牟豪杰， 王 燕， 呂永平， 汪一婷， 李海營(yíng)

(浙江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院病毒學(xué)與生物技術(shù)研究所，浙江杭州 310021)

Note:Different lowercases in the same column stand for significant difference among different culture medium(P<0.05).

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生石花植株離體再生及組培快繁研究

牟豪杰， 王 燕， 呂永平， 汪一婷*， 李海營(yíng)

(浙江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院病毒學(xué)與生物技術(shù)研究所，浙江杭州 310021)

[目的]建立生石花植株離體再生及組培快繁體系。[方法]以生石花成熟種子為外植體，研究生石花組培快繁技術(shù)。[結(jié)果]萌發(fā)后的幼苗在MS+0.50 mg/L 6-BA+0.05 mg/L NAA培養(yǎng)基上被成功誘導(dǎo)出愈傷組織；不添加6-BA的MS培養(yǎng)基有利于愈傷組織的分化，不定芽誘導(dǎo)率為4.65；在MS +0.05 mg/L 6-BA+0.01 mg/L NAA培養(yǎng)基上不定芽增殖率較高，可達(dá)5.60。[結(jié)論]建立了生石花植株離體再生及快繁體系，有利于生石花種質(zhì)資源保護(hù)和工廠化生產(chǎn)。

生石花；愈傷組織；離體再生；增殖；生根

生石花(Lithopssp.)為番杏科生石花屬植物，原產(chǎn)于非洲南部、南非納米比亞等極度干旱少雨的沙漠礫石地帶。生石花變態(tài)葉肥厚，形如彩石，嬌小玲瓏，新穎奇特，享有“有生命的石頭”的美稱，成為眾多愛好者收集蒔養(yǎng)的觀賞多肉植物[1-3]。生石花繁殖主要采用播種和分株方式，但其種子細(xì)小，生長(zhǎng)速度緩慢，從萌發(fā)到開花至少需要3年；而分株方式繁殖率較低，實(shí)際生產(chǎn)栽培中使用較少[4-5]。此外，人類過度采掘和對(duì)其原產(chǎn)地生態(tài)環(huán)境的破壞導(dǎo)致生石花野生資源減少，這使其推廣和應(yīng)用受到很大限制。植物組織培養(yǎng)方法可以在短期內(nèi)使植物快速繁殖，并縮短植物生長(zhǎng)發(fā)育周期。目前對(duì)于生石花組織培養(yǎng)研究仍處于探索階段，對(duì)其植株離體再生及組培快繁的研究鮮見報(bào)道[6-7]。筆者對(duì)生石花組培快繁技術(shù)進(jìn)行研究，對(duì)于保存生石花種質(zhì)資源和實(shí)現(xiàn)其規(guī)?；a(chǎn)具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料 細(xì)紋生石花(Lithopsgracilidelineata)的自交種子由浙江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院組培中心溫室提供。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 外植體的消毒及接種。以生石花種子為外植體，將其置于2 mL PE離心管中進(jìn)行消毒處理，先用洗潔精浸泡0.5 h后再用自來水清洗，然后在70%乙醇和有效氯濃度為1% 的次氯酸鈉溶液中分別浸泡30 s和6 min，最后用無菌水沖洗3～5遍，每遍2 min (移液槍操作)。

將消毒處理后的種子在超凈工作臺(tái)中接種至MS基本培養(yǎng)基(MS+30 g/L蔗糖+7 g/L瓊脂，pH 5.8)上培養(yǎng),待種子萌發(fā)后形成幼苗。

1.2.2 愈傷組織的誘導(dǎo)。將生石花幼苗轉(zhuǎn)接至誘導(dǎo)培養(yǎng)基上進(jìn)行愈傷組織的誘導(dǎo)，誘導(dǎo)培養(yǎng)基：MS+30 g/L蔗糖+7 g/L瓊脂+6-BA 0.50 mg/L +NAA 0.05 mg/L，pH 5.8。

1.2.3 愈傷組織的分化。將誘導(dǎo)產(chǎn)生的愈傷組織接種至誘導(dǎo)培養(yǎng)基上進(jìn)行愈傷組織的增殖，將愈傷組織接種至分化培養(yǎng)基上進(jìn)行不定芽的分化。分化培養(yǎng)基： MS+30 g/L蔗糖+7 g/L瓊脂，添加不同濃度的6-BA(0、0.01、0.05、0.10 mg/L)，pH 5.8。每瓶接種4塊愈傷組織，每組5瓶，35 d后觀察愈傷組織的分化情況并統(tǒng)計(jì)不定芽的誘導(dǎo)率。培養(yǎng)條件：溫度(23±2) ℃，光照強(qiáng)度40 μmol/(m2·s)，光照時(shí)間10 h/d。

1.2.4 不定芽的增殖。將愈傷組織分化產(chǎn)生的不定芽接種至3種增殖培養(yǎng)基上進(jìn)行繼代增殖培養(yǎng)，增殖培養(yǎng)基：MS+30 g/L蔗糖+7 g/L瓊脂，添加不同濃度的6-BA和NAA，pH 5.8。每瓶接種4個(gè)，每組5瓶，35 d后觀察不定芽的誘導(dǎo)情況并統(tǒng)計(jì)增殖率。培養(yǎng)條件：溫度(23±2)℃,光照強(qiáng)度60 μmol/(m2·s)，光照時(shí)間12 h/d。

1.2.5 壯苗生根及移栽。將增殖不定芽叢分割成單株后轉(zhuǎn)接至壯苗生根培養(yǎng)基上培養(yǎng)。生根培養(yǎng)基：MS+30 g/L蔗糖+7 g/L瓊脂+0.10 mg/L NAA，pH 5.8。培養(yǎng)條件：溫度(23±2)℃，光照強(qiáng)度60 μmol/(m2·s)，光照時(shí)間12 h/d。

將生根植株從培養(yǎng)基中取出并清洗后，置于陰涼通風(fēng)處晾干2～5 d至表皮微皺，然后移栽至基質(zhì)中。

1.3 數(shù)據(jù)處理及分析 不定芽誘導(dǎo)率=愈傷組織分化產(chǎn)生的不定芽總數(shù)/接種的愈傷組織總塊數(shù)×100%。不定芽增殖率=增殖出的不定芽總數(shù)/接種的芽數(shù)×100%。

使用SPSS統(tǒng)計(jì)分析軟件包(SPSS Inc, Chicago, USA)對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行顯著性差異分析(LSD)。

2 結(jié)果與分析

2.1 6-BA濃度對(duì)愈傷組織分化的影響 接種14～28 d生石花種子陸續(xù)萌發(fā)，培養(yǎng)35～49 d成為幼苗(圖1 A)。幼苗轉(zhuǎn)接至誘導(dǎo)培養(yǎng)基上培養(yǎng)14～21 d形成黃綠色的愈傷組織(圖1 B)，培養(yǎng)28～35 d更換新鮮培養(yǎng)基進(jìn)行繼代增殖，然后挑取生長(zhǎng)狀態(tài)較好的愈傷組織置于分化培養(yǎng)基上進(jìn)行不定芽的誘導(dǎo)培養(yǎng)(圖1 C)。培養(yǎng)35 d后，愈傷組織的分化情況見表1。由表1可知，愈傷組織在基本培養(yǎng)基A上培養(yǎng)時(shí)，不定芽的誘導(dǎo)率為4.65；在6-BA濃度為0.01 mg/L的培養(yǎng)基B上培養(yǎng)時(shí)不定芽的誘導(dǎo)率為2.80；隨著培養(yǎng)基 C、D中6-BA濃度的升高，愈傷組織的分化率逐漸降低，生石花不定芽的誘導(dǎo)率降低。因此，6-BA的添加不利于生石花不定芽的誘導(dǎo)。

注：A. 生石花幼苗；B.愈傷組織的誘導(dǎo)；C.不定芽的分化；D.壯苗生根。Note: A. Young seedling; B. Callus induction; C. Differentiation of adventitious bud; D. Rooting culture.圖1 生石花組培再生體系的建立Fig.1 Plantlet regeneration in vitro of L. gracilidelineata

Table 1 The effects of 6-BA concentration on the callus differentiation ofL.gracilidelineata

培養(yǎng)基Culturemedium6-BA濃度6-BAconcen?trationmg/L愈傷接種數(shù)Inoculationnumber∥個(gè)分化芽數(shù)Differentiationbuds∥個(gè)誘導(dǎo)率InductionrateA020934．65±1．03aB0．0120562．80±0．54bC0．0520341．70±0．37cD0．1020110．55±0．41d

注：同列不同小寫字母表示不同培養(yǎng)基間差異顯著(P<0.05)。

Note:Different lowercases in the same column stand for significant difference among different culture medium(P<0.05).

2.2 不同培養(yǎng)基對(duì)不定芽增殖的影響 將在培養(yǎng)基A中分化出的不定芽叢分割成單株后轉(zhuǎn)接至3種增殖培養(yǎng)基上培養(yǎng)，35 d后生石花不定芽的誘導(dǎo)情況見表2。由表2可知，不定芽在培養(yǎng)基E上的增殖率為3.85，在培養(yǎng)基F上的增殖率為5.60，且芽體生長(zhǎng)健壯，而在培養(yǎng)基G中的增殖率僅為2.65，且部分增殖不定芽出現(xiàn)玻璃化現(xiàn)象。由此可知，培養(yǎng)基F是適合生石花增殖的培養(yǎng)基。

2.3 移栽成活率 將生石花的增殖不定芽叢分割成單株后轉(zhuǎn)接至壯苗生根培養(yǎng)基上培養(yǎng)，35～56 d可獲得健壯的生石花有根種苗，將生根植株從培養(yǎng)基中取出并清洗后，置于陰涼通風(fēng)處晾干2～5 d至表面微皺，然后移栽至基質(zhì)中進(jìn)行栽培，移栽成活率可達(dá)90%以上(圖1D)。

表2 不同培養(yǎng)基對(duì)生石花不定芽增殖的影響

注：同列不同小寫字母表示不同培養(yǎng)基間差異顯著(P<0.05)。

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3 結(jié)論與討論

該研究通過愈傷組織間接再生途徑獲得了生石花的再生植株，并建立了生石花的快繁體系。結(jié)果顯示，6-BA的添加不利于生石花愈傷組織的分化，而MS+0.05 mg/L 6-BA+0.01 mg/L NAA是適合生石花增殖的最佳培養(yǎng)基，不定芽增殖率可達(dá)5.60,且植株生長(zhǎng)健壯。將生石花的增殖不定芽叢分割成單株后轉(zhuǎn)接至壯苗生根培養(yǎng)基上培養(yǎng)，35～56 d可獲得健壯的生石花有根種苗，將生根植株從培養(yǎng)基中取出并清洗后，置于陰涼通風(fēng)處晾干2～5 d至表皮微皺，然后移栽至基質(zhì)中進(jìn)行栽培，移栽成活率可達(dá)90%以上。

目前，研究者對(duì)生石花屬植物的組織培養(yǎng)研究?jī)H停留在獲得無菌材料的水平，尚無建立生石花組培快繁體系的成功報(bào)道[6-7]。該研究建立了生石花植株的離體再生及快繁體系，對(duì)促進(jìn)生石花種質(zhì)資源保護(hù)和工廠化生產(chǎn)具有重要意義。參考文獻(xiàn)

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Plantlet Regenerationinvitroand Rapid Propagation ofLithopssp.

MOU Hao-jie, WANG Yan, LU Yong-ping, WANG Yi-ting*et al

(Institute of Virology and Biotechnology, Zhejiang Academy of Agricultural Sciences, Hangzhou, Zhejiang 310021)

[Objective] The aim was to establish plantlet regenerationinvitroand rapid propagation ofLithopssp. [Method] With mature seeds as explant, rapid propagation technique ofLithopssp. was studied. [Result] Calli were induced from the young seedling on MS medium+0.50 mg/L 6-BA+ 0.05 mg/L NAA in this study. The results showed that the basic MS medium without 6-BA benefited the callus differentiation ofLithopssp., and the induction ratio of adventitious bud was 4.65; MS+0.05 mg/L 6-BA+0.01 mg/L NAA was the optimal medium for the multiplication of adventitious bud, and the multiplication ratio was 5.60. [Conclusion] The plantlet regeneration and rapid propagation system ofLithopssp. were established, which has important guiding significance for the germplasm protection and industrial production ofLithopssp..

Lithopssp.;Callus; Regenerationinvitro; Proliferation; Rooting

引進(jìn)國(guó)際先進(jìn)農(nóng)業(yè)科學(xué)技術(shù)計(jì)劃(948)項(xiàng)目(2011-G31)；浙江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院青年人才培養(yǎng)項(xiàng)目(2015R21R08E08)。

牟豪杰(1977- )，男，浙江杭州人，助理研究員，從事植物組培產(chǎn)業(yè)化研究。*通訊作者，副研究員，碩士，從事生物技術(shù)方面的研究。

2016-10-12

S 604

A

0517-6611(2016)33-0143-02