于春濤，劉超

（滄州醫(yī)學(xué)高等專科學(xué)校，河北滄州061001）

不同產(chǎn)區(qū)濃香型白酒窖泥中細(xì)菌多樣性分析

于春濤，劉超

（滄州醫(yī)學(xué)高等?？茖W(xué)校，河北滄州061001）

以十里香窖泥（河北滄州）、景陽春窖泥（山東景芝鎮(zhèn)）、瀘州老窖窖泥（四川瀘州）和龍江家園窖泥（黑龍江雙城）為研究對(duì)象，利用變性梯度凝膠電泳（denaturinggradientgelelectrophoresis，DGGE）和基因測(cè)序技術(shù)對(duì)窖泥中的細(xì)菌和乳酸菌的多樣性進(jìn)行分析。結(jié)果表明：在4種窖泥樣品景陽春窖泥中細(xì)菌多樣性最低，龍江家園窖泥中細(xì)菌多樣性最高；十里香窖泥中乳酸菌的多樣性最低，瀘州老窖窖泥中乳酸菌的多樣性最高。窖泥中的細(xì)菌以厚壁菌門為主，乳酸菌以乳酸桿菌為主，不同產(chǎn)區(qū)窖泥中細(xì)菌和乳酸菌的組成存在著差異。上述結(jié)果說明濃香型白酒窖泥中細(xì)菌多樣性與其產(chǎn)區(qū)之間存在一定聯(lián)系。

濃香型白酒；窖泥；細(xì)菌；乳酸菌；多樣性；變形梯度凝膠電泳

白酒是一種由糧食發(fā)酵而來的蒸餾酒，其中以濃香型的白酒產(chǎn)量最高，并且由其濃郁的窖香風(fēng)味深受人們的喜愛[1-2]。窖泥在濃香型白酒生產(chǎn)過程中發(fā)揮著重要的作用，并在長(zhǎng)期的演化過程中形成了其獨(dú)特的微生物特征，并通過這些微生物的發(fā)酵會(huì)賦予白酒獨(dú)特的風(fēng)味[3-4]。不同地區(qū)的濃香型白酒其組成成分和風(fēng)味具有顯著的差異，造成這些差異的主要原因是其窖泥中微生物的不同，因此對(duì)不同產(chǎn)區(qū)濃香型白酒窖泥進(jìn)行微生物多樣性的分析十分必要[5-6]。

濃香型白酒窖泥中的微生物包括了細(xì)菌、古細(xì)菌和真菌，其中細(xì)菌是窖泥微生物中優(yōu)勢(shì)的群體，此外，乳酸菌在濃香型白酒的發(fā)酵過程中發(fā)揮著重要的作用，其代謝產(chǎn)物乳酸乙酯有助于白酒風(fēng)味的形成[7-8]。本研究利用變性梯度凝膠電泳（Denaturing Gradient Gel Electrophoresis，DGGE）技術(shù)揭示不同產(chǎn)區(qū)窖泥中細(xì)菌和乳酸菌多樣性的差異，為闡述不同產(chǎn)地濃香型白酒酒體風(fēng)格不同的原因提供理論參考。

1 材料與儀器

1.1 主要材料

1.1.1 樣品來源

窖泥分別采自十里香窖泥：河北滄州；景陽春窖泥：山東景芝鎮(zhèn)；瀘州老窖窖泥：四川瀘州；龍江家園窖泥：黑龍江雙城，分別標(biāo)號(hào)為A、B、C和D，窖齡均為30年。每個(gè)窖池選取其上層、中層和底部進(jìn)行采樣，混合后-20℃保藏待用。

1.1.2 主要試劑

MIBIO UltraClean SoilDNA Isolation Kit、2×Taq PCRMasterMix（含染料）、Marker I：均購自北京天根生化科技有限公司；瓊脂糖：南京生興生物；無水乙醇：上海博谷生物；引物BA338f和UN518r，Lac1和Lac2，40 bp“GC”：北京諾賽基因組研究中心有限公司。

1.2 試驗(yàn)儀器

TG328A電子分析天平：上海精科天美儀器有限公司；TD5A-WS臺(tái)式大容量離心機(jī)：常州市萬合儀器制造有限公司；HH-8恒溫水浴鍋：常州市金壇區(qū)環(huán)宇科學(xué)儀器廠；BG-Power600通用電泳儀電源：上海珂淮儀器有限公司；變性梯度凝膠（DGGE）電泳儀：美國Bio-Rad公司。

2 方法

2.1 樣品DNA提取及PCR擴(kuò)增

根據(jù)鄧杰等[9]的報(bào)道，利用MIBIOUltraClean SoilDNA Isolation Kit對(duì)不同產(chǎn)區(qū)的窖泥細(xì)菌DNA進(jìn)行提取。以上述DNA為模板，對(duì)其進(jìn)行細(xì)菌16S rRNA V3區(qū)和乳酸菌PCR擴(kuò)增。細(xì)菌16SrDNAV3區(qū)擴(kuò)增采用通用引物BA338f和UN518r（5’-端加一個(gè)40bp“GC”夾），乳酸菌擴(kuò)增引物采用Lac1和Lac2（5’端加一個(gè)40 bp“GC”夾），反應(yīng)體系和擴(kuò)增條件參考已有報(bào)道[10-11]。

2.2 DGGE分析

細(xì)菌16SrDNA V3區(qū)DGGE分析的變性凝膠梯度為30%～55%，上樣量為30μL、反應(yīng)溫度為60℃、電壓120 V、電泳14 h[12]；乳酸菌DGGE分析采用30%～50%的變性梯度，上樣量為30μL、反應(yīng)溫度為60℃、電壓70V、電泳16 h[11]。電泳結(jié)束后將DGGE膠用去離子水清洗，之后在1%的GeneFinder中避光染色30 min，UVP凝膠成像記錄DGGE圖譜，并利用Shannon-Weaver指數(shù)分析窖泥細(xì)菌度多樣性。

2.3 基因測(cè)序

將染色后的膠體至于紫外燈下，利用無菌手術(shù)刀快速切割膠體中不同位置的條帶，去離子水清洗，搗碎，加入50 uL去離子水，在4℃冰箱過夜。以上清液為模板，采用沒有GC夾的引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序分析，并將測(cè)序得到的基因序列在NCBI數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行Blast比對(duì)，確定條帶所代表的菌株的菌屬。

3 結(jié)果與分析

3.1 不同產(chǎn)區(qū)窖泥中細(xì)菌和乳酸菌PCR擴(kuò)增結(jié)果

利用1%瓊脂糖凝膠電泳分別對(duì)窖泥中的細(xì)菌DNA和乳酸菌DNA擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行檢驗(yàn)，結(jié)果如圖1所示。

圖1不同產(chǎn)區(qū)窖泥DNA擴(kuò)增產(chǎn)物Fig.1 Amplification productof DNA of pitmud sam ples from different producing regions

圖1 （a）中，4個(gè)窖泥樣品DNA的16S rRNAV3區(qū)擴(kuò)增產(chǎn)物的目的條帶均一清晰，大小都在200 bp左右，無雜帶，可認(rèn)定為細(xì)菌16S rRNA V3區(qū)目的條帶。圖1（b）中，所有樣品的條帶大小在400 bp左右，條帶均一清晰，可認(rèn)為為乳酸菌的目的條帶。

3.2 不同產(chǎn)區(qū)窖泥細(xì)菌多樣性分析

利用DGGE電泳技術(shù)分析濃香型白酒窖泥中細(xì)菌的生物多樣性，并利用Shannon-Weaver指數(shù)評(píng)估其多樣性，PCR-DGGE圖譜結(jié)果見圖2、圖3，生物多樣性結(jié)果見圖4。

圖2 不同產(chǎn)區(qū)窖泥樣品細(xì)菌DGGE圖譜Fig.2 DGGE profileofbacteria of pitmud sam ples from different producing regions

圖3 不同產(chǎn)區(qū)窖泥樣乳酸菌DGGE圖譜Fig.3 DGGE profileof lactic acid bacteria ofpitmud samples from different producing regions

由圖2和圖3中可以看出不同產(chǎn)區(qū)的窖泥樣本的細(xì)菌和乳酸菌DGGE圖譜中具有一定的差異，在細(xì)菌圖譜中共分離出12個(gè)不同位置的條帶，在乳酸菌圖譜中共發(fā)現(xiàn)8個(gè)位置不同的條帶。由圖4（a）可知，B（景陽春窖泥）窖泥中細(xì)菌多樣性最低，D（龍江家園窖泥）中細(xì)菌多樣性最高。由圖4（b）中可知A（十里香窖泥）窖泥中乳酸菌的多樣性最低，而C（瀘州老窖窖泥）窖泥中乳酸菌的多樣性最高。上述結(jié)果表明不同產(chǎn)區(qū)濃香型白酒窖泥中細(xì)菌和乳酸菌的多樣性存在一定的差異。

3.3 DGGE圖譜優(yōu)勢(shì)條帶測(cè)序分析

利用基因測(cè)序技術(shù)對(duì)DGGE圖譜中的優(yōu)勢(shì)條帶進(jìn)行測(cè)序分析，條帶的位置選取如圖2和圖3所示，測(cè)序結(jié)果如表1。

表1 不同產(chǎn)地窖泥細(xì)菌和乳酸菌DGGE圖譜中條帶Blast對(duì)比結(jié)果Table1 Blast resultof bands in DGGE profilesof bacteria and lactic acid bacteria of pitmud sam ples from different producing regions

其中瘤胃球菌屬（Ruminococcaceae）、未培養(yǎng)的假單胞菌（Uncultured Pseudomonadaceae）、Caloramator mitchellensis、喜鹽芽孢桿菌屬（Haloballus）和Uncultured bacterium在4個(gè)產(chǎn)區(qū)的窖泥中均有發(fā)現(xiàn)；梭菌屬（Clostridium sp.）、乳酸桿菌（Lactobacillussp.）和喜熱菌（Caloramator）只存在于A（十里香窖泥）、B（景陽春窖泥）和C（瀘州老窖窖泥）中；Uncultured Synergistaceae和消化桿菌科（Peptococcaceae）只存在于D（龍江家園窖泥）中；未培養(yǎng)的鹽扁菌（Uncultured Haloplasmataceae）則只存在于3（瀘州老窖窖泥）中。

窖泥中乳酸菌的測(cè)序選取了8條不同位置的條帶，其中4個(gè)不同產(chǎn)地濃香型白酒窖泥中都含有發(fā)酵乳酸菌（L.fermentum）、乙酰微小桿菌（Exiguobacterium acetylicum）和未培養(yǎng)的乳酸桿菌（Uncultured Lacto－bacillus）；檸檬明串球菌（Leuconostoc citreum）和耐酸乳桿菌（L.acetotolerans）存在于B（景陽春窖泥）、C（瀘州老窖窖泥）和D（龍江家園窖泥）中；融合魏斯氏菌（Weissella confusa）存在于B（景陽春窖泥）、C（瀘州老窖窖泥）中；L.odoratitofui則存在于A（十里香窖泥）、B（景陽春窖泥）和C（瀘州老窖窖泥）中。

4 討論

Shannon-Wiener指數(shù)能夠用于評(píng)估樣品中微生物的多樣性，Shannon-Wiener值越高表示樣品中微生物的種類越多，其多樣性就越高[11]。本試驗(yàn)中4個(gè)窖泥樣品的細(xì)菌和乳酸菌Shannon-Wiener值差異明顯，說明不同產(chǎn)區(qū)的濃香型白酒的窖泥中細(xì)菌和乳酸菌中的種類和數(shù)量存在著地域性的差異。在此基礎(chǔ)上，基因測(cè)序的結(jié)果表明，4個(gè)不同產(chǎn)區(qū)的窖泥中細(xì)菌和乳酸菌的種類也有所差異，這可能是不同產(chǎn)區(qū)濃香型白酒風(fēng)味各具特點(diǎn)的重要原因之一。

4個(gè)不同產(chǎn)區(qū)濃香型白酒的窖泥中主要的細(xì)菌分別屬于Firmicutes（厚壁菌門），Synergistaceae（互養(yǎng)菌門），Chloroflexi（綠彎菌門）、Actinobacteria（放線菌門）、Bacteroidetes（擬桿菌門）、Acidobacteria（酸桿菌門）和Lentisphaerae（黏膠球形菌門），其中厚壁菌門為優(yōu)勢(shì)菌門。其中互營共養(yǎng)單胞菌屬、喜熱菌屬和梭菌屬能夠產(chǎn)生乙酸、丙酸、丁酸等有機(jī)酸，從而進(jìn)一步反應(yīng)生成以己酸乙酯、丁酸乙酯為主體的復(fù)合香氣[4]。除此之外，乳酸菌也是窖泥中的功能菌，主要參與風(fēng)味物質(zhì)乳酸乙酯的形成。本研究中4個(gè)不同產(chǎn)區(qū)濃香型白酒的窖泥細(xì)菌和乳酸菌的組成既有相同菌株也有特有菌株，這說明窖泥中細(xì)菌及乳酸菌的組成既有相似的組成，也會(huì)由于不同地域土壤成分、天氣或生產(chǎn)工藝的差異而具有獨(dú)特性。

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Analysis of Bacterial Diversity in Different Areas of Strong Aromatic Chinese Spirit in Pit M ud

YUChun-tao，LIUChao
（Cangzhou MedicalCollege，Cangzhou 061001，Hebei，China）

The pitmud from Shilixiang（HebeiCangzhou），King spring（Shandong JingZhi town），Luzhou laojiao（Sichuan Luzhou）and Longjiang home（Heilongjiang Shuangcheng）were the research objects.The diversity of bacteria and lactic acid bacteria were analyzed using the denaturing gradient gel electrophoresis（DGGE）and gene sequencing technology.Among the four samples in pitmud，the bacterial diversity of King springwas the lowest，which of Longjiang homewas the highest；the diversity lactic acid bacteria of Shilixiang was the lowest，which of Luzhou laojiaowas the highest.The Firmicuteswas themain phylum in bacteria，the Lactobacilluswas the dominantgenus in lactic acid bacteria.Therewere some difference in the composition of bacteria and lactic acid bacteria in pitmud from different producing regions.These results demonstrated that therewasa connection between bacterialdiversity ofpitmud and their producing regions.

strong aromatic Chinese spirit；pitmud；bacteria；lactic acid bacteria；diversity；denaturing gradientgelelectrophoresis（DGGE）

10.3969/j.issn.1005-6521.2016.24.035

2016-08-10

于春濤（1979—），男（漢），講師，碩士研究生，主要研究方向：微生物發(fā)酵。