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(南華大學(xué)病原生物學(xué)研究所，特殊病原體防控湖南省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖南 衡陽(yáng) 421001)

·技術(shù)與方法·

一種新納米乳作為流感疫苗佐劑的效果

趙蘭華，劉瑋，唐雙陽(yáng)，李冉輝，曾焱華*

(南華大學(xué)病原生物學(xué)研究所，特殊病原體防控湖南省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖南 衡陽(yáng) 421001)

目的篩選有佐劑效果的納米乳新配方，并從穩(wěn)定性、粒徑大小、載水范圍、佐劑效果與安全性等方面評(píng)價(jià)其作為疫苗佐劑的可行性。方法依據(jù)偽三元相圖篩選出能被水大量稀釋的配方，測(cè)定基本性質(zhì)如pH，黏度，粒徑，長(zhǎng)期保存或離心條件下是否保持穩(wěn)定等。將其做為佐劑與流感疫苗混合進(jìn)行動(dòng)物實(shí)驗(yàn)。25只ICR小鼠隨機(jī)分為生理鹽水組、單獨(dú)疫苗組、鋁佐劑對(duì)照組、弗氏佐劑組和納米乳佐劑組，每組5只,經(jīng)大腿腓腸肌注射流感H3N2裂解疫苗。第三周加強(qiáng)免疫一次，初次免疫后一周內(nèi)觀察各組小鼠的體重變化，每周收集血清以檢測(cè)血凝抑制抗體的效價(jià)，用SPSS18.5軟件分析比較各組小鼠產(chǎn)生的抗體水平。最大給藥量實(shí)驗(yàn)評(píng)價(jià)其安全性。結(jié)果該納米乳理化性質(zhì)穩(wěn)定，pH值為7.5，黏度與水接近，平均粒徑為56.3 nm，離心及長(zhǎng)期保存不破乳。納米乳佐劑組小鼠能產(chǎn)生更高水平的血凝抑制抗體，在0.25 mg/10 g給藥量下無(wú)小鼠死亡。結(jié)論該納米乳配方作為流感疫苗佐劑具有良好的穩(wěn)定性、安全性及佐劑效果。

納米乳； 佐劑； 流感疫苗

傳統(tǒng)流感疫苗生產(chǎn)工藝繁雜，生產(chǎn)成本高，在儲(chǔ)備不足或致病亞型突變的情況下，很難應(yīng)對(duì)流感大流行爆發(fā)[1]，加入佐劑能增強(qiáng)抗原的免疫原性，既節(jié)約疫苗用量，又能有效應(yīng)對(duì)流感爆發(fā)，因此，研究新型的疫苗佐劑意義重大。納米乳是一類(lèi)由表面活性劑、助表面活性劑、油相、水相按一定比例混合形成的透明、澄清、穩(wěn)定的運(yùn)載系統(tǒng)。納米乳作為載藥系統(tǒng)已有大量研究[2]，作為疫苗佐劑則研究較少?，F(xiàn)已有MF59、AS03、AF03等乳佐劑被批準(zhǔn)用于人體，限于安全等因素考慮，目前仍只是作為某些特定疫苗的儲(chǔ)備佐劑，沒(méi)有得到普遍認(rèn)可和使用。大量關(guān)于納米乳的載藥研究表明納米乳佐劑具有可觀的應(yīng)用前景[3]。

為篩選到安全、有效能作為佐劑的納米乳新配方，本研究擬依據(jù)偽三元相圖篩選出能被水大量稀釋的納米乳新配方，并從穩(wěn)定性、粒徑大小、載水范圍等方面評(píng)價(jià)其作為疫苗佐劑的可行性。

1 材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)疫苗及毒株流感病毒：H3N2A/Victoria/210/2009NYMC X-187來(lái)源于WHO/NIBSC。H3N2流感病毒滅活疫苗單價(jià)原液由中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)學(xué)生物學(xué)研究所提供，血凝素含量為325 μg/mL。

1.2實(shí)驗(yàn)動(dòng)物ICR雌性小鼠，體重18～22 g，由中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)學(xué)生物學(xué)研究所動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供，合格證號(hào)：SCXK(滇)2010-0003。

1.3實(shí)驗(yàn)試劑Tween-80購(gòu)自上海生工生物工程有限公司；Span-80購(gòu)自天津市光復(fù)精細(xì)化工研究所；1，2-丙二醇和液體石蠟為天津市風(fēng)船化學(xué)試劑科技有限公司產(chǎn)品；氫氧化鋁佐劑(原始濃度16.31 mg/mL)由中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)學(xué)生物學(xué)研究所制備；完全弗氏佐劑購(gòu)自Sigma公司；受體破壞酶購(gòu)自東京生研株式會(huì)社。

1.4納米乳的配制稱取Tween-20 0.94 g，Span-80 0.94 g，1,2-丙二醇0.94 g，液體石蠟1.2 g，在700 r/min的轉(zhuǎn)速下攪拌均勻，邊攪拌邊以每分鐘100 μL的速度加入生理鹽水，待形成澄清透明的納米乳后，改為每分鐘500 μL繼續(xù)添加生理鹽水至16 000 μL。取1 mL納米乳，加入28.5 μL的流感疫苗原液，混勻。

1.5納米乳理化性質(zhì)測(cè)定與觀察觀察納米乳的外觀，檢測(cè)其pH值和黏度，電鏡下觀察粒子形態(tài)，用馬爾文粒度儀測(cè)其粒徑大小，在4 ℃、25 ℃和37 ℃環(huán)境中儲(chǔ)存3個(gè)月后觀察其是否破乳。

1.6實(shí)驗(yàn)分組與免疫將28日齡，體重18～22 g的雌性小鼠隨機(jī)分為生理鹽水組(每只注射0.2 mL生理鹽水)、單獨(dú)疫苗組(每只注射0.2 mL疫苗，其中含血凝素1.8 μg)、鋁佐劑對(duì)照組(每只注射0.2 mL疫苗，其中含血凝素1.8 μg,氫氧化鋁0.2 mg)、完全弗氏佐劑組(每只注射0.2 mL完全弗氏佐劑，其中含血凝素1.8 μg)和納米乳佐劑組(每只注射0.2 mL納米乳，其中含水80%，Tween-20為4.7%(w/w),Span-80 為4.7%(w/w)，1,2-丙二醇為4.7%(w/w)，液體石蠟油6%(w/w)，含血凝素1.8 μg)。每組5只，飼養(yǎng)1周后，分別于0天和21天分別經(jīng)大腿腓腸肌進(jìn)行免疫，并于初次免疫后的一周內(nèi)隔天監(jiān)測(cè)小鼠體重。

1.7血凝抑制抗體滴度的測(cè)定免疫一周后開(kāi)始每周采集分離血清，用受體破壞酶處理19 h以去除非特異性抑制劑，然后56 ℃滅活1 h，血清倍比稀釋后加入等量8個(gè)血凝單位的病毒液，結(jié)合1 h后加入1%的雞紅細(xì)胞，靜置30 min，判定血凝抑制抗體的滴度。

1.8最大給藥量試驗(yàn)隨機(jī)選取10只ICR小鼠，在0.25 mg/10g的最大給藥量下進(jìn)行一次性腹腔注射，觀察其注射一周內(nèi)的存活情況。

2 結(jié) 果

2.1納米乳的理化性質(zhì)經(jīng)測(cè)定，該納米乳pH為7.5，黏度與水接近，經(jīng)4 ℃，25 ℃，37 ℃儲(chǔ)存3個(gè)月后未見(jiàn)分層破乳，經(jīng)10 000 r/min離心后仍然能保持穩(wěn)定，表明該納米乳具有動(dòng)力學(xué)穩(wěn)定性。通過(guò)偽三元相圖(圖1)可知，該配方成乳面積大，即載水范圍較大，被大量的水稀釋后無(wú)明顯破乳現(xiàn)象，由此也能證明其動(dòng)力學(xué)穩(wěn)定性[4]。

圖1 納米乳的偽三元相圖(×10 000)

2.2電鏡觀察磷鎢酸負(fù)染后用透射電子顯微鏡進(jìn)行觀察，如圖2所示：納米乳的顆粒呈球形，易堆積聚集，粒徑大小約在50 nm左右，分布較為均勻。

2.3馬爾文粒度儀檢測(cè)用馬爾文粒度儀測(cè)定納米乳的粒徑大小和均勻度，如圖3所示，該納米乳平均粒徑大小為56.3 nm，多分散性系數(shù)(PDI值)為0.302。由粒徑強(qiáng)度曲線圖可知，該納米乳的粒子呈正態(tài)分布[5]。該檢測(cè)結(jié)果與用電子顯微鏡觀察的結(jié)果基本一致。

圖2 電子顯微鏡觀察納米乳顆粒

圖3 納米乳粒徑大小與分布

2.4小鼠體重監(jiān)測(cè)不同組別小鼠在初次免疫后一周內(nèi)，其體重增長(zhǎng)情況如圖4所示，所有組別小鼠在免疫前體重均約為20 g，初次免疫后一周內(nèi)各組小鼠體重穩(wěn)定增長(zhǎng)，其中納米乳佐劑組小鼠平均體重最高，但與對(duì)照組小鼠體重和生理鹽水組比較，差異無(wú)顯著性(P>0.05)，即納米乳對(duì)小鼠沒(méi)有明顯的毒副作用。

圖4 小鼠初次免疫后一周內(nèi)的體重變化

2.5小鼠血清中血凝抑制抗體的滴度由圖5可知：各組小鼠血清中HI抗體均在初次免疫后第四周達(dá)到峰值，納米乳佐劑組平均抗體滴度為1∶5 632，鋁佐劑組為1∶2 662，完全弗氏佐劑組為1∶1 446，單獨(dú)疫苗組為1∶934，對(duì)比可知，納米乳佐劑組的抗體峰值分別約為鋁佐劑組、完全弗氏佐劑組和單獨(dú)疫苗組的2倍、4倍和6倍，表明該納米乳佐劑具有明顯的增強(qiáng)免疫的效果，且納米乳佐劑組在抗體達(dá)峰值后能持續(xù)較長(zhǎng)時(shí)間。

圖5 各組小鼠血清中HI抗體滴度的比較

2.6最大給藥量實(shí)驗(yàn)在0.25 μg/10 g的給藥量下，小鼠均無(wú)死亡，活動(dòng)力與生理鹽水對(duì)照組相比沒(méi)有明顯差異，一周后解剖小鼠，未發(fā)現(xiàn)臟器異常，說(shuō)明該納米乳具有較好的安全性。

3 討 論

本實(shí)驗(yàn)得出的納米乳配方含水量80%(w/w)，Tween-20為4.7%(w/w)，Span-80 為4.7%(w/w)，1,2-丙二醇為4.7%(w/w)，液體石蠟油6%(w/w)。目前的同類(lèi)佐劑中，完全弗氏佐劑只能在使用前即時(shí)乳化，其過(guò)程需要在一定摩擦力或剪切力下長(zhǎng)時(shí)間進(jìn)行[6]，期間可能會(huì)有大量的抗原損失，而該納米乳與疫苗簡(jiǎn)單混合就能直接使用，避免了繁雜的乳化過(guò)程，相較于完全弗氏佐劑具有一定優(yōu)勢(shì)。鋁佐劑作為全世界范圍內(nèi)認(rèn)可的疫苗佐劑，因只能激發(fā)機(jī)體的體液免疫，故其佐劑效果不如納米乳佐劑[7]。因此，開(kāi)發(fā)工藝簡(jiǎn)單、安全性高的納米乳佐劑具有一定的現(xiàn)實(shí)意義。

在佐劑效果方面，該納米乳免疫機(jī)體產(chǎn)生的血凝抑制抗體成倍高于以上兩種對(duì)照佐劑，顯示出極大的佐劑優(yōu)勢(shì)[8]。與已報(bào)道的納米乳佐劑[9]相比，本研究將Tween-20改為T(mén)ween-80，其成乳的Km值就由1∶1變?yōu)?∶1。根據(jù)相關(guān)研究，納米乳的組分極大的影響其粒徑大小、穩(wěn)定性[10]與載水量。首先，粒徑大小是微觀顆粒的最重要性質(zhì)和評(píng)價(jià)指標(biāo)之一，可能影響納米乳體系的某些物理化學(xué)性質(zhì)(如光學(xué)性質(zhì)和重力穩(wěn)定性)，而作為佐劑，粒徑大小影響免疫反應(yīng)的類(lèi)型和反應(yīng)強(qiáng)度，如Kanchan V和Panda AK[11]發(fā)現(xiàn)200～600 nm大小的顆粒容易通過(guò)淋巴結(jié)利用抗原提呈細(xì)胞(Antigen Presenting Cell，APC)激發(fā)Th1型細(xì)胞免疫反應(yīng)，而2～8 μm的顆粒則是經(jīng)巨噬細(xì)胞的吞噬或胞飲作用運(yùn)輸至淋巴結(jié)而激發(fā)體液免疫。本研究獲得的納米乳粒徑約為50 nm，是一種嚴(yán)格意義上的納米乳，相比完全弗氏佐劑(粒徑大于1 000 nm)能激發(fā)機(jī)體產(chǎn)生更高的抗體水平，說(shuō)明這種粒徑大小的納米乳能激發(fā)較強(qiáng)的體液免疫，而對(duì)細(xì)胞免疫的影響則有待進(jìn)一步研究。其次，納米乳的組成影響其穩(wěn)定性，復(fù)合乳化劑比單一乳化劑更易形成穩(wěn)定納米乳[12]，單一表面活性劑所制備的乳劑易出現(xiàn)混濁，不同親水親油平衡(HLB)值的乳化劑形成納米乳的性質(zhì)不同，HLB值在8～18內(nèi)的表面活性劑形成O/W型納米乳，本實(shí)驗(yàn)的納米乳由Span-80(HLB值為4.3)和Tween-80(HLB值為15)形成復(fù)合乳化劑，因而穩(wěn)定性高；能被水大量稀釋，說(shuō)明是O/W型，這兩個(gè)特征為其作為佐劑候選配方提供了基礎(chǔ)。

由于該配方納米乳化學(xué)組分含量極低，不易對(duì)人體產(chǎn)生毒副作用，具有較好的安全性。其中的非離子型乳化劑Tween-80和Span-80具有毒性低，溶血作用小，能與大多數(shù)藥物配伍等特點(diǎn)，因此常作為納米乳的乳化劑。然而，Tween-80也存在一定的急性超敏反應(yīng)和外周神經(jīng)毒性[13]，其余化學(xué)組分的引入也可能形成一定毒副作用，因此探索更高含水量的制劑以降低其毒性是未來(lái)研究的重點(diǎn)。

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EfficacyofaNewNano-EmulsionasInfluenzaVaccineAdjuvant

ZHAO Lanhua,LIU Wei,TANG Shuangyang,et al
(InstitueofPathogenicBiology,UniversityofSouthChina,HunanProvincicalKeyLaboratoryforSpecialPathogensPreventionandControl,Hengyang,Hunan421001,China)

ObjectiveTo screen a new Nano-emulsion fomula with good efficiency,high stability,good safety,suitable particle size and large water capacity to evaluate its feasibility when used as vaccine adjuvant.MethodsNano-emulsions that can be diluted by plenty of water was selected based on pseudo-ternary phase diagram,the basical properties such as PH,viscosity,partical size,stability when centrifuged or long-stem storedweretested.And the emulsion was mixed with influenza vaccine for animal experiments.ICR mice were randomly divided intonormal saline group,single vaccine group,aluminium adjuvant control group,Freund’s adjuvant group and nano emulsion adjuvant group.All mice were immuned by gastrocnemius muscle and weighed within a week.The second immunization was performed at the third week.Sera were collected every week after the second immunization.Finally,the titer of hemagglutination inhibition (HI) antibody was detected and analyzed by SPSS 18.5 software.The maximum dosage experiment was performed to evaluate its safety.ResultsThe emulsion showed stable physical and chemical properties,the PH value was 7.5,viscosity close to water,and the average particle size was 56.3 nm,no demulsification was observed when centrifugedor long-term stored.The mice of Nano emulsion adjuvant group had a significantly higher antibody level than that of other groups in animal test.Finally,the dosage of 0.25 mg/10 g caused no mice death.ConclusionsThe nano-emulsion formula was a good adjuvant with stability,safety and good efficacy.

nano emulsion; adjuvant; influenza vaccine

10.15972/j.cnki.43-1509/r.2016.05.024

2016-04-05；

2016-06-30

衡陽(yáng)市科學(xué)技術(shù)發(fā)展計(jì)劃項(xiàng)目(NO：2016KJ67)；國(guó)家自然科學(xué)基金資助(NO:2013GZK09)，特殊病原體防控湖南省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室資助項(xiàng)目(湘科計(jì)字[2014]5號(hào))；湖南省分子靶標(biāo)新藥研究協(xié)同創(chuàng)新中心資助項(xiàng)目(湘教通[2015]351號(hào)).

*通訊作者，E-mail：zengyihua21cn@126.com.

R392-33

A

蔣湘蓮)