王 蕾，劉思洋，孫寧陽(yáng)，李佳川，顧 健

(西南民族大學(xué)藥學(xué)院，四川 成都 610041)

藏藥波棱瓜子有效成分波棱素對(duì)ConA誘導(dǎo)的免疫性肝損傷的保護(hù)作用

王 蕾，劉思洋，孫寧陽(yáng)，李佳川，顧 健

(西南民族大學(xué)藥學(xué)院，四川 成都 610041)

目的通過(guò)建立ConA誘導(dǎo)的免疫性肝損傷動(dòng)物模型，研究波棱瓜子有效成分波棱素對(duì)免疫性肝損傷的保護(hù)作用.方法一次性動(dòng)物尾靜脈注射刀豆球蛋白(20mg/kg)建立小鼠免疫性肝損傷模型，考察不同劑量的波棱素對(duì)小鼠血清谷丙轉(zhuǎn)氨酶(ALT)、谷草轉(zhuǎn)氨酶(AST)、乳酸脫氫酶(LDH)，以及肝組織丙二醛(MDA)、超氧化物歧化酶(SOD)和谷胱甘肽過(guò)氧化物酶(GSH-Px)含量(或活性)的影響.結(jié)果小鼠尾靜脈注射ConA后，模型組小鼠血清AST、ALT等活性明顯升高，說(shuō)明ConA誘導(dǎo)的損傷模型造模成功.給予波棱素藥物后，與模型組相比較，波棱素能明顯降低小鼠ALT、AST和LDH活性，降低小鼠肝組織MDA的含量；升高肝組織SOD和GSH-Px的活性.結(jié)論波棱素能明顯減輕ConA誘導(dǎo)的小鼠肝組織損傷，改善其炎癥反應(yīng)，保護(hù)肝臟組織.

波棱瓜子；波棱素；免疫性肝損傷

藏藥波棱瓜子是葫蘆科攀援草本植物波棱瓜(Herpetosperalga pedunculosum Wall.)的種子，主要用于對(duì)肝病肝炎的防護(hù)和輔助醫(yī)治肝組織疾病[1].已有前期實(shí)驗(yàn)表明藏藥波棱瓜子總木脂素是波棱瓜子的有效部位[6-8]，而波棱素是其重要的有效單體成分之一[9-13].本研究擬通過(guò)ConA誘導(dǎo)建立小鼠免疫性肝損傷模型，探討波棱瓜子有效成分波棱素對(duì)免疫性肝損傷的保護(hù)作用.

1 材料與方法

1.1 藥物與試劑

波棱素:波棱瓜種子以80%乙醇回流，依次用石油醚、乙酸乙酯萃取，取乙酸乙酯部位依次經(jīng)過(guò)硅膠色譜梯度和等度洗脫進(jìn)行分離，高效液相進(jìn)行物質(zhì)純化得波棱素，經(jīng)HPLC含量測(cè)定其純度＞95%.刀豆蛋白A(ConA)購(gòu)自Sigma公司；清開(kāi)靈注射液(批號(hào): 14223163)購(gòu)自神威藥業(yè)；ALT(批號(hào):2015020)、AST (批號(hào):2015009)購(gòu)自長(zhǎng)春匯力生物技術(shù)有限公司；LDH(批號(hào):YZB/京0798-2010)自中生北控生物科技有限公司；MDA(批號(hào):20151011)、SOD(批號(hào): 20151010)和GSH-Px(批號(hào):20151011)購(gòu)自南京建成生物工程有限公司.

1.2 儀器

722 N型可見(jiàn)分光光度計(jì)，上海萊帕德科學(xué)儀器有限公司生產(chǎn)；PHY-Ⅲ型病理組織漂烘儀，常州市中威醫(yī)療儀器有限公司生產(chǎn).

1.3 動(dòng)物

ICR雄性小鼠(體質(zhì)量20±2g)，動(dòng)物合格證號(hào): 0014485，動(dòng)物許可證號(hào):SCXK[川]2013-24，購(gòu)于成都達(dá)碩實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究中心.

1.4 方法

ICR雄性小鼠，按體量分層隨機(jī)分成5組，即空白組、模型組、清開(kāi)靈注射液組(20mg/kg)和波棱素組(10、20mg/kg)，每組8只.每天按設(shè)計(jì)劑量給予相應(yīng)藥物，連續(xù)7d.于末次給藥后1h，除空白組以外，其余各組動(dòng)物經(jīng)尾靜脈注射ConA(20mg/kg)建立小鼠免疫性肝損傷模型.檢測(cè)指標(biāo)如下:

(1)肝臟系數(shù)

稱取小鼠體質(zhì)量，記錄數(shù)據(jù).待小鼠取血后立即脫頸處死，稱取小鼠肝臟質(zhì)量，計(jì)算肝臟系數(shù).肝臟系數(shù)(%)＝(肝臟質(zhì)量/小鼠體質(zhì)量)×100%

(2)血清ALT、AST和LDH的測(cè)定

小鼠尾靜脈注射ConA后(期間禁食不禁水10h)，眼眶取血，3000rpm/min離心10min，分離血清，凍存?zhèn)溆?按試劑盒說(shuō)明書分別檢測(cè)小鼠血清AST、ALT(賴氏法)以及LDH(速率法)的含量.

(3)肝組織MDA、SOD和GSH-Px的測(cè)定

待小鼠處死后，每只小鼠取肝臟同一部位組織制備10%肝臟勻漿.按試劑盒說(shuō)明書分別檢測(cè)小鼠肝組織MDA、SOD和GSH-Px的活性.

1.5 數(shù)據(jù)分析

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1 對(duì)肝臟系數(shù)的影響

由表1可知，與空白組比較，模型組小鼠的肝臟系數(shù)明顯增大；與模型組比較，波棱素高、低劑量組和清開(kāi)靈注射液組能明顯降低小鼠的肝臟系數(shù)，減少肝臟水腫.

表1 波棱素對(duì)ConA致免疫性肝損傷小鼠肝臟系數(shù)的影響(，n＝8)Table 1 Effects of Herpetin on the liver coefficients of immunologic liver injury mice induced by ConA(，n＝8)

表1 波棱素對(duì)ConA致免疫性肝損傷小鼠肝臟系數(shù)的影響(，n＝8)Table 1 Effects of Herpetin on the liver coefficients of immunologic liver injury mice induced by ConA(，n＝8)

與模型組比較，?p＜0.05，??p＜0.01.

組別劑量/mg·kgˉ1動(dòng)物數(shù)/只肝臟系數(shù)%空白-83.97±5.37??模型-85.54±4.84清開(kāi)靈注射液2084.35±5.62??波棱素1084.57±5.37??2084.36±5.38??

2.2 對(duì)血清相關(guān)生化酶活性的影響

由表2可知，與空白組比較，模型組小鼠血清中LDH、AST和ALT的含量明顯升高，表明小鼠肝功能受到損傷，造模成功；與模型組比較，波棱素高、低劑量組和清開(kāi)靈注射液組均能明顯降低肝損傷小鼠LDH、AST和ALT的含量，減少炎癥的發(fā)生.

表2 波棱素對(duì)ConA致免疫性肝損傷小鼠血清ALT、AST和LDH活力的影響(，n＝8)Table 2 Effects of Herpetin on the levels of serum ALT，AST and LDH of immunologic liver injury mice induced by ConA(，n＝8)

表2 波棱素對(duì)ConA致免疫性肝損傷小鼠血清ALT、AST和LDH活力的影響(，n＝8)Table 2 Effects of Herpetin on the levels of serum ALT，AST and LDH of immunologic liver injury mice induced by ConA(，n＝8)

與模型組比較，?p＜0.05，??p＜0.01.

2.3 對(duì)肝組織中相關(guān)生化酶活性的影響

由表3可知，與空白組比較，模型組小鼠肝組織勻漿中MDA活性明顯上升，SOD、GSH-Px活性明顯減少；與模型組比較，波棱素高、低劑量組和清開(kāi)靈注射液組均能明顯降低小鼠肝組織中MDA的活性，升高SOD和GSH-Px的活性.提示波棱素具有一定的清除自由基，保護(hù)肝細(xì)胞膜，提高抗氧化的能力.

表3 波棱素對(duì)小鼠ConA致免疫性損傷肝勻漿中MDA、SOD和GSH-Px水平的影響(，n＝8)Table 3 Effects of Herpetin on the levels of MDA，SOD and GSH-Px levels in liver homogenate of immunologic liver injury mice induced by ConA(，n＝8)

表3 波棱素對(duì)小鼠ConA致免疫性損傷肝勻漿中MDA、SOD和GSH-Px水平的影響(，n＝8)Table 3 Effects of Herpetin on the levels of MDA，SOD and GSH-Px levels in liver homogenate of immunologic liver injury mice induced by ConA(，n＝8)

與模型組比較，?p＜0.05，??p＜0.01.

3 討論

肝損傷是各種肝臟疾病發(fā)生發(fā)展的重要病理過(guò)程，肝損傷的發(fā)生機(jī)制一般分為化學(xué)性和免疫性兩種方式.免疫性肝損傷主要為免疫變態(tài)反應(yīng)，是抗原或半抗原刺激后機(jī)體產(chǎn)生的體液性或細(xì)胞性異常的一種免疫反應(yīng)，能使組織損害或產(chǎn)生機(jī)能障礙[14].1992年Tiegs[2]等以ConA誘導(dǎo)的特異性肝損傷是目前運(yùn)用較廣的免疫性肝損傷模型之一.ConA是一種能誘導(dǎo)特異性肝損傷的T細(xì)胞絲裂原，給予ConA后，巨噬細(xì)胞和T淋巴細(xì)胞被激活，并分泌TNF-α和INF-γ等相關(guān)細(xì)胞因子損傷肝細(xì)胞或激活一系列損傷肝細(xì)胞的反應(yīng).ConA誘導(dǎo)的免疫性肝損傷與人類免疫性肝炎的發(fā)病原因與致病機(jī)理具有相似性[3-5].

大量實(shí)驗(yàn)表明，當(dāng)肝組織受到損害時(shí)，胞漿中AST、ALT和LDH等相關(guān)酶將進(jìn)入血液中，通過(guò)檢測(cè)血清中相關(guān)酶的活性能反映肝功能的恢復(fù)情況.本實(shí)驗(yàn)通過(guò)連續(xù)7d給予波棱素后，波棱素能使肝損傷小鼠體內(nèi)的LDH、AST和ALT的含量明顯下降，減輕小鼠肝臟系數(shù)，顯示出波棱素具有一定的保護(hù)肝組織作用；同時(shí)，MDA是組織或器官膜脂質(zhì)發(fā)生過(guò)氧化反應(yīng)而產(chǎn)生的，它的含量與機(jī)體遭受自由基損害的程度有密切的關(guān)系；而SOD和GSH-Px的含量的高低則可以評(píng)定機(jī)體抗氧化水平.SOD在需氧生物體中幾乎普遍存在，它能清除炎癥中產(chǎn)生的自由基，顯示出抗氧化作用.機(jī)體內(nèi)廣泛存的GSH-Px是重要的催化過(guò)氧化物分解的酶，它特異地催化谷胱甘肽對(duì)氫過(guò)氧化物的還原反應(yīng)，抑制脂質(zhì)過(guò)氧化，保護(hù)細(xì)胞膜的完整性[5-7].本實(shí)驗(yàn)研究表明，波棱素能能明顯降低小鼠肝組織MDA的活性，升高SOD和GSH-Px的活性，顯示出波棱素抗肝組織損傷可能與藥物清除自由基，保護(hù)肝細(xì)胞膜，提高抗氧化能力和減少炎癥等機(jī)制相關(guān).綜上所述，波棱素具有確切的降低ConA引起的肝損傷酶活力增加，有效改善肝組織炎癥和病變，保護(hù)肝臟組織免受侵害.

[1]林小靜，宋騰飛，耿巖玲，等.藏藥波棱瓜子研究進(jìn)展[J].現(xiàn)代農(nóng)業(yè)科技，2012，23:82-84.

[2]TIEGS G，HENTSCHEL J，WENDEL A.A T cell-dependent experimental liver injury in mice inducible by concanavalin A.[J].Journal of Clinical Investigation，1992，90(1):196-203.

[3]胡水清，黃依雯，秦偉，等.Con A誘導(dǎo)小鼠肝損傷模型的發(fā)病機(jī)制[J].中國(guó)血液流變學(xué)雜志，2007，17(1):159-162.

[4]張修禮，曲建慧.小鼠ConA性肝損傷模型[J].世界華人消化雜志，2001，5:571-574.

[5]阮連國(guó)，張妍，朱清靜，等.肝脾調(diào)補(bǔ)方對(duì)小鼠免疫性肝損傷的防護(hù)作用[J].中西醫(yī)結(jié)合肝病雜志，2012，22(6):363-365.

[6]顧健，李佳川，樊利娜，等.藏藥波棱瓜子總木脂素對(duì)刀豆球蛋白(ConA)致免疫性肝損傷小鼠保護(hù)作用及其機(jī)制探討[J].西南民族大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版)，2014，40(3):375-387.

[7]王翔樸，王營(yíng)通，李玨聲.衛(wèi)生學(xué)大辭典[M].青島:青島出版社，2000:63.

[8]趙興冉，章雷，李佳川，等.藏藥波棱瓜子總木脂素對(duì)四氯化碳(CCl_4)致化學(xué)性肝損傷小鼠保護(hù)作用[J].西南民族大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版)，2015，41(2):181-185.

[9]張梅.藏藥波棱瓜子治療肝病有效成分的研究[D].成都:成都中醫(yī)藥大學(xué)，2003.

[10]張?chǎng)危T睿，顧健，等.波棱素脂質(zhì)體凍干粉針的制備及初步安全性和藥效學(xué)研究[J].中國(guó)中藥雜志，2014，39(16):3065-3068.

[11]GU J，YUAN Z，TAN R，et al.Isolation of herpetin from Herpetospermum seed and hepatoprotective activity of liposomal herpetin against carbon tetrachloride-induced liver injury in mice[J].Pharmazie，2015，70(11):745-752.

[12]YUAN H L，LIU Y，ZHAO Y L，et al.Herpetin，a New Bioactive Lignan Isolated from Herpetospermum caudigerum[J].Journal of Chinese Pharmaceutical Sciences，2005，14(3):140-143.

[13]周雪杉.藏藥波棱瓜子木脂素類成分系統(tǒng)研究[D].成都:西南交通大學(xué)，2014.

[14]袁世全，馮濤.中國(guó)百科大辭典[M].北京:華廈出版社，1990: 944.

(責(zé)任編輯:李建忠，付強(qiáng)，張陽(yáng)，羅敏；英文編輯:周序林，鄭玉才)

Protection of Herpetin from Tibetan medicine Herpetospermum seeds on ConA-induced immunologic liver injury in mice

WANG Lei，LIU Si-yang，SUN Ning-yang，LI Jia-chuan，GU jian
(School of Pharmacy，Southwest University for Nationalities，Chengdu 610041，P.R.C.)

Objective To study the protection effect of the bioactive Herpetin from Herpetospermum seeds on immunologic liver injury induced by ConA.Methods Mice were injected intravenously with ConA(20mg/kg)in order to establish the mice immunological liver injury model.Activities of ALT，AST，LDH in serum and MDA，SOD and GSH-Px levels in liver tissues were evaluated in different dose groups.Results After mice tail vein injection with ConA，the increased activities of ALT and AST in serum indicated that the mice immunological liver injury model induced by ConA was successful.Compared with the control group it was shown that Herpetin can significantly reduce the activities of hepatic ALT，AST and LDH，and also decrease the MDA content.Furthermore，elevated activities of SOD and GSH-Px were observed.Conclusion Herpetin can significantly decrease immunological liver injury induced by ConA，and reduce inflammatory response to protect liver tissues from damage.

Herpetospermum seeds；Herpetin；immunological liver injury

R285；R29

A

2095-4271(2016)05-0492-04

10.11920/xnmdzk.2016.05.004

2016-07-13

顧健(1967-)，男，漢族，教授，博士生生導(dǎo)師，研究方向:中藥及民族藥物基礎(chǔ)研究與開(kāi)發(fā).E-mail:gujiancd＠163.com

國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(81274168、81573563)；四川省中醫(yī)藥管理局科研項(xiàng)目(2016C062)