林花，金龍哲，車成來，王霞，王宇輝

(延邊州農(nóng)業(yè)科學(xué)院，吉林延吉133001)

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長(zhǎng)白山有機(jī)靈芝提取物的遺傳毒理學(xué)實(shí)驗(yàn)

林花，金龍哲*，車成來，王霞，王宇輝

(延邊州農(nóng)業(yè)科學(xué)院，吉林延吉133001)

用小鼠骨髓嗜多染紅細(xì)胞微核實(shí)驗(yàn)、小鼠精子畸形實(shí)驗(yàn)和Ames試驗(yàn)進(jìn)行了長(zhǎng)白山有機(jī)靈芝提取物的遺傳毒性研究。對(duì)受試物的遺傳毒性及是否具有潛在致癌性進(jìn)行篩選，檢測(cè)樣品的誘變性，從而評(píng)價(jià)其致突變作用的可能性。結(jié)果表明，3項(xiàng)試驗(yàn)結(jié)果均為陰性。

長(zhǎng)白山；有機(jī)靈芝提取物；遺傳毒性

靈芝(Ganodermalucidum)為擔(dān)子菌綱(Basidiomycetes)多孔菌目(Polyparales)靈芝屬(Ganoderma)大型食藥用真菌，其主要功效成份為多糖類與三萜類化合物?，F(xiàn)代科學(xué)檢測(cè)表明，靈芝在免疫系統(tǒng)的調(diào)節(jié)、通過增強(qiáng)宿主免疫調(diào)節(jié)功能達(dá)到抗腫瘤作用[1]、抗病毒作用、通過提高氧化酶活性而清除體內(nèi)自由基達(dá)到抗衰老的作用[2]、降血脂[3]、降血糖[4]、護(hù)肝等方面有著極其重要的保健醫(yī)學(xué)作用。目前，國(guó)內(nèi)外對(duì)以靈芝為原料的功能性食品的開發(fā)主要集中在一般人工栽培的靈芝上。近年來，隨著人們對(duì)有機(jī)食品的關(guān)注，以按國(guó)際有機(jī)動(dòng)植物及菌物生產(chǎn)規(guī)范生產(chǎn)的產(chǎn)品為原料加工生產(chǎn)的有機(jī)食品已成為國(guó)際市場(chǎng)上的一枝新秀。本研究依據(jù)《食品安全性毒理學(xué)評(píng)價(jià)程序和方法》[5]，以有機(jī)靈芝提取物為試驗(yàn)材料進(jìn)行了實(shí)驗(yàn)小鼠的遺傳毒理學(xué)安全性研究。

1 實(shí)驗(yàn)材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料與儀器

1.1.1 樣品。長(zhǎng)白山有機(jī)靈芝提取物，褐色粉末，由延邊州農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)特產(chǎn)品加工研究所提取。以蒸餾水配制所需各劑量。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物。ICR小白鼠50只，雌雄各半，體重：27.0～30.5g,由吉林大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供。動(dòng)物合格證號(hào)：SCXK-(吉)2003-0001。飼養(yǎng)溫度20～22℃，相對(duì)濕度55%～65%。

1.1.3 主要儀器。上海產(chǎn)電子天平(d=0.1g)，日本產(chǎn)顯微鏡，高速低溫離心機(jī)，超低溫冰柜，蒸汽壓力鍋，勻漿器，恒溫培養(yǎng)箱，恒溫水浴箱。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 小鼠骨髓嗜多染紅細(xì)胞微核實(shí)驗(yàn)[6]

按體重要求選用雌、雄小鼠各25只，稱重、標(biāo)號(hào)、隨機(jī)分為5個(gè)劑量組，每組10只，雌、雄各半。設(shè)10.0、5.0、2.5g/kg·bw 3個(gè)受試物劑量組及陰性對(duì)照組(蒸餾水)、陽性對(duì)照組(CP40g/kg·bw)。

對(duì)小鼠采用經(jīng)口灌胃方式給予受試物，間隔4h進(jìn)行2次灌胃，各劑量組每次灌胃容量均為0.2mL/10g·bw。

于2次灌胃后6h，頸椎脫臼處死小鼠，取股骨以小牛血清稀釋涂片，甲醛固定，Giemsa染色。在光學(xué)顯微鏡下，每只動(dòng)物計(jì)數(shù)1000個(gè)嗜多染紅細(xì)胞(PCE)，微核發(fā)生率以含微核的PCE千分率計(jì)(每只動(dòng)物計(jì)數(shù)200個(gè)PCE，計(jì)算PCE/RBC比值)，并進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

1.2.2 小鼠精子畸形實(shí)驗(yàn)[7]

按體重要求選用雄性小鼠40只，稱重、標(biāo)號(hào)、隨機(jī)分為5個(gè)劑量組，每組8只。設(shè)10.0、5.0、2.5g/kg·bw 3個(gè)受試物劑量組及陰性對(duì)照組(蒸餾水)、陽性對(duì)照組(CP40g/kg·bw)。

各試驗(yàn)組每日灌胃1次，連續(xù)5天，各劑量組每次灌胃容量均為0.2mL/10g·bw。

末次灌胃后第30天處死小鼠，取附睪制片，伊紅染色，每組計(jì)數(shù)5只動(dòng)物，每只動(dòng)物計(jì)數(shù)1000個(gè)結(jié)構(gòu)完整的精子，計(jì)算畸變精子發(fā)生率，并進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

1.2.3 Ames試驗(yàn)

采用四株鼠傷寒沙門氏菌突變型菌株TA97、TA98、TA100、TA102。(由哈爾濱醫(yī)科大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院提供)，生物學(xué)形狀符合菌株要求。測(cè)試菌液濃度每毫升不少于1×109～2×109活菌數(shù)。

采用多氯聯(lián)苯(PCB)誘導(dǎo)的大鼠肝勻漿作為體外代謝活化系統(tǒng)。S-9制成后，經(jīng)無菌檢查，測(cè)定蛋白含量(Lowry法)，每毫升蛋白含量不超過40mg為宜，并經(jīng)間接致癌物(1，8-二羥基蒽醌50.0μg/皿及二氨基芴10.0μg/皿)鑒定其生物活性合格后儲(chǔ)存于深低溫或冰凍干燥,保存期不超過1年。

溶劑對(duì)照：蒸餾水。陽性對(duì)照：非活化系統(tǒng)TA97、TA98、TA102為敵克松50.0μg/皿，TA100為疊氮鈉1.5μg/皿?；罨到y(tǒng)TA97、TA98、TA100采用二氨基芴10.0μg/皿，TA102為1，8-二羥基蒽醌50.0μg/皿。

稱取樣品2.5g加蒸餾水至50mL，混均即為5000μg/皿劑量組受試液，吸取該液25mL加蒸餾水至50mL混均即為2500μg/皿劑量組受試液，同法配制其他劑量組受試液。上述受試液經(jīng)0.103MPa，20min滅菌后使用。試驗(yàn)設(shè)313、625、1250、2500、5000μg/皿5個(gè)劑量。在頂層瓊脂中加入0.1mL試驗(yàn)菌株增菌液、0.1mL受試物溶液，代謝活化時(shí)加入0.5mL S9混合液，混勻后倒入底層培養(yǎng)基平板上。在37℃培養(yǎng)48h，計(jì)數(shù)每皿回變菌落數(shù)。如果受試物的回變菌落數(shù)是自發(fā)回變菌落數(shù)2倍以上，并具有劑量—反應(yīng)關(guān)系者則定為陽性。每個(gè)劑量做3個(gè)平行。整套試驗(yàn)在相同條件下重復(fù)做2次并分別統(tǒng)計(jì)。

2 實(shí)驗(yàn)與分析

2.1 小鼠骨髓嗜多染紅細(xì)胞微核實(shí)驗(yàn)結(jié)果

表1 小鼠骨髓PCE微核試驗(yàn)結(jié)果

經(jīng)卡方檢驗(yàn)，各劑量組微核率與陰性對(duì)照組比較無顯著性差異(P>0.05)，陽性對(duì)照組與陰性對(duì)照組比較有高度顯著性差異(P<0.01)，各組動(dòng)物

PCE/RBC值方差分析無顯著性差異。

2.2 小鼠精子畸形試驗(yàn)結(jié)果

表2 小鼠精子畸形試驗(yàn)結(jié)果

經(jīng)Wilconson秩和檢驗(yàn)，各劑量組精子畸形率與陰性對(duì)照組比較無顯著差異(P﹥0.05)，陽性對(duì)照組與陰性對(duì)照組比較有高度顯著性差異(P﹤0.01)。

2.3 Ames試驗(yàn)結(jié)果

2.3.1 第一次試驗(yàn)結(jié)果

表3 Ames試驗(yàn)結(jié)果(第一次)

2.3.2 第二次試驗(yàn)結(jié)果

表4 Ames試驗(yàn)結(jié)果(第二次)

本實(shí)驗(yàn)條件下，樣品Ames試驗(yàn)結(jié)果為陰性。

3 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)按照《食品安全性毒理學(xué)評(píng)價(jià)程序和方法》[5]對(duì)長(zhǎng)白山有機(jī)靈芝提取物進(jìn)行了小鼠骨髓嗜多染紅細(xì)胞微核試驗(yàn)、小鼠精子畸形試驗(yàn)和Ames試驗(yàn)。

該樣品骨髓嗜多染紅細(xì)胞微核試驗(yàn)結(jié)果為陰性，各動(dòng)物未見細(xì)胞毒性作用。該樣品精子試驗(yàn)結(jié)果為陰性。本實(shí)驗(yàn)條件下，樣品Ames試驗(yàn)結(jié)果為陰性。

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3 總結(jié)

試驗(yàn)結(jié)果表明，對(duì)核桃星天牛幼蟲施用不同藥劑，均可取得很好的防治效果，即在星天牛幼蟲發(fā)生期，施用80%的敵敵畏乳油10倍液、40%的樂果10倍液、56%的磷化鋁0.2～0.3g，防治效果分別為91.71%、90.20%、92.86%，均達(dá)到90%以上，防治效果良好。

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S567.3+1

A

林花(1981-),女 , 助理研究員,主要從事天然產(chǎn)物的功效與毒理安全性研究，Email：23124951@qq.com；*通訊作者：金龍哲。

2016-08-16

DOI.:10.13268/j.cnki.fbsic.2016.06.009