張建海，馮彬彬，牛小花

1.重慶三峽醫(yī)藥高等專科學(xué)校中藥研究所，重慶 404120；2.重慶三峽醫(yī)藥高等?？茖W(xué)校藥學(xué)系，重慶 404120

超聲輔助響應(yīng)面法優(yōu)化巫山淫羊藿中朝藿定C和淫羊藿苷共同提取工藝研究

張建海1，馮彬彬2，牛小花2

1.重慶三峽醫(yī)藥高等專科學(xué)校中藥研究所，重慶 404120；2.重慶三峽醫(yī)藥高等?？茖W(xué)校藥學(xué)系，重慶 404120

目的 應(yīng)用響應(yīng)面法優(yōu)化巫山淫羊藿中朝藿定C和淫羊藿苷的超聲輔助提取工藝。方法 在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，采用Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)和響應(yīng)面分析法考察乙醇體積分?jǐn)?shù)、超聲提取時(shí)間、液固比對巫山淫羊藿中朝藿定C和淫羊藿苷含量的影響。結(jié)果 最佳超聲輔助提取工藝為乙醇體積分?jǐn)?shù)73％、超聲提取時(shí)間22 min、料液比為1∶32，巫山淫羊藿中朝藿定C和淫羊藿苷得率分別為（15.90±0.12）％和（0.75±0.05）％。結(jié)論 本研究所建立的提取工藝能夠提高巫山淫羊藿中朝藿定C和淫羊藿苷的提取率，與模型預(yù)測值相符。

巫山淫羊藿；朝藿定C；淫羊藿苷；超聲輔助提取；響應(yīng)面法

巫山淫羊藿為小檗科淫羊藿屬植物巫山淫羊藿Epimedium wushanense T.S.Ying的干燥葉，具有補(bǔ)腎陽、強(qiáng)筋骨等功效。巫山淫羊藿中的主要活性成分是淫羊藿苷、朝藿定C，其中朝藿定C的含量較高，因此巫山淫羊藿有區(qū)別于其他淫羊藿的藥效特性[1-4]。2010年版《中華人民共和國藥典》（一部）將其單列，表明巫山淫羊藿有其獨(dú)特之處。近年來，我國學(xué)者就淫羊藿的主要成分提取工藝開展了很多研究工作[1-2,4]，但迄今對巫山淫羊藿的研究較少。超聲波輔助提取法是利用超聲波產(chǎn)生的強(qiáng)烈振動(dòng)、高加速度、強(qiáng)烈的空化效應(yīng)、攪拌作用等，加速有效成分進(jìn)入溶劑，從而提高浸出率，縮短提取時(shí)間，具有操作方便、品質(zhì)穩(wěn)定等優(yōu)點(diǎn)[5-8]。為了進(jìn)一步優(yōu)化巫山淫羊藿提取工藝，根據(jù)有關(guān)文獻(xiàn)和預(yù)試驗(yàn)結(jié)果[2,9-12]，本研究采用乙醇作為溶劑，結(jié)合超聲波輔助提取巫山淫羊藿中朝藿定C和淫羊藿苷，并通過Box-Behnken試驗(yàn)和響應(yīng)面分析法優(yōu)選提取工藝，為巫山淫羊藿的開發(fā)利用提供試驗(yàn)依據(jù)。

1 儀器與試藥

美國Agilent1260智能柱溫箱及VWD紫外檢測器；KQ5200E型超聲波清洗器，昆山市超聲儀器有限公司；BSA224S電子天平，賽多利斯科學(xué)儀器（北京）有限公司；DGX-9143B-1型數(shù)顯鼓風(fēng)干燥箱，上海?，攲?shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司；HH.SYZ1-NI型電熱恒溫水浴鍋，北京市長風(fēng)儀器儀表公司；SHB-IV雙A循環(huán)式多用真空泵，鄭州長城科工貿(mào)有限公司；Millipore純水系統(tǒng)。

朝藿定C、淫羊藿苷對照品，中國食品藥品檢定研究院，批號分別為111780-200801、110737-200415）；乙醇、甲醇等均為分析純，乙腈、甲醇為色譜純；水為去離子水，其他試劑均為分析純。巫山淫羊藿，采集野生植物，經(jīng)西南大學(xué)王海洋教授鑒定為小檗科淫羊藿屬植物巫山淫羊藿Epimedium wushanense T.S. Ying的干燥葉。

2 方法與結(jié)果

2.1 朝藿定C和淫羊藿苷含量測定

2.1.1 色譜條件 色譜柱為Agilent-C18（250 mm× 4.6 mm，5 μm），流動(dòng)相為乙腈和水，采用梯度洗脫（乙腈：0～10 min，20％；10～20 min，45％；20～25 min，55％；25～30 min，20％），流速為1.0 mL/min，溫度25 ℃，檢測波長270 nm，進(jìn)樣量20 μL[10-12]。2.1.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立 取朝藿定C和淫羊藿苷對照品10 mg，精密稱定，置于25 mL容量瓶中，加乙醇溶解，得朝藿定C和淫羊藿苷儲備液，將朝藿定C和淫羊藿苷儲備液配制成質(zhì)量濃度均為6.25、12.50、25.00、50.00、100.00、200.00 mg/L的系列標(biāo)準(zhǔn)溶液，按“2.1.1”項(xiàng)下色譜條件分析，以峰面積對質(zhì)量濃度進(jìn)行線性回歸，得朝藿定C回歸方程Y＝52.90X＋82.25（r2＝0.999 1），淫羊藿苷回歸方程Y＝22.37X＋28.37（r2＝0.999 6），朝藿定C和淫羊藿苷線性范圍均為6.25～200.00 mg/L。

2.1.3 樣品測定 將巫山淫羊藿葉片清洗、陰干、粉碎、過篩（孔徑0.355 mm），在60 ℃干燥4 h。稱取各試驗(yàn)設(shè)計(jì)的恒重后的巫山淫羊藿粉末0.2 g，精密稱定，置具塞三角瓶中，按照設(shè)計(jì)的試驗(yàn)條件進(jìn)行提取，過濾，濾液過微孔濾膜，即得樣品溶液，進(jìn)樣。

2.2 單因素試驗(yàn)考察

2.2.1 乙醇體積分?jǐn)?shù) 取巫山淫羊藿粉末1.0 g，精密稱定，固定超聲時(shí)間20 min，提取溫度50 ℃，料液比1∶30，分別用體積分?jǐn)?shù)為30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％的乙醇溶液提取，測定朝藿定C和淫羊藿苷得率。結(jié)果朝藿定C含量分別為（1.25±0.24）％、（1.34±0.45）％、（1.42±1.03）％、（1.46±0.67）％、（1.50±0.56）％、（1.49±0.94）％、（1.37±1.34）％，淫羊藿苷含量分別為（0.42± 0.23）％、（0.48±1.07）％、（0.54±0.37）％、（0.68± 0.62）％、（0.71±0.71）％、（0.67±0.92）％、（0.65± 1.18）％，故綜合考慮選擇70％乙醇。

2.2.2 超聲時(shí)間 取巫山淫羊藿粉末1.0 g，精密稱定，固定乙醇體積分?jǐn)?shù)70％，提取溫度50 ℃，料液比1∶30，分別超聲提取10、15、20、25、30、35、40 min，測定朝藿定C和淫羊藿苷得率。結(jié)果朝藿定C的含量分別為（1.32±0.57）％、（1.43±1.95）％、（1.52±0.75）％、（1.50±0.08）％、（1.48±0.24）％、（1.47±0.14）％、（1.45±0.46）％，淫羊藿苷含量分別為（0.57±1.04）％、（0.63±0.73）％、（0.70±0.26）％、（0.68±0.73）％、（0.66±0.26）％、（0.65±0.87）％、（0.67±0.21）％，故綜合考慮選擇超聲提取20 min。2.2.3 提取溫度 取巫山淫羊藿粉末1.0 g，精密稱定，固定乙醇體積分?jǐn)?shù)70％，超聲提取時(shí)間20 min，料液比1∶30，分別于30、40、50、60、70、80 ℃進(jìn)行提取，測定朝藿定C和淫羊藿苷得率。結(jié)果朝藿定C含量分別為（1.42±0.25）％、（1.44±0.31）％、（1.49±0.58）％、（1.47±0.29）％、（1.48±0.27）％、（1.51±0.81）％，淫羊藿苷的含量分別為（0.62± 1.01）％、（0.65±0.82）％、（0.68±0.54）％、（0.68± 0.37）％、（0.65±0.64）％、（0.63±0.71）％，說明提取溫度對朝藿定C的提取率影響不大，故綜合考慮選擇提取溫度為50 ℃。

2.2.4 料液比 取巫山淫羊藿粉末1.0 g，精密稱定，固定乙醇體積分?jǐn)?shù)70％，超聲提取時(shí)間20 min，超聲溫度為50 ℃，料液比（g/mL）分別為1∶10、1∶15、1∶20、1∶25、1∶30、1∶35、1∶40進(jìn)行提取，測定朝藿定C和淫羊藿苷得率。結(jié)果朝藿定C含量分別為（1.38±0.25）％、（1.41±0.78）％、（1.45±0.92）％、（1.48±0.17）％、（1.51±0.11）％、（1.50±0.28）％、（1.41±0.15）％，淫羊藿苷的含量分別為（0.48± 0.28）％、（0.52±0.09）％、（0.58±0.17）％、（0.64± 0.47）％、（0.69±0.28）％、（0.67±0.17）％、（0.65± 0.58）％，故綜合考慮選擇料液比為1∶30。

2.3 響應(yīng)面試驗(yàn)

根據(jù)單因素試驗(yàn)考察的結(jié)果，采用三因素三水平的Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)，以乙醇濃度、超聲時(shí)間、料液比為自變量，以朝藿定C和淫羊藿苷的得率為因變量，研究響應(yīng)值及最佳變量的組合。試驗(yàn)因素水平見表1。共設(shè)計(jì)17個(gè)試驗(yàn)，重復(fù)3次。根據(jù)響應(yīng)面試驗(yàn)，按照“2.1”項(xiàng)下方法測定朝藿定C和淫羊藿苷含量，試驗(yàn)安排及結(jié)果見表2，響應(yīng)面分析見圖1，方差分析結(jié)果見表3。影響因素中，料液比（C）的影響最大，其次是乙醇濃度（A）、超聲時(shí)間（B）；在總的作用因素中，交互項(xiàng)和平方項(xiàng)的影響較大，而1次項(xiàng)影響相對較小，乙醇濃度和超聲時(shí)間、乙醇濃度和料液比、超聲時(shí)間和料液比均具有交互作用。

以朝藿定C和淫羊藿苷提取量為響應(yīng)值，采用Design-Expert軟件對表2試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行三元二次多項(xiàng)式逐步回歸擬合，得回歸方程Y＝1.608＋0.0025A＋0.08125B＋0.06125C－0.0175AB－0.0425AC＋0.015 0BC－0.096 5A2－0.139 0B2－0.099 0C2、Y＝0.7460＋0.0200A＋0.0175B＋0.0275C－0.0500AB－0.0350AC－0.0300BC－0.0855A2－0.0705B2－0.0805C2。由表3可知，該模型高度顯著，失擬項(xiàng)相對于絕對誤差不顯著。模型確定系數(shù)（R2）為0.993 7，說明此模型與實(shí)際試驗(yàn)擬合較好，能很好地描述試驗(yàn)結(jié)果。圖1響應(yīng)面分析更為直觀地表現(xiàn)了各因素與朝藿定C和淫羊藿苷提取量的相互關(guān)系，表明各因素對朝藿定C交互作用不顯著，而對淫羊藿苷含量交互作用顯著。

2.4 驗(yàn)證試驗(yàn)

通過Design Expert 8.0.6.1軟件進(jìn)行響應(yīng)面設(shè)計(jì)優(yōu)化，確定朝藿定C的最佳提取工藝為乙醇體積分?jǐn)?shù)76.24％、提取時(shí)間22.64 min、料液比1∶31.95 g/mL，朝藿定C理論提取量為1.58％；淫羊藿苷的最佳提取工藝為乙醇體積分?jǐn)?shù)70％、提取時(shí)間21.14 min、料液比1∶31.51 g/mL，淫羊藿苷理論提取量為0.75％。結(jié)合實(shí)際操作考慮，將工藝條件修正為乙醇體積分?jǐn)?shù)73％、提取時(shí)間22 min、料液比1∶32 g/mL。按該工藝進(jìn)行5次驗(yàn)證試驗(yàn)，結(jié)果巫山淫羊藿中朝藿定C和淫羊藿苷提取量分別為（15.90±0.12）％和（0.75± 0.05）％，與預(yù)測值基本一致，表明該三元二次方程與實(shí)際情況擬合較好，充分驗(yàn)證了所建模型的正確性。

3 討論

超聲波提取方法可較好地用于巫山淫羊藿中朝藿定C和淫羊藿苷有效成分的提取，其主要藥效成分可較好保留。在整個(gè)提取過程中溫度較低，有利于巫山淫羊藿中的有效成分不被破壞。

本研究在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，確定乙醇體積分?jǐn)?shù)、提取溫度、液固比對巫山淫羊藿中朝藿定C和淫羊藿苷提取率影響顯著，采用響應(yīng)面法對超聲輔助提取的工藝條件進(jìn)行優(yōu)化，結(jié)果預(yù)測值與實(shí)測值基本一致，說明建立的工藝條件可靠，能有效提高巫山淫羊藿中朝藿定C和淫羊藿苷的提取率，對巫山淫羊藿資源的綜合利用及工業(yè)化生產(chǎn)具有指導(dǎo)意義。

本研究采用響應(yīng)面法優(yōu)化了提取巫山淫羊藿中朝藿定C和淫羊藿苷的4個(gè)關(guān)鍵因子，得到二次項(xiàng)回歸模型，并對交互項(xiàng)作用進(jìn)行分析。確定最佳工藝條件為：乙醇體積分?jǐn)?shù)73％，提取時(shí)間22 min，料液比1∶32 g/mL。

[1]王輝,劉長路,杜惠蓉.超聲波法提取淫羊藿中淫羊藿苷工藝研究[J].廣州化工,2013,4l(13)：89-90.

[2]姜寧,劉曉鵬.淫羊藿中淫羊藿苷的快速提取及測定研究[J].中華中醫(yī)藥雜志,2008,23(1)：64-66.

[3]張華峰,高翔,盧大炎,等.HPLC法同時(shí)測定淫羊藿中朝藿定A、B、C與淫羊藿苷的含量[J].分析測試學(xué)報(bào),2007,26(2)：198-201.

[4]賈恒明,邢俊波.正交設(shè)計(jì)優(yōu)選淫羊藿中淫羊藿苷提取工藝[J].解放軍藥學(xué)學(xué)報(bào),2010,26(3)：223-224.

[5]潘國波,楊小明,丁艷,等.響應(yīng)面法優(yōu)化超聲輔助提取宣木瓜總皂苷提取工藝研究[J].天然產(chǎn)物研究與開發(fā),2012,24(9)：1292-1296.

[6]盧時(shí)勇,錢俊青,鄒小明.響應(yīng)面法優(yōu)化超聲提取白術(shù)有效成分的研究[J].中國中藥雜志,2006,31(7)：549-552.

[7]劉瑞林,詹漢英,陳鈿,等.響應(yīng)曲面優(yōu)化超聲輔助提取山茱萸籽油工藝及其成分分析[J].食品科學(xué),2012,33(12)：1-7.

[8]陳雅維,張延萍,周冬菊,等.響應(yīng)面法優(yōu)化葛根總黃酮的超聲輔助提取工藝[J].食品科學(xué),2012,33(14)：41-44.

[9]楊柳,鐘靜嫻,林巧玲,等.淫羊藿中淫羊藿苷的提取工藝研究[J].中藥新藥與臨床藥理,2005,16(4)：286-293.

[10]謝娟平,孫文基.梯度洗脫法同時(shí)快速分離測定不同品種不同部位淫羊藿中7種異戊烯基黃酮類成分的研究[J].天然產(chǎn)物研究與開發(fā), 2010,22(5)：820-825.

[11]謝娟平,王忠東,孫文基.淫羊藿屬9種淫羊藿葉中朝藿定C和淫羊藿苷量的考查[J].中草藥,2007,38(4)：613-614.

[12]裴利寬,郭寶林,黃文華.淫羊藿屬主要資源種類的HPLC指紋圖譜特征和種類鑒定[J].中國中藥雜志,2008,33(14)：1662-1668.

Optimization of Ultrasonic-Assisted Extraction of Epimedin C and Icariin from Epimedii

Wushanensis Herba by Using Response Surface Methodology

ZHANG Jian-hai1, FENG Bin-bin2,

NIU Xiao-hua2(1. Institute of Chinese Materia Medica, Chongqing Three Gorges Medical College, Chongqing 404120, China; 2. Department of Pharmacy, Chongqing Three Gorges Medical College, Chongqing 404120, China)

Objective To optimize ultrasonic-assisted extraction Epimedin C and Icariin from Epimedii Wushanensis Herba by response surface methodology. Methods On the basis of single factor tests, Box-Behnken experimental design and response surface methodology were adopted to optimize extraction conditions with the concentration of ethanol, ultrasonic time and solid-liquid ratio as factors. HPLC was used to determine the content of Epimedin C and Icariin from Epimedii Wushanensis Herba. Results Optimal ultrasound-assisted extraction technology was as following: the concentration of ethanol was 73％; the ultrasonic time was 22 min; the ratio of liquid to material was 1:32. The contents of Epimedin C and Icariin from Epimedii Wushanensis Herba were 15.90％ and 0.75％, respectively. Conclusion This extraction technology can improve the extraction efficiency of Epimedin C and Icariin from Epimedii Wushanensis Herba, which is in accordance with predicted value.

Epimedii Wushanensis Herba; Epimedin C; Icariin; ultrasound-assisted extraction; response surface method

10.3969/j.issn.1005-5304.2016.03.023

R284.2

A

1005-5304(2016)03-0085-04

重慶市教委自然科學(xué)項(xiàng)目（KJ131802）

馮彬彬，E-mail：fengbin1024@sina.com

（2015-05-07）

（2015-06-01；編輯：陳靜）