來了困難[5-7]。筆者以蕓香科植物7個種12個材料為研究對象，采用RAPD (Random Amplified Polymorphic DNA)技術(shù)對其親緣關(guān)系進行分析，旨在構(gòu)建12個材料的聚類分析樹狀圖，為蕓香科植物系統(tǒng)學(xué)研究提供分子水平上的證據(jù)，同時也為蕓香科植物種質(zhì)資源保護和品種鑒定提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料供試材料為蕓香科植物中的7個種12個材料，分別為蜜柚(Honeypomelo)(A)、甜柚[Citrusmaxima(Burm) Merr.](B)、土柚[Citrusmaxima(Burm) Merr.](C)、年橘(Citrusreticulatacv. NianJu)(D)、紐荷爾臍橙(Newhall navel orange)(E)、矮果香櫞(Citrusmedica)(F)、黔陽無核椪柑(CitrusreticulataBlanco cv.Ponkan)(G)、檸檬(Citruslimon(L.) Burm.f.)(H)、大分四號柑橘(CitrusreticulataBlanco)(I)、琯溪蜜柚(Citrusmaxima(Burm.) Merr.cv.Guanxiyou)(J)、枳(Poncirustrifoliata(L.) Raf)(K)、江永香柚(Citrusmaxima(Burm.) Merr.cv.Jiangyong Yu)(L)。其中，A～D取自湖南永州，E～L取自湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)柑橘中心。隨機引物購自上海生工生物工程有限公司，Mix購自近岸蛋白質(zhì)科技有限公司。

1.2 試驗方法基因組DNA的提取和質(zhì)量檢測參照文獻[8-9]的方法，并根據(jù)蕓香科植物的特征進行修改。用氯仿∶異戊醇(24∶1)抽提2次，以提高DNA的濃度。DNA的質(zhì)量和濃度檢測在Themo核酸蛋白質(zhì)分析儀上進行。根據(jù)所測得的DNA濃度，統(tǒng)一配制成100 ng/μL的模板貯液。取樣品DNA在2.0%的瓊脂糖凝膠上(溴化乙錠濃度為0.5 μg/mL)電泳，用Gel DOC-IT凝膠分析系統(tǒng)觀察并照相，以100 bp plus Ⅱ為Marker，推算DNA分子的大小。

以E、K 基因組DNA為模板，利用RAPD隨機引物進行PCR擴增。從21條隨機引物(10 mer)中篩選出3次PCR重復(fù)能出現(xiàn)穩(wěn)定條帶的引物。利用篩選出的引物對12份蕓香科植物基因組DNA進行PCR擴增。瓊脂糖凝膠電泳，觀察并照相。

PCR反應(yīng)程序：94 ℃預(yù)變性4 min；94 ℃變性40 s，35 ℃ 退火40 s，72 ℃延伸100 s，39個循環(huán)；72 ℃延伸7 min，16 ℃保存。

根據(jù)凝膠電泳圖顯示的結(jié)果，在同一位置上有擴增條帶的記為“1”，無擴增條帶的記為“0”，所有樣品未共有的條帶記為多態(tài)性位點。將所有引物的擴增結(jié)果進行記錄，編輯成“0”和“1”數(shù)據(jù)陣。利用UPGMA軟件分析，采用聚類分析的方法構(gòu)建聚類圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 引物篩選結(jié)果從21條隨機引物(10 mer)1～21中篩選到3次PCR重復(fù)能出現(xiàn)穩(wěn)定條帶的為引物，有多態(tài)性擴增條帶的引物為2、4、5、7、10、12、16、19、20、21，共10條(圖1)。

2.2 基因組DNA的擴增結(jié)果對12個樣品擴增產(chǎn)物電泳結(jié)果進行統(tǒng)計分析，結(jié)果見表1。由表1可知，10條隨機引物共擴增出85條DNA譜帶，其中，多態(tài)性DNA 片段(多態(tài)帶)有84條，占擴增總帶數(shù)的98.82%。每個引物擴增的帶數(shù)在4～12條，平均為9條；其中擴增帶數(shù)最多的為引物10，具12條擴增帶；最少的為引物7，僅具4條帶。擴增出的DNA 片段大小在150～2 000 bp。在擴增出的85條譜帶中， 有1條為全部供試材料所共有(共有帶)，這表明各材料間的同源性。不同引物擴增出的帶數(shù)不同；同一引物，不同供試材料間的擴增帶數(shù)也不同；這表明蕓香科植物遺傳背景的復(fù)雜性和DNA 的多態(tài)性。引物5 和10 的擴增結(jié)果見圖2。

圖1 以E、K基因組DNA為模板對引物1～21的篩選結(jié)果

表1 10條隨機引物對12個供試材料的擴增結(jié)果

圖2 引物5和10對12份蕓香科材料的擴增結(jié)果

圖3 蕓香科植物聚類分析

2.3 聚類分析基于RAPD的擴增結(jié)果，用UPGAM法進行聚類分析，結(jié)果見圖3[10]。由圖3可知，當(dāng)遺傳距離在0.301 5～0.441 0時，12個樣品可分成3類：第1類為蜜柚(A)、甜柚(B)、黔陽無核椪柑(G)和檸檬(H)；第2類為紐荷爾臍橙(E)、大分四號柑橘(I)、琯溪蜜柚(J)、江永香柚(L)、年橘(D)、矮果香櫞(F)和枳(K)；第3類為土柚(C)。從這3個類群看，不同種的蕓香科植物親緣關(guān)系錯綜復(fù)雜，但總體來看，與傳統(tǒng)的蕓香科植物起源完全吻合。在傳統(tǒng)的蕓香科植物起源中，葡萄柚、椪柑和檸檬由橙分別與柚、桔、青檸雜交而來，聚為第1類；橙由橘和柚雜交而來，聚為第2類。當(dāng)遺傳距離在0.133 7～0.159 0時，蕓香科植物可分為9類，第1類為蜜柚(A)，第2類為甜柚(B)，第3類為黔陽無核椪柑(G)，第4類為檸檬(H)，第5類為紐荷爾臍橙(E)、大分四號柑橘(I)，第6類為琯溪蜜柚(J)、江永香柚(L)，第7類為年橘(D)，第8類為矮果香櫞(F)和枳(K)，第9類為土柚(C)。紐荷爾臍橙、大分四號柑橘與琯溪蜜柚、江永香柚在遺傳距離較小時不能區(qū)分，說明其親緣關(guān)系較近，而與其他蕓香科植物親緣關(guān)系較遠。其中，第8類矮果香緣與我國特有的枳親緣關(guān)系更近，遺傳距離在0.061 5時，才能將其區(qū)分開。

3 討論

從基于RAPD標(biāo)記建立的樹狀圖看，所有供試材料的遺傳距離都大于0，又都能夠聚類在一起，表明蕓香科植物一方面具有相同遺傳背景，另一方面相互之間又存在一定差異。當(dāng)遺傳距離在0.133 7～0.159 0時，供試蕓香科植物可明顯地分為Ⅰ(A)、Ⅱ(B)、Ⅲ(G)、Ⅳ(H)、Ⅴ(E、I)、Ⅵ(J、L)、Ⅶ(D)、Ⅷ(F、K)、Ⅸ(C)。其中，V為橙類，Ⅵ為柚類。從聚類樹狀圖可以看出，我國特有的枳與矮果香櫞遺傳距離非常小，甚至比2種柚(J.琯溪蜜柚、L.江永香柚)之間的遺傳距離還小，表明枳與矮果香櫞的親緣關(guān)系非常近。

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RAPD Analysis of Seven Species of Rutaceae Plants

GUI Xi, JIANG Hao, RUAN Ying*(Hunan Agricultural University, Changsha, Hunan 410128)

[Objective] To establish cluster analysis dendrogram of 12 Rutaceae materials in seven species, and to provide evidence for the phylogenetic research on Rutaceae plants at molecular level.[Method] With 12 Rutaceae materials in seven species as the research objects, RAPD technology was used for genetic relationship analysis.[Result]Based on establishing PCR-RAPD reaction system of Rutaceae plants, ten primers were screened from 21 random primers.All the tested materials were used for amplification.A total of ten DNA fingerprint and 85 DNA bands were obtained.Among them, 84 bands were polymorphic, with the polymorphic band ratio being 98.82%.[Conclusion] Genetic relationship dendrogram of Rutaceae plants based on RAPD was established.Cluster results of dendrogram had basically the same origin and classification with classic Rutaceae plants.

Rutaceae; RAPD; Genetic relationship analysis

湖南省教育廳科學(xué)研究項目“多梳蛋白抑制植物體細(xì)胞胚特性發(fā)生的分子機制”(13B057)。

桂茜(1991- )，女，湖南沅江人，碩士研究生，研究方向：植物防御與植物抗性。*通訊作者，教授，博士，博士生導(dǎo)師，從事發(fā)育生物學(xué)研究。

2016-09-05

S 188

A

0517-6611(2016)30-0101-03