楊 樂，黃 林，金素鈺，雷杰雯，鄭玉才

(西南民族大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，四川 成都 610041)

牦牛和犏牛睪丸SAMD12基因的克隆測序及其mRNA水平比較

楊 樂，黃 林，金素鈺，雷杰雯，鄭玉才

(西南民族大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，四川 成都 610041)

SAMD12是新近發(fā)現(xiàn)的SAM結(jié)構(gòu)域家族成員.為進(jìn)一步探究犏牛雄性不育的分子機(jī)制，實(shí)驗(yàn)從健康成年牦牛(n＝10)和雄性不育犏牛(n＝7)睪丸組織中提取總RNA，利用常規(guī)基因克隆技術(shù)，對(duì)牦牛SAMD12基因進(jìn)行克隆測序，并采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)，比較牦牛和犏牛睪丸中SAMD12基因mRNA水平.結(jié)果本實(shí)驗(yàn)克隆獲得了牦牛SAMD12基因的3種變異體，分別命名為v715、v779和v852.v715與普通牛5號(hào)變異體完全對(duì)應(yīng)；v779含SAM結(jié)構(gòu)域但與普通牛序列存在一些差異，可能是SAMD12基因的新變異體類型；v852無結(jié)構(gòu)域部分可能不表現(xiàn)活性.定量PCR結(jié)果顯示:SAMD12基因在牦牛和犏牛睪丸中均有表達(dá)，但表達(dá)量差異不顯著，推測其表達(dá)水平與犏牛雄性不育無直接關(guān)系.

牦牛；犏牛；睪丸；SAMD12基因；雜交雄性不育

犏牛是母牦牛(Bos grunniens)與普通牛(Bos taurus)的雜交后代，其體型、產(chǎn)肉和產(chǎn)乳等生產(chǎn)性能均顯著高于牦牛，但F1～F3代為雄性不育，無法產(chǎn)生正常的精子[1]，影響了雜種優(yōu)勢的利用.犏牛雄性不育的分子機(jī)制尚不清楚，已有研究推測可能涉及多種基因的異常表達(dá)[2-4].本實(shí)驗(yàn)室前期研究也發(fā)現(xiàn)，多種功能各異的基因或蛋白質(zhì)，在牦牛和犏牛睪丸中表達(dá)存在顯著差異，包括雜交不育基因PRDM9[5]、多種蛋白質(zhì)[6]、Msh4基因和FABP5基因等[7-8].

SAM是一類新發(fā)現(xiàn)的結(jié)構(gòu)域，為包含70個(gè)氨基酸殘基的結(jié)構(gòu)模體，存在于很多蛋白質(zhì)中，在物種進(jìn)化中具有高度保守性[9-11].該結(jié)構(gòu)域包含磷酸化位點(diǎn)和磷酸激酶位點(diǎn)，能與蛋白質(zhì)、RNA以及膜脂質(zhì)相互作用，并作用于蛋白質(zhì)同源化、異二聚化和寡聚化等信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的調(diào)控[12-15].根據(jù)目前已報(bào)導(dǎo)的相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)，該結(jié)構(gòu)域家族中的基因在表達(dá)調(diào)控、細(xì)胞分化、胚胎的發(fā)育、分化及成熟等方面發(fā)揮著相當(dāng)重要的作用[16-18].SAMD12是SAM基因家族成員，普通牛中位于14號(hào)染色體上[19]，包含9個(gè)外顯子，目前其具體特性及功能方面的研究還未見報(bào)道.

本實(shí)驗(yàn)室前期對(duì)牦牛和雄性不育犏牛睪丸差異表達(dá)的miRNA分析發(fā)現(xiàn)，SAMD12是差異表達(dá)最大的一種miRNA的預(yù)測靶基因(李彩霞等，2016，待發(fā)表資料)[20].因此，本研究的假設(shè)是SAMD12基因在牦牛精子發(fā)生過程中發(fā)揮重要作用.實(shí)驗(yàn)通過常規(guī)基因克隆技術(shù)對(duì)牦牛SAMD12基因進(jìn)行克隆測序，并用熒光定量PCR方法，對(duì)牦牛和雄性不育犏牛睪丸中SAMD12基因的相對(duì)表達(dá)量進(jìn)行比較，以探索其與犏牛雄性不育的關(guān)聯(lián).

1 材料與方法

1.1 樣品的采集

在成都市青白江區(qū)某屠宰場采集麥洼牦牛(Bos grunniens)和犏牛(母麥洼牦牛與公黃牛的雜交后代)的睪丸組織.10頭健康的成年公牦牛和7頭公犏牛屠宰后立即取其睪丸，縱切面剖開后迅速置于干冰中運(yùn)回實(shí)驗(yàn)室，置于-80℃冰箱保存?zhèn)溆?

1.2 主要試劑和儀器

Trizol Reagent，由美國Ambion公司生產(chǎn)；RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit，由美國Thermo Scientific公司生產(chǎn)；QuantiFast SYBR Green PCR Kit，由德國QIAGEN公司生產(chǎn)；Long Taq DNA Polymerase，由美國GeneCopoeia公司生產(chǎn)；DL2000 Marker、DH5α感受態(tài)細(xì)胞由天根生化科技(北京)有限公司生產(chǎn).

CFX 96熒光定量PCR儀和Versa Doc 1000凝膠成像系統(tǒng)，由美國Bio-Rad公司生產(chǎn)；Biowave DNA紫外可見分光光度計(jì)，由英國Biochrom公司生產(chǎn)；CR21G高速冷凍離心機(jī)，由日本日立公司生產(chǎn).

1.3 睪丸總RNA的提取及反轉(zhuǎn)錄

按照Trizol試劑說明提取牦牛和犏牛睪丸總RNA，并用紫外分光光度計(jì)測定其濃度和純度.用RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit以4 μg總RNA為模板，進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，得到cDNA第一鏈，具體操作方法參照試劑盒說明書.

1.4 牦牛睪丸SAMD12基因的克隆測序

參照GenBank中的普通牛SAMD12基因預(yù)測序列(登錄號(hào):XM_015474468)，用Premier 5.0軟件設(shè)計(jì)PCR引物.上游引物:5'-TGGAGAGCTGGGTGATGCTGAG-3'，下游引物:5'-GGACAGCAGCTTGGAAGGCTAAC-3'，預(yù)期產(chǎn)物長度715 bp.

以反轉(zhuǎn)錄得到的牦牛睪丸cDNA為模板，用PCR對(duì)SAMD12基因進(jìn)行擴(kuò)增，PCR反應(yīng)體系:2×Long Taq DNA Polymerase 12.5 μL、上下游引物各1 μL、模板cDNA 1.5 μL，加滅菌純水至總體積25 μL.擴(kuò)增條件:95℃預(yù)變性4 min，95℃變性30 s，59℃退火30 s，72℃延伸1min，共35個(gè)循環(huán)；72℃5 min，4℃保存.擴(kuò)增產(chǎn)物用1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測.用Cycle-Pure Kit(100)試劑盒進(jìn)行純化回收，然后將純化回收的產(chǎn)物連接到pMD-19載體上，再轉(zhuǎn)入DH5α感受態(tài)細(xì)胞中，通過藍(lán)、白斑篩選和菌液PCR方法鑒定陽性克隆.將篩選的對(duì)應(yīng)不同擴(kuò)增長度的陽性克隆各取3管菌液，送上海生工生物工程有限公司進(jìn)行雙向測序.用DNAMAN 4.0、SMART、ProtParam等軟件，分別對(duì)其堿基序列和氨基酸序列進(jìn)行分析.

1.5 睪丸中SAMD12基因的定量PCR分析

參考本研究獲得的牦牛睪丸SAMD12基因序列以及GenBank中普通牛SAMD12基因的mRNA序列(登錄號(hào):NM_001191180)設(shè)計(jì)定量PCR引物，上游引:5'-ACCCTGCCCATGGTGAAGGTA-3'，下游引物:5'-AGCAGGGCTCGCCCAGTTATA-3'，預(yù)期產(chǎn)物長度286 bp.兩個(gè)內(nèi)參基因?yàn)?8sRNA和GAPDH，相關(guān)信息見本實(shí)驗(yàn)室前期發(fā)表的文章[11].將反轉(zhuǎn)錄獲得的牦牛睪丸cDNA進(jìn)行常規(guī)PCR擴(kuò)增，并優(yōu)化退火溫度，產(chǎn)物用1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測，將最亮條帶對(duì)應(yīng)的PCR產(chǎn)物進(jìn)行10倍梯度稀釋，然后以稀釋后梯度濃度為104～109拷貝數(shù)/mL的產(chǎn)物為模板，進(jìn)行熒光定量PCR擴(kuò)增，制作標(biāo)準(zhǔn)曲線.

以反轉(zhuǎn)錄得到的牦牛(n＝10)和犏牛(n＝7)睪丸cDNA為模板，采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法檢測SAMD12基因在其中的相對(duì)表達(dá)量.25 μL反應(yīng)體系:RNase-free water 9.5 μL，模板cDNA 1 μL，2×Quanti-Fast SYBR Green PCR Master Mix 12.5 μL，基因的上、下游引物各1 μL.擴(kuò)增條件:95℃預(yù)變性5 min，95℃變性15 s，退火(SAMD12:62℃20s；18sRNA:60℃15 s；GAPDH:60℃20 s)，72℃延伸15 s，共40個(gè)循環(huán)，65℃ˉ95℃制作融解曲線.每個(gè)樣品做兩個(gè)重復(fù).

1.6 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)

通過2-△△Ct法計(jì)算SAMD12基因在牦牛和犏牛睪丸組織中的相對(duì)表達(dá)量[21]，以其在牦牛睪丸中的表達(dá)量為對(duì)照，用內(nèi)參基因18sRNA和GAPDH的幾何平均數(shù)進(jìn)行校準(zhǔn).實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)用平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤表示，用SPSS19.0進(jìn)行定量結(jié)果的統(tǒng)計(jì)分析.

2 結(jié)果

2.1 牦牛SAMD12基因的克隆測序

根據(jù)GenBank中普通牛SAMD12基因的預(yù)測序列設(shè)計(jì)的PCR引物，從牦牛睪丸總RNA中擴(kuò)增出了特異條帶(圖1，泳道1)，經(jīng)常規(guī)克隆后得到3種長度不同的條帶或稱變異體(圖1，泳道2～4).3種變異體分別進(jìn)行測序并與GenBank數(shù)據(jù)庫比對(duì)，結(jié)果與普通牛SAMD12基因的匹配度均達(dá)到99%以上，證實(shí)其均為牦牛SAMD12基因.3種變異體與普通牛SAMD12基因最長的預(yù)測變異體(GenBank登錄號(hào): XM_015474468)CDS編碼區(qū)匹配的序列相比，均存在3個(gè)堿基差異(以普通牛為參照，普通牛CDS編碼區(qū)的第402位為A，3頭牦牛均為G；第450位，普通牛為C，3頭牦牛均為T；第516位，普通牛為T，3頭牦牛均為C).3條剪接體序列現(xiàn)已提交至GenBank(登錄號(hào):KX821660；KX821661；KX821662).

圖1 牦牛SAMD12基因RT-PCR產(chǎn)物及克隆產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳M:DL2000 Marker，1:RT-PCR產(chǎn)物；2～4:克隆出的牦牛SAMD12基因的3種變異體Fig.1 Agarose gel electrophoresis of RT-PCR and cloning products SAMD12 gene of yak M:DL2000 marker，1:RT-PCR products，2～4；Cloning 3 variants of yak SAMD12 gene

測出的牦牛SAMD12基因1號(hào)變異體(v715)序列全長715 bp，編碼228個(gè)氨基酸，理論分子量為25.47 ku，預(yù)測等電點(diǎn)為6.25，與普通牛的5號(hào)變異體(登錄號(hào):XM_015474469)完全對(duì)應(yīng)；牦牛2號(hào)變異體(v779)長779 bp，編碼259個(gè)氨基酸，理論分子量為29.13 ku，預(yù)測等電點(diǎn)為6.60，除前半部分與普通牛共有氨基酸序列完全相同之外，后面還有38個(gè)氨基酸與普通牛的各預(yù)測序列均不匹配；牦牛3號(hào)變異體(v852)長852 bp，僅編碼132個(gè)氨基酸，理論分子量為14.42 ku，預(yù)測等電點(diǎn)為5.04.

NCBI中普通牛SAMD12基因的變異體預(yù)測序列共有7種，用SMART軟件對(duì)各變異體進(jìn)行分析后得知，其編碼的前221個(gè)氨基酸序列均相同，且均包含SAM結(jié)構(gòu)域序列.測出的牦牛v715、v779變異體與普通牛的各變異體相同部分的氨基酸序列均完全對(duì)應(yīng)，也都包含SAM結(jié)構(gòu)域，牦牛v852變異體無SAM結(jié)構(gòu)域序列.牦牛SAMD12基因的3種變異體與普通牛最長的變異體2號(hào)以及普通牛5號(hào)變異體氨基酸序列比對(duì)情況如圖2所示，普通牛氨基酸序列的第141位～第210位為SAM結(jié)構(gòu)域序列，圖2中已標(biāo)出.

2.2 牦牛睪丸SAMD12基因的RT-PCR擴(kuò)增結(jié)果

根據(jù)本研究獲得的牦牛睪丸SAMD12基因序列以及GenBank中普通牛SAMD12基因的mRNA序列設(shè)計(jì)的定量PCR引物，從牦牛睪丸cDNA中擴(kuò)增出特異性高的產(chǎn)物，條帶較亮、無雜帶，且與預(yù)期片段長度相符(圖3).SAMD12基因在退火溫度為62℃時(shí)的PCR產(chǎn)物條帶最亮，可作為定量PCR的退火溫度.

圖2 牦牛SAMD12基因的3種變異體與普通牛2號(hào)、5號(hào)變異體氨基酸序列比對(duì)圖Fig.2 Alignment of partialdeduced amino acid sequences of 3 variants of SAMD12 gene of yak with those of variant 2 and variant 3 of cattle

圖3 牦牛SAMD12基因RT-PCR產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳M:DL2000 Marker，1～3的退火溫度分別為62℃、64℃和66℃Fig.3 Agarose gel electrophoresis of RT-PCR products SAMD12 gene of yak M:DL2000 Marker，The annealing temperature of 1～3 is 62℃，64℃and 66℃

以18sRNA和GAPDH為內(nèi)參基因，對(duì)牦牛和犏牛睪丸中的SAMD12基因mRNA水平進(jìn)行熒光定量PCR檢測，其擴(kuò)增效率為93.7%，符合Bio-Rad熒光定量PCR儀有效擴(kuò)增效率為92%～105%的要求.標(biāo)準(zhǔn)曲線線性關(guān)系良好(R2＞0.99)，融解曲線峰單一，表明對(duì)SAMD12基因進(jìn)行了特異性擴(kuò)增.兩個(gè)內(nèi)參基因的融解曲線及SAMD12基因的標(biāo)準(zhǔn)曲線和融解曲線見圖4.

圖4 SAMD12基因及內(nèi)參基因定量PCR的標(biāo)準(zhǔn)曲線/融解曲線A1、A2:內(nèi)參基因定量的融解曲線；B1、B2:SAMD12基因的標(biāo)準(zhǔn)曲線和融解曲線Fig.4 Standard curve/melting curve of quantitative PCR of SAMD12 gene and reference genes A1、A2:The melting curve of reference genes for quantitative；B1、B2:The standard curve and melting curve of SAMD12 gene

2.3 SAMD12基因在牦牛和犏牛睪丸組織中的表達(dá)

定量PCR結(jié)果顯示，SAMD12基因在成年牦牛(n＝10)和成年不育犏牛(n＝7)睪丸中均有表達(dá)，但mRNA水平差異不顯著(圖5).

圖5 牦牛和犏牛睪丸中SAMD12基因mRNA水平Fig.5 mRNA levels of SAMD12 gene in the testes of yaks and cattle-yaks

3 討論

SAM結(jié)構(gòu)域存在于很多蛋白質(zhì)中，并且在物種進(jìn)化中具有高度保守性，已發(fā)現(xiàn)的該結(jié)構(gòu)域家族中的基因在表達(dá)調(diào)控、細(xì)胞分化、胚胎的發(fā)育、分化及成熟等方面發(fā)揮著重要的作用.本研究根據(jù)普通牛SAMD12基因的序列設(shè)計(jì)引物，通過常規(guī)基因克隆技術(shù)，成功地從牦牛睪丸中克隆出了SAMD12基因的3種變異體，其中變異體v715對(duì)應(yīng)普通牛2號(hào)預(yù)測變異體，且對(duì)應(yīng)部分氨基酸序列完全相同，體現(xiàn)了SAMD12基因在普通牛和牦牛上的高度保守性.對(duì)SAMD12結(jié)構(gòu)域的分析表明，SAMD12可能主要通過該結(jié)構(gòu)域發(fā)揮其基本的功能和作用[12-18]，對(duì)已公布的普通牛SAMD12基因的7種預(yù)測變異體以及測出的牦牛3種變異體進(jìn)行分析后，結(jié)果發(fā)現(xiàn)普通牛的7種變異體以及牦牛變異體v715和變異體v779均保留了SAM模體部分，而且結(jié)構(gòu)域起始位置及氨基酸序列完全一致，顯示了SAM結(jié)構(gòu)域在物種進(jìn)化中高度的保守性；變異體v779經(jīng)過比對(duì)顯示，其可能是在牛上未發(fā)現(xiàn)的SAMD12基因的一種新的變異體形式；牦牛變異體v852由于編碼蛋白序列較短而且未保留SAM結(jié)構(gòu)域部分，推測其可能無活性.目前對(duì)SAMD12基因的研究甚少，對(duì)其復(fù)雜的剪接變異機(jī)制也尚未可知，新變異體的發(fā)現(xiàn)以及各變異體在牦牛中的表達(dá)情況還有待后續(xù)研究.

已有報(bào)道[2，7]及本實(shí)驗(yàn)室前期在對(duì)犏牛雄性不育機(jī)制的研究中發(fā)現(xiàn)，多種功能各異的基因或蛋白質(zhì)，其中大部分在牦牛和雄性不育犏牛睪丸中的表達(dá)都存在顯著甚至極顯著差異.本次實(shí)驗(yàn)的熒光定量PCR結(jié)果顯示，SAMD12基因在牦牛和雄性不育犏牛睪丸中表達(dá)量差異并不顯著，推測其可能不是導(dǎo)致犏牛雄性不育的關(guān)鍵調(diào)控因素.

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(責(zé)任編輯:李建忠，付強(qiáng)，張陽，羅敏；英文編輯:周序林，鄭玉才)

Cloning and comparison of mRNA level of SAMD12 gene in the testes of yaks and cattle-yaks

YANG Le，HUANG Lin，JIN Su-yu，LEI Jie-wen，ZHENG Yu-cai
(School of Life Science and Technology，Southwest University for Nationalities，Chengdu 610041，P.R.C.)

SAMD12 is a member of the newly discovered SAM motif family.To explore the molecular mechanism of male sterility of cattle-yaks，total RNAs were extracted from the testes of healthy adult yaks(n＝10)and sterile cattle-yaks(n＝7)，and SAMD12 gene was cloned and sequenced using routine gene cloning technique.The mRNA level of SAMD12 gene in the testes of yaks and cattle-yaks was assayed based on real-time quantative PCR.This study obtained 3 variants of yak SAMD12 gene，and named as v715，v779 and v852 respectively.v715 has the same sequence as bovine SAMD12 variant 5；v779 contains the SAM motif but shows some differences when compared with variants of bovine SAMD12 gene，thus it is probably a new variant not reported in cattle；v852 does not have SAM motif and mostly shows no activity.Quantative PCR assay showed that SAMD12 gene was expressed in both yak and cattle-yak testes，however，the expression level was similar，suggesting that its abundance has no direct relationship with the male sterility of cattle-yaks.

yak；cattle-yak；testis；SAMD12；hybrid male sterility

S813；S823

A

2095-4271(2016)05-0525-06

10.11920/xnmdzk.2016.05.010

2016-07-19

鄭玉才(1965—)，男，漢族，教授，博士，研究方向:高原動(dòng)物生化與分子遺傳.E-mail:yucaizheng65＠hotmail.com

國家自然科學(xué)基金資助課題(31240053)