楊文婷，艾西，韋琴

（武漢工商學(xué)院環(huán)境與生物工程學(xué)院，湖北武漢430065）

微波輔助提取酢漿草黃酮的工藝優(yōu)化

楊文婷，艾西，韋琴

（武漢工商學(xué)院環(huán)境與生物工程學(xué)院，湖北武漢430065）

采用單因素試驗(yàn)和正交設(shè)計(jì)對(duì)微波輔助提取酢漿草黃酮的工藝進(jìn)行了優(yōu)化，以總黃酮的得率為參考指標(biāo)，考察微波作用時(shí)間、料液比、乙醇濃度、浸泡時(shí)間等因素對(duì)得率的影響。結(jié)果表明，酢漿草黃酮的最佳提取條件為微波小火處理2min、乙醇濃度30%、料液比1∶10（g/mL），在此條件下，黃酮得率為26.80mg/g。

微波提取法；酢漿草；黃酮；正交設(shè)計(jì)

酢漿草（Oxalis corniculata L.）亦稱大酸葉草、銅錘草、紫花酢漿草，是一類長(zhǎng)年生宿根性的闊葉草本植物。其繁殖力較強(qiáng)、生長(zhǎng)能力旺盛，在南方地區(qū)以野生雜草生長(zhǎng)[1]。其在中國(guó)古代醫(yī)書中有記載用于水瀉、痢疾、濕熱黃疸、瘧疾、咽喉腫痛等的治療[2]；現(xiàn)代藥理研究表明，酢漿草提取物具有抗菌、抗氧化、抗炎、抗腫瘤、護(hù)肝、促進(jìn)骨形成等作用[3-11]。成分分析表明酢漿草的活性成分主要包括多糖類、有機(jī)酸類、多酚類、黃酮類，其中黃酮類的藥理作用最為顯著[11-13]。目前文獻(xiàn)中對(duì)酢漿草黃酮類化合物提取方面的研究報(bào)道較少，主要集中于對(duì)酢漿草的雜草治理及酢漿草提取物的活性研究方面。

本文以酢漿草全草為材料，探討微波輔助乙醇提取總黃酮的最佳工藝，微波輔助提取具有高效、耗時(shí)短、操作簡(jiǎn)捷的優(yōu)點(diǎn)[14]，結(jié)合單因素試驗(yàn)和正交設(shè)計(jì)，對(duì)提取的關(guān)鍵條件進(jìn)行優(yōu)化，為酢漿草資源的深入開發(fā)利用提供一定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

酢漿草：2015年3月采摘自武漢工商學(xué)院草坪；95%乙醇（分析純）：天津市百世化工有限公司；蘆丁對(duì)照品（純度≥95%）：國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；亞硝酸鈉（分析純）：洛陽(yáng)市化學(xué)試劑廠；硝酸鋁（分析純）：天津市天力化學(xué)試劑有限公司；氫氧化鈉（分析純）：天津市風(fēng)船化學(xué)試劑科技有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

微波爐：佛山市順德區(qū)美的微波電器制造有限公司；722E型可見分光光度計(jì)：上海光譜儀器有限公司；SHB-Ш循環(huán)水式多用真空泵：鄭州長(zhǎng)城科工貿(mào)有限公司；DG120型四兩裝中藥材粉碎機(jī)：浙江省瑞安市春海藥材器械廠。

1.3 方法

1.3.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

精密稱取200mg蘆丁于100mL容量瓶，加70mL 95%乙醇，水溶微熱使其充分溶解，放冷，加95%乙醇定容至刻度，得0.2mg/mL蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液，4℃保存?zhèn)溆?。分別精密吸取標(biāo)準(zhǔn)溶液0、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0mL，置于7個(gè)25mL的容量瓶，各加水至6mL，加0.7mol/L氫氧化鈉溶液1mL，搖勻，靜置6min，加0.5 mol/L硝酸鋁溶液1mL，搖勻，靜置6 min，加入1.0mol/L氫氧化鈉溶液10mL，蒸餾水定容至25mL，靜置15min后，500 nm下測(cè)吸光度，以濃度C對(duì)吸光度A作標(biāo)準(zhǔn)曲線，得回歸方程A=10.71C-0.000 8，R2= 0.999 4，在0.008mg/mL～0.048mg/mL范圍內(nèi)，吸光度與濃度呈良好線性關(guān)系[14-15]。

1.3.2 微波輔助提取酢漿草黃酮的步驟

酢漿草全草洗凈，40℃烘干，粉碎，陰涼處保存?zhèn)溆谩＞_稱量2.00 g酢漿草粉末，加入一定量的一定濃度乙醇，微波小火（功率240W）處理一定時(shí)間，提取液4 000 r/min離心15min，上清減壓過濾，用于測(cè)定黃酮含量。

1.3.3 單因素試驗(yàn)

1.3.3.1 料液比

準(zhǔn)確稱取酢漿草2.00 g6份，加入一定量40%乙醇，料液比分別達(dá)到1∶10、1∶15、1∶20、1∶25、1∶30、1∶35（g/mL），微波小火處理2min，4 000 r/min離心15min，上清減壓過濾后，按1.3.4步驟測(cè)定黃酮得率。

1.3.3.2 乙醇濃度

準(zhǔn)確稱取酢漿草2.00 g6份，分別加入40mL20%、30%、40%、50%、60%、70%乙醇，微波小火處理2 min，4 000 r/min離心15min，上清減壓過濾后，按1.3.4步驟測(cè)定黃酮得率。

1.3.3.3 微波時(shí)間

準(zhǔn)確稱取酢漿草2 g6份，加入濃度為40%乙醇40 mL，分別微波小火處理1.25、1.50、1.75、2、2.25、2.5min，4 000 r/min離心15min，上清減壓過濾后，按1.3.4步驟測(cè)定黃酮得率。

1.3.3.4 浸泡時(shí)間

準(zhǔn)確稱取酢漿草2 g6份，加入40%乙醇40mL，分別室溫浸泡時(shí)間30、60、90、120、150、180min后，微波小火處理2min，4 000 r/min離心15min，上清減壓過濾后，按1.3.4步驟測(cè)定黃酮得率。

1.3.4 酢漿草黃酮得率的測(cè)定方法

精密吸取提取液1mL于25mL容量瓶中，另取標(biāo)準(zhǔn)曲線所用的空白組為對(duì)照品，用蒸餾水補(bǔ)至6mL，加入1.0 mL 0.7 mol/L亞硝酸鈉搖勻，靜置6 min后加入1.0mL 0.5mol/L硝酸鋁，6min后再加入10mL 1 mol/L氫氧化鈉，蒸餾水定容至刻度，混勻，靜置15 min后于500 nm測(cè)吸光度，按公式（1）計(jì)算黃酮得率。

式中：C為容量瓶中測(cè)量液的總黃酮濃度，mg/ mL；V1為測(cè)量液的定容體積，mL；V2為測(cè)量時(shí)量取的體積，mL；V3為提取液的體積，mL；m為樣品重量，g。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗(yàn)結(jié)果與分析

2.1.1 料液比對(duì)酢漿草黃酮得率的影響

料液比對(duì)酢漿草黃酮得率的影響見圖1。

圖1 料液比對(duì)酢漿草黃酮得率的影響Fig.1 Effectof thesolid liquid ratio on theyield of flavonoids from Oxaliscorniculata L.

由圖1可知，黃酮的得率隨著加入溶劑體積的增加而增加，當(dāng)料液比達(dá)到1∶15（g/mL）時(shí)，黃酮的得率最高。但超過1∶15（g/mL）后，黃酮得率反而有一定降低，分析可能是溶劑增加之后增加了一些其他類型雜質(zhì)的溶出，對(duì)黃酮類化合物的溶出產(chǎn)生競(jìng)爭(zhēng)抑制，因此選取料液比為1∶15（g/mL）。

2.1.2 乙醇濃度對(duì)酢漿草黃酮得率的影響

乙醇濃度對(duì)酢漿草黃酮得率的影響見圖2。

圖2 乙醇濃度對(duì)酢漿草黃酮得率的影響Fig.2 Effectof theethonal concentration on the yield of flavonoids from Oxalis corniculata L.

由圖2可知，隨著乙醇濃度的提高，黃酮的得率增大，乙醇濃度達(dá)到30%時(shí)，黃酮得率最佳，當(dāng)乙醇濃度高于30%之后反而呈下降趨勢(shì)，可能是因?yàn)橐掖紳舛忍岣咧竽承O性更小的物質(zhì)溶解增加，因此初步選定乙醇濃度為30%。

2.1.3 微波時(shí)間對(duì)酢漿草黃酮得率的影響

微波時(shí)間對(duì)酢漿草黃酮得率的影響見圖3。

圖3 微波時(shí)間對(duì)酢漿草黃酮得率的影響Fig.3 Effectofm icrowave-assisted extracting timeon the yield of flavonoids from Oxaliscorniculata L.

由圖3可知，黃酮得率隨著微波時(shí)間的延長(zhǎng)而增加，當(dāng)微波處理時(shí)間超過1.75min后，黃酮得率反而減小，可能微波時(shí)間過長(zhǎng)時(shí)，產(chǎn)熱過多，對(duì)黃酮類化合物有一定破壞。因此，初步擬定微波處理時(shí)間為1.75min。

2.1.4 浸泡時(shí)間對(duì)酢漿草黃酮得率的影響

浸泡時(shí)間對(duì)酢漿草黃酮得率的影響見圖4。

圖4 浸泡時(shí)間對(duì)酢漿草黃酮得率的影響Fig.4 Effectof soaking timeon the yield of flavonoids from Oxaliscorniculata L.

由圖4可知，浸泡時(shí)間達(dá)到120min時(shí)黃酮的得率最佳，但整體而言，浸泡時(shí)間對(duì)黃酮的得率影響不明顯，因此不選擇此因素進(jìn)行正交設(shè)計(jì)。

2.2 正交試驗(yàn)結(jié)果與分析

根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，選定乙醇濃度、微波時(shí)間和料液比3個(gè)影響較大的因素進(jìn)行正交設(shè)計(jì)，因素及相應(yīng)的水平選擇情況見表1，正交設(shè)計(jì)及試驗(yàn)結(jié)果見表2。

由表1、表2可知，極差分析表明，最佳提取條件A2B3C1為乙醇濃度30%，微波處理時(shí)間是2min，料液比1∶10（g/mL），各因素對(duì)黃酮的影響依次從大到小為：乙醇濃度>料液比>微波時(shí)間，說明在具體生產(chǎn)工藝確定中，乙醇濃度要嚴(yán)格控制。

表1 因素與水平表Table1 Factorsand levels

表2 正交設(shè)計(jì)及試驗(yàn)結(jié)果Table2 Resultsof orthogonaldesign

2.3 驗(yàn)證試驗(yàn)

在料液比1∶10（g/mL），乙醇濃度30%，微波小火2min的條件下進(jìn)行3次驗(yàn)證試驗(yàn)，見表3。

表3 驗(yàn)證試驗(yàn)結(jié)果Table3 Resultsof verification test

所得得率的平均值為26.80mg/g，RSD=5.54%，說明該工藝條件下試驗(yàn)重復(fù)性良好。

3 小結(jié)

經(jīng)過單因素試驗(yàn)和正交試驗(yàn)確定微波輔助提取酢漿草黃酮的最佳條件為乙醇濃度30%、料液比1∶10（g/mL）、微波處理時(shí)間2min，在此條件下，黃酮得率為26.80mg/g。酢漿草中極性物質(zhì)在微波場(chǎng)中易吸收能量轉(zhuǎn)化為熱能，使內(nèi)部溫度迅速升高，促進(jìn)細(xì)胞內(nèi)成分的釋放，可以大大縮短提取時(shí)間，提高提取效率[16]。此法設(shè)備要求不高，提取流程簡(jiǎn)單，耗費(fèi)時(shí)間較短，適用于酢漿草黃酮的提取分離，可為后期進(jìn)一步深入研究其有效活性成分、開發(fā)新的用途提供了研究基礎(chǔ)。

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Optim ization of M icrowave-assisted Extracting Process of Flavonoids from Oxalis corniculata L.

YANGWen-ting，AIXi，WEIQin
（Environmentaland Biological Engineering College，Wuhan Technology and BussinessUniversity，Wuhan 430065，Hubei，China）

To optimize themicrowave-assisted process of extracting flavonoids from Oxalis corniculata L.Extracting time，solid-liquid ratio，ethanol concentration and soaking timewere determinated by the single-factor experimentand orthogonaldesign，using the yield of total flavonoidsas index.Results showed that the optimum conditionswere extracting time 2min，ethanol concentration 30%，solid-liquid ratio 1∶10（g/mL）.Under these conditions，the yieldwas26.80mg/g.

microwave-assisted extraction；Oxaliscorniculata L.；flavonoids；orthogonaldesign

10.3969/j.issn.1005-6521.2016.24.012

2016-03-29

湖北省教育廳科學(xué)技術(shù)研究項(xiàng)目（B2016337）；武漢工商學(xué)院校級(jí)學(xué)術(shù)團(tuán)隊(duì)基金資助項(xiàng)目（XSTD2015003）

楊文婷（1983—），女（漢），講師，碩士研究生，主要從事天然產(chǎn)物的開發(fā)利用研究。