黎小椿，李燕，唐小閑，羅楊合，*，何星存

（1.賀州學(xué)院食品科學(xué)與工程技術(shù)研究院，廣西賀州542899；2.大連工業(yè)大學(xué)食品學(xué)院，遼寧大連116034）

簡單靈敏的GO-RRS-ET法測定氨基酸

黎小椿1，2，李燕2，唐小閑1，2，羅楊合1，2，*，何星存1，2

（1.賀州學(xué)院食品科學(xué)與工程技術(shù)研究院，廣西賀州542899；2.大連工業(yè)大學(xué)食品學(xué)院，遼寧大連116034）

在pH 7.2KH2PO4-NaOH緩沖液和85℃水浴加熱的條件下，氨基酸與茚三酮生成藍(lán)紫色的產(chǎn)物羅曼紫（RP），使氧化石墨烯（GO）在400 nm處產(chǎn)生的RRS峰強(qiáng)度降低，這是由于作為供體的GO與作為受體的RP之間發(fā)生了RRS能量轉(zhuǎn)移（RRS-ET）所致。隨著氨基酸濃度增加，生成的RP增加，RRS-ET增強(qiáng)，400 nm處RRS峰強(qiáng)度線性降低，其降低值在1.33μmol/L～200μmol/L氨基酸濃度范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系，據(jù)此建立一種簡便、快速、靈敏、選擇性高的測定痕量氨基酸的RRS-ET新方法，檢測限1.0μmol/L。該方法用于馬蹄中氨基酸的檢測，測得馬蹄果肉氨基酸含量為2.847mg/g，馬蹄皮氨基酸含量為1.094mg/g，可為馬蹄深加工提高有益參考。

氧化石墨烯；共振瑞利散射；能量轉(zhuǎn)移；茚三酮；氨基酸

自然界中的氨基酸有二十幾種，存在于大多數(shù)食品和糧食中。氨基酸的分析檢測對食品質(zhì)量監(jiān)控、農(nóng)業(yè)生產(chǎn)、疾病診斷和治療等具有重要意義，比如測定羥脯氨酸含量可鑒別牛奶是否為皮革水解蛋白“皮革奶”。當(dāng)前，利用分子光譜分析氨基酸的主要方法包括分光光度法、熒光法、共振瑞利散射（RRS）法、表面增強(qiáng)拉曼散射（SERS）法、化學(xué)發(fā)光法等，其中，RRS法是一種簡便、快速、高靈敏度的光譜分析方法，已用于痕量金屬、非金屬、小分子藥物、蛋白質(zhì)、核酸等分析[1-3]。當(dāng)RRS光譜較強(qiáng)能量較高的物質(zhì)與RRS光譜較弱能量較低的物質(zhì)接觸時(shí)，若前者的RRS光譜與后者的吸收光譜有重疊，兩者就會發(fā)生共振瑞利散射能量轉(zhuǎn)移（RRS-ET），導(dǎo)致前者RRS光譜減弱，由此建立的RRS-ET新方法已實(shí)現(xiàn)了對痕量茶多酚、碘酸根、過氧化氫等物質(zhì)的檢測[4-5]。

氧化石墨烯（GO）是石墨烯的重要衍生物，具有較強(qiáng)的RRS光譜，它不但價(jià)格低廉，原料易得，而且具有單層石墨平面結(jié)構(gòu)，含有豐富的含氧活性基團(tuán)，如羥基、羧基、環(huán)氧基，易溶于水，其特殊的結(jié)構(gòu)使其具有高效的吸附性、兩親性、熒光猝滅性和拉曼散射性，已被廣泛用于生化分析[6]，但鮮見基于GO的RRSET測定痕量氨基酸的研究報(bào)道。氨基酸與茚三酮反應(yīng)生成的藍(lán)紫色化合物羅曼紫（RP）的RRS光譜較弱，吸收光譜與GO的RRS光譜有一定的重疊。本文利用GO與RP之間發(fā)生RRS-ET導(dǎo)致GO的RRS減弱，建立一種簡便、快速、靈敏、選擇性高的測定痕量氨基酸的新方法，并用于馬蹄中氨基酸含量的檢測，結(jié)果令人滿意。

1 材料與方法

1.1 主要儀器和試劑

F-7000型熒光分光光度計(jì)：日立公司；TU-1901型雙光束紫外可見分光光度計(jì)：北京普析通用儀器有限責(zé)任公司；FEIQuanta 200 FEG場發(fā)射掃描電子顯微鏡：荷蘭飛利浦公司；納米粒度和Zeta電位儀：英國馬爾文儀器有限公司；SK 1200H超聲波反應(yīng)器：上?？茖?dǎo)超聲儀器有限公司。

50mmol/L pH 7.2磷酸鹽緩沖液（PBS）：上海鵬彩精細(xì)化工有限公司；20 g/L茚三酮溶液：上海國藥集團(tuán)；1mmol/L甘氨酸（Gly）：石家莊東華金龍化工有限公司。

0.1 g/L氧化石墨烯（GO，南京先豐納米材料科技有限公司）：準(zhǔn)確稱量0.1000 g GO，加水超聲溶解后轉(zhuǎn)移至容量瓶，定容至100mL，得到1 g/LGO，使用時(shí)以水稀釋10倍得到0.1 g/LGO，使用前超聲15min。

試驗(yàn)所用試劑均為分析純級試劑，試驗(yàn)所用水均為亞沸水。

1.2 方法

在試管中依次加入90μLpH 7.2PBS、70μL 20 g/L的茚三酮溶液，分別加入一定量的氨基酸標(biāo)準(zhǔn)溶液[甘氨酸（Gly）、谷氨酸（Glu）、賴氨酸（Lys）、天門冬氨酸（Asp）、苯丙氨酸（Phe）]，85℃水浴加熱10min，流水冷卻后，加入400μL 0.1 g/LGO，用亞沸水定容到1.5mL。在電壓450 v、激發(fā)狹縫和發(fā)射狹縫均為5 nm、發(fā)射濾波器為1%T衰減器、λex-λem=Δλ=0的條件下，用熒光分光光度計(jì)同步掃描獲得共振瑞利散射（RRS）光譜。測量溶液的RRS強(qiáng)度I，以不加氨基酸標(biāo)準(zhǔn)溶液做試劑空白的RRS值為I0，計(jì)算ΔI400nm=I0-I值。

7.2.2梨小食心蟲①誘殺越冬幼蟲。4月中旬開始在樹干上綁誘蟲帶，誘殺越冬幼蟲。②誘捕成蛾。梨小食心蟲具趨味性，4月至采摘結(jié)束在果園里用廣口瓶裝糖醋液或者幼蟲凈誘捕成蟲。③噴藥防治。第1代在4月上旬防治，9月份集中防治第4代害蟲，用藥與桃小食心蟲相同。④果實(shí)套袋，也能避免危害。梨小食心蟲在貴州長順縣蘋果園的最佳防治措施是從4月中旬開始，每畝果園用30～35套迷向管進(jìn)行迷向防治，每40～50天更換1次迷向劑，直至蘋果采摘結(jié)束。

2 結(jié)果與討論

2.1 方法原理

非金屬納米材料GO具有較強(qiáng)的RRS效應(yīng)。在pH 7.2PBS和水浴加熱的條件下，氨基酸與茚三酮生成藍(lán)紫色的配合物羅曼紫（RP），其RRS光譜較弱，能量較低，其吸收光譜與GO的RRS光譜有一定的重疊。當(dāng)兩者接近時(shí)，GO將RRS能量轉(zhuǎn)移給RP，導(dǎo)致體系的RRS強(qiáng)度降低。隨著氨基酸濃度增加，生成的RP增多，GO轉(zhuǎn)移給RP的RRS能量也隨之增多，體系400 nm處的RRS強(qiáng)度線性降低（圖1）。據(jù)此可建立一種簡便、快速、靈敏、選擇性高的測定痕量氨基酸的RRS-ET新方法。

圖1 氧化石墨烯-氨基酸-茚三酮體系RRS-ET原理圖Fig.1 RRS-ET principleof grapheneOxide-am ino acidsninhydrin system

2.2 RRS光譜

Gly-茚三酮-GO體系的RRS光譜如圖2所示。

圖2 G ly-茚三酮-GO體系的RRS光譜Fig.2 RRSspectra of theG ly-ninhydrin-GO system

GO具有較強(qiáng)的RRS效應(yīng)，當(dāng)體系中加入pH 7.2 PBS和茚三酮時(shí)，其RRS光譜無明顯變化。在pH 7.2PBS和85℃水浴加熱條件下，以甘氨酸（Gly）為代表的氨基酸與茚三酮反應(yīng)生成藍(lán)紫色化合物羅曼紫（RP），其RRS光譜極弱。當(dāng)GO與RP共存時(shí)，體系的RRS光譜強(qiáng)度隨著氨基酸濃度的增加而減弱，其中400 nm處RRS減弱最多，并出現(xiàn)了一個(gè)峰谷，故本文選擇GO體系400 nm RRS峰降低值測量痕量氨基酸含量。

2.3 吸收光譜

在pH 7.6 PBS中，茚三酮的吸收光譜很弱，在350 nm～700 nm沒有吸收峰；甘氨酸與茚三酮反應(yīng)生成的藍(lán)紫色產(chǎn)物羅曼紫在400、565 nm處有2個(gè)強(qiáng)度相當(dāng)?shù)奈辗澹译S著甘氨酸濃度增大，體系的吸收光譜增強(qiáng)。GO的吸收光譜較弱，當(dāng)體系中加入pH 7.2 PBS和茚三酮時(shí)，亦無明顯變化。當(dāng)GO與甘氨酸（Gly）跟茚三酮反應(yīng)生成的藍(lán)紫色化合物羅曼紫（RP）共存時(shí)，體系原來強(qiáng)度相當(dāng)?shù)?00 nm吸收峰便強(qiáng)于565 nm吸收峰（圖3）。這證明了GO與RP之間發(fā)生了能量轉(zhuǎn)移，是導(dǎo)致GO的RRS光譜強(qiáng)度減弱且400 nm處減弱最多的原因。

圖3 Gly-茚三酮-GO體系的吸收光譜Fig.3 Absorption spectra of the G ly-ninhydrin-GO system

2.4 SEM圖

由圖4（a）和圖4（b）可知，GO的粒徑在加入Glu前后未發(fā)生改變，說明體系RRS光譜強(qiáng)度減弱不是由于體系中納米粒子粒徑的改變引起的，而是由于發(fā)生了RRS-ET。

2.5 分析條件的優(yōu)化

圖4 氧化石墨烯的SEM圖Fig.4 SEM im agesof GO

以Glu為代表優(yōu)化了GO-RP體系RRS-ET法測定氨基酸的條件?？疾炝薖BS的pH和濃度、茚三酮溶液濃度、反應(yīng)溫度和時(shí)間、GO濃度對RRS光譜的影響。結(jié)果表明，當(dāng)PBS的pH為7.2、濃度為3mmol/L，茚三酮溶液濃度為0.93 g/L，反應(yīng)溫度為85℃、時(shí)間10 min，GO濃度為26.7 mg/L，ΔI400nm=I0-I值達(dá)到最大。

2.6 工作曲線

在3 mmol/L pH 7.2 PBS、0.93 g/L茚三酮溶液、85℃水浴加熱10min、26.7mg/LGO的最優(yōu)條件下，按試驗(yàn)方法繪制了甘氨酸（Gly）的RRS工作曲線（圖5），回歸方程ΔI400nm=4.72C+12，R2=0.995 8，Gly濃度線性范圍1.33μmol/L～200μmol/L，檢測限1.0μmol/L。

圖5 G ly-茚三酮-GO的RRS工作曲線Fig.5 RRSworking cureof theG ly-ninhydrin-GO system

2.7 共存物質(zhì)的影響

按試驗(yàn)方法考察了測定3.33μmol/LGly時(shí)其它共存物質(zhì)的干擾情況，結(jié)果表明，在相對誤差不超過± 10.0%的范圍內(nèi)，10 000倍的尿素、NO2-、NO3-，500倍的Cl-、Br-、S2-、SO32-、Pb2+和100倍的Mg2+、Ba2+、Cu2+、Fe3+、Zn2+、SO42-等常見物質(zhì)不干擾測定。對于含有氨基可以與茚三酮反應(yīng)生成藍(lán)紫色化合物羅曼紫的多肽、蛋白質(zhì)等干擾物質(zhì)，可以通過簡單的沉淀分離方法除去。因此，本方法具有較好的選擇性。

2.8 樣品分析

將從市場采購的馬蹄洗凈，分開馬蹄果皮和果肉。稱取29.785 0 g馬蹄皮于燒杯中，加150mL沸水煮沸15min，抽濾后將濾液轉(zhuǎn)移至容量瓶，定容至250mL。稱取68.850 1 g馬蹄果肉，用研缽研碎后轉(zhuǎn)移至燒杯中，加150mL沸水煮沸15min，抽濾后將濾液轉(zhuǎn)移至容量瓶，定容至250mL。取適量的馬蹄皮和馬蹄果肉提取液進(jìn)行加標(biāo)回收試驗(yàn)，結(jié)果見表2。

表2 樣品分析結(jié)果（n=5）Table2 Results for detection of samples

由表2可知：1）馬蹄果肉氨基酸含量為2.847mg/g，馬蹄皮氨基酸含量為1.094mg/g；2）該方法回收率在91.7%～101%之間，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差在3.7%～4.2%之間，說明靈敏度較高。

3 結(jié)論

本文利用氨基酸與茚三酮在85℃水浴加熱條件下反應(yīng)生成的藍(lán)紫色物質(zhì)羅曼紫，與非金屬納米材料氧化石墨烯發(fā)生共振瑞利散射能量轉(zhuǎn)移（RRS-ET），導(dǎo)致體系400 nm處的共振瑞利散射強(qiáng)度隨著氨基酸濃度的增大而線性減弱，據(jù)此建立了一種簡便、快速、靈敏、選擇性高的測定痕量氨基酸的RRS-ET新方法，氨基酸濃度線性范圍1.33μmol/L～200μmol/L，檢測限1.0μmol/L。該方法用于馬蹄中氨基酸含量的檢測，測得馬蹄果肉氨基酸含量為2.847mg/g，馬蹄皮氨基酸含量為1.094mg/g，可為馬蹄深加工提高有益參考。

[1]LUOYH,ZHANGX H,YAODM,etal.Resonance Rayleigh scattering detection of trace PDGF based on catalysis of an aptamermodified nanogold probe in the Fehling reaction[J].RSCAdvances, 2014,4(53):28052-28055

[2]LUOY H,XU L L,LIANGAH,etal.A highly sensitive resonance Rayleigh scattering assay for detection of Hg (II)using immunonanogold as probe[J].RSC Advances,2014,4(37):19234-19237

[3] LUO Y H,WANG P F,LIT S,et al.A highly sensitive enzyme catalytic method for the detection of ethanol based on resonance scattering effect of gold particles[J].Plasmonics,2013,8(2):307-312

[4]LIANG A H,WANG Y H,WENG Q,et al.A silver nanorod resonance rayleigh scattering-energy transfer analytical platform for trace tea polyphenols[J].Food Chemistry,2016,197(Part A):395-399

[5]WANG Y H,ZHANG X H,LIU Q Y,et al.A simple and sensitive graphene oxide/gold nanoparticle surface plasmon resonance Rayleigh scattering-energy transfer analyticalplatform for detection of iodideand H2O2[J].RSCAdvances,2015,5(12):9272-9277

[6]LIU ZB,LIUBW,DING JS,etal.Fluorescentsensorsusing DNA-functionalizedgrapheneoxide[J].Analyticaland BioanalyticalChemistry,2014,406(27):6885-6902

A Sim ple and Sensitive Graphene Oxide Resonance Rayleigh Scattering-energy Transfer M ethod for Detection of Am ino Acids

LIXiao-chun1，2，LIYan2，TANGXiao-xian1，2，LUOYang-he1，2，*，HEXing-cun1，2
（1.Institute of Food Scienceand Technology，Hezhou University，Hezhou 542899，Guangxi，China；2.School of Food Science and Technology，Dalian Polytechnic University，Dalian 116034，Liaoning，China）

Nonmetallic nanomaterialgraphene oxide（GO）hasstrong RRSeffect thatexhibited a strong RRS peak at400 nm.In the presence ofpH 7.2 KH2PO4-NaOH buffer solution and 85℃water bath heating，ninhydrin reacted with aminoacids to form blue-violetcomplex Ruhemann'spurple（RP）that reduced the RRSpeak at400 nm due to the RRS-energy transfer（RRS-ET）from the GO as donors to the RPas receptors.With the increase of amino acids concentration，the formed RP increased，and the RRS intensity quenched linearly at 400 nm due to the RRS-ETenhancing.The quenched intensity responds linearlywith amino acids concentration in the range of 1.33μmol/L-200μmol/L.Thus，a new RRS-ETmethod for the determination of trace amino acidswasestablished with the detection limitof1.0μmol/L.Themethod used in the detection ofamino acids in water chestnut，and the amino acid contentof the peeland fleshwere 2.847mg/g and 1.094mg/g respectively.It could bea useful reference for the processing ofwater chestnut.

grapheneoxide；ResonanceRayleigh Scattering；energy transfer；ninhydrin；aminoacids

10.3969/j.issn.1005-6521.2016.24.023

2016-04-19

國家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目（21365011；21367012）

黎小椿（1987—），女（漢），在讀碩士研究生，研究方向：食品分析。

*通信作者：羅楊合（1969—），男（漢），教授，博士，研究方向：食品分析。