任 莉 辛天怡 郭夢(mèng)月 姚 輝 龐曉慧

(中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院藥用植物研究所，北京，100193)

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基于ITS2條形碼鑒定水紅花子及其混偽品

任 莉 辛天怡 郭夢(mèng)月 姚 輝 龐曉慧

(中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院藥用植物研究所，北京，100193)

目的：利用ITS2條形碼對(duì)中藥材水紅花子及其混偽品進(jìn)行鑒定研究。方法：為對(duì)該中藥材進(jìn)行準(zhǔn)確鑒定，共收集71份樣本，包含藥材正品及其混偽品。通過(guò)對(duì)樣品進(jìn)行DNA提取、PCR擴(kuò)增、雙向測(cè)序，利用CodonCode Aligner軟件進(jìn)行序列質(zhì)量評(píng)價(jià)與拼接，獲得ITS2序列。用MEGA軟件進(jìn)行序列比對(duì)、變異位點(diǎn)及遺傳距離分析，采用最近距離法和構(gòu)建NJ(鄰接)樹(shù)法來(lái)評(píng)價(jià)ITS2條形碼的鑒定能力。結(jié)果：水紅花子藥材基原物種紅蓼ITS2序列種內(nèi)遺傳距離為0～0.0124，與其混偽品水蓼、酸模葉蓼以及春蓼的種間遺傳距離分別為0.0334～0.0508、0.0688～0.0875、0.0379～0.0467。紅蓼種內(nèi)最大遺傳距離小于其與混偽品的種間最小遺傳距離，表明ITS2條形碼可以準(zhǔn)確鑒定水紅花子與其混偽品。此外，基于ITS2序列構(gòu)建的NJ樹(shù)也可將水紅花子及其混偽品明顯區(qū)分開(kāi)。結(jié)論：ITS2條形碼是鑒別水紅花子藥材的有效工具，可為保障該藥材生產(chǎn)投料安全提供新的技術(shù)手段。

水紅花子；DNA條形碼；ITS2；分子鑒定

水紅花子為蓼科蓼屬植物紅蓼PolygonumorientaleL.的干燥成熟果實(shí)，具有散血消癥、消積止痛、利水消腫等功效[1]?，F(xiàn)代藥理研究表明水紅花子具有抗氧化、抗腫瘤、抗心肌缺血等作用[2-7]，臨床上可用于治療胃癌、腸癌、肝癌、胃痛、糖尿病等[8-9]。紅蓼的全草、花序、果實(shí)和根均可入藥[10]。除具有重要藥用價(jià)值外，紅蓼還可食用，并有望被制成殺蟲(chóng)劑與吸附劑[11-15]，具有重要開(kāi)發(fā)價(jià)值。然而，由于其同屬物種形態(tài)特征高度相似、地方習(xí)用品廣泛存在，使其混偽現(xiàn)象嚴(yán)重，常見(jiàn)的混偽品有水蓼P.hydropiperL.、酸模葉蓼P.lapathifoliumL.以及春蓼P.persicariaL.[4]等，為其質(zhì)量控制以及深入研究帶來(lái)了困難。因此，為保障水紅花子的用藥安全以及進(jìn)一步研究開(kāi)發(fā)的順利進(jìn)行，需要一種快速、準(zhǔn)確的方法對(duì)其進(jìn)行鑒定。

DNA條形碼是利用相對(duì)較短的、標(biāo)準(zhǔn)的DNA片段來(lái)進(jìn)行物種鑒定的一項(xiàng)新的分子鑒定技術(shù)，是近年來(lái)的研究熱點(diǎn)[16]。Chen等[17]比較了7個(gè)候選DNA條形碼(psbA-trnH，matK，rbcL，rpoC1，ycf5，ITS2，ITS)對(duì)藥用植物鑒定的有效性，發(fā)現(xiàn)ITS2序列的物種水平鑒定效率達(dá)到92.7%，首次提出以ITS2為核心，psbA-trnH為補(bǔ)充序列的藥用植物條形碼鑒定體系。隨后，ITS2條形碼被廣泛應(yīng)用于中藥材鑒定[18-31]，并建立以ITS2為主體的中藥材鑒定體系和網(wǎng)絡(luò)鑒定數(shù)據(jù)庫(kù)(http://www.tcmbarcode.cn)，該鑒定體系現(xiàn)已納入《中華人民共和國(guó)藥典》[32]。我們利用ITS2條形碼對(duì)水紅花子藥材進(jìn)行鑒定研究，擬解決該藥材的真?zhèn)舞b別問(wèn)題，為保障水紅花子用藥安全提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料 本研究共收集實(shí)驗(yàn)材料71份。其中水紅花子樣本44份，包含藥材樣本29份，原植物樣本15份；其混偽品樣本27份，包含酸模葉蓼18份，春蓼9份。樣品采自北京、吉林、四川、上海、福建、浙江等地，憑證標(biāo)本經(jīng)中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院藥用植物研究所林余霖研究員及通化師范學(xué)院于俊林教授鑒定，并保存于中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院藥用植物研究所。另外，從GenBank下載ITS2序列5條，分別為酸模葉蓼1條，水蓼4條。樣本信息詳見(jiàn)表1。

表1 樣品信息

1.2 方法

1.2.1 DNA提取 分別取水紅花子藥材樣本約40 mg(適當(dāng)粉碎，加入樣本量10%的PVP-40)，硅膠干燥的基原植物葉片約20 mg，均用DNA提取研磨儀(Retsch MM400，Germany)研磨2 min(30次/s)后，利用植物基因組DNA提取試劑盒(Tiangen Biotech Co.，China)提取總DNA。

1.2.2 PCR擴(kuò)增及測(cè)序 采用ITS2序列通用引物，正向ITS2F：5' -ATGCGATACTTGGTGTGAAT-3' ，反向ITS3R：5' -GACGCTTCTCCAGACTACAAT-3' 。擴(kuò)增體系及程序參照“中藥材DNA條形碼分子鑒定指導(dǎo)原則”[32]。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物委托上海美吉測(cè)序公司進(jìn)行雙向測(cè)序。

1.2.3 數(shù)據(jù)處理 測(cè)序峰圖利用CodonCode Aligner V3.7.1(CodonCode Co.，USA)校對(duì)拼接，去除引物區(qū)。將所獲序列及GenBank下載序列采用基于隱馬爾可夫模型的HMMer注釋方法去除兩端5.8 S和28 S區(qū)段獲得ITS2間隔區(qū)序列[33]。將所有序列用軟件MEGA5.1分析比對(duì)[34]，并基于K2P模型進(jìn)行遺傳距離分析，用鄰接(NJ)法構(gòu)建系統(tǒng)聚類樹(shù)，利用bootstrap(1 000次重復(fù))檢驗(yàn)各分支的支持率。

2 結(jié)果與分析

2.1 水紅花子及其混偽品ITS2序列特征 水紅花子基原物種紅蓼44條ITS2序列的長(zhǎng)度為245 bp，GC含量為66.9%～67.8%。紅蓼序列間存在3個(gè)變異位點(diǎn)，分別為73位點(diǎn)A-G變異，133位點(diǎn)C-T變異，228位點(diǎn)G-A變異，分為6個(gè)單倍型。混偽品水蓼、酸模葉蓼以及春蓼ITS2序列長(zhǎng)度分別為245 bp、250 bp和245 bp，GC含量為66.1%～68.0%。紅蓼與水蓼、酸模葉蓼以及春蓼ITS2序列間存在較多的變異位點(diǎn)，詳見(jiàn)圖1。

圖1 水紅花子及其混偽品ITS2序列種間變異位點(diǎn)信息

表2 水紅花子種內(nèi)及與其混偽品種間K2P遺傳距離

2.2 水紅花子及其混偽品種內(nèi)及種間遺傳距離分析 將紅蓼的ITS2序列進(jìn)行遺傳距離分析，種內(nèi)最小遺傳距離為0，最大遺傳距離為0.0124。水蓼、酸模葉蓼以及春蓼ITS2序列種內(nèi)遺傳距離分別為0～0.0292、0～0.0040和0。紅蓼與水蓼，紅蓼與酸模葉蓼以及紅蓼與春蓼之間的遺傳距離分別為0.0334～0.0508、0.0668～0.0875、0.0379～0.0467。紅蓼與其混偽品種間最小遺傳距離大于紅蓼種內(nèi)最大遺傳距離，說(shuō)明采用ITS2序列可以將水紅花子與其混偽品準(zhǔn)確區(qū)分開(kāi)。

2.3 構(gòu)建NJ樹(shù)鑒別水紅花子及其混偽品從基于ITS2序列構(gòu)建的NJ樹(shù)圖(圖2)可以看出，紅蓼單獨(dú)聚為一支，支持率為87%，表現(xiàn)出單系性?；靷纹匪ぁ⑺崮Ｈ~蓼及春蓼各自聚為一支，明顯與紅蓼分開(kāi)。因此，ITS2條形碼可準(zhǔn)確鑒別水紅花子藥材及其混偽品。

圖2 基于ITS2序列構(gòu)建的水紅花子及其混偽品NJ樹(shù)

3 討論

3.1 水紅花子藥材樣本亦可成功獲得ITS2序列 DNA條形碼技術(shù)有望實(shí)現(xiàn)對(duì)物種進(jìn)行快速、準(zhǔn)確、自動(dòng)的識(shí)別和鑒定，在物種鑒定方面顯示了廣闊的應(yīng)用前景，因此一經(jīng)提出便受到了廣泛關(guān)注。然而，由于加工、炮制、貯藏時(shí)間長(zhǎng)等因素，常常導(dǎo)致中藥材DNA降解嚴(yán)重，是否能成功獲得條形碼序列是很多專家關(guān)注的問(wèn)題。研究表明許多中藥材可成功獲得條形碼序列，如木香類藥材[18]、黨參[19]、柴胡[20]、羌活[21]、大青葉[22]、人參[23]、合歡花[24]、合歡皮[24]、五加皮[25]、紅景天[26]、枸杞子[27]、秦艽[28]等。本研究中在提取水紅花子藥材樣本的DNA時(shí)，增加了取樣量(40 mg)，是葉片樣本用量的兩倍，并且在研磨前加入樣本量10%的PVP-40，結(jié)果PCR產(chǎn)物電泳后條帶單一明亮，所有樣本均可成功獲得ITS2序列。據(jù)報(bào)道一些藥材樣品DNA降解特別嚴(yán)重，提取到的DNA經(jīng)電泳后條帶呈彌散狀態(tài)，甚至有少數(shù)是不可見(jiàn)的，但PCR產(chǎn)物電泳后可顯示出條帶，并能成功測(cè)序[20-21,24]。就其原因，主要是ITS2序列較短，且在基因組內(nèi)為多拷貝，降低了擴(kuò)增和測(cè)序的難度，有利于鑒定DNA降解的藥材樣品,對(duì)于中藥材DNA鑒定具有重要實(shí)踐意義。

3.2 ITS2條形碼是準(zhǔn)確鑒定水紅花子藥材的好工具 鑒于ITS2序列具有較強(qiáng)的鑒定能力，Chen等提出將其作為藥用植物鑒定的標(biāo)準(zhǔn)條形碼[17]，并將其推廣應(yīng)用于中藥材鑒定研究中。羅焜等運(yùn)用ITS2條形碼對(duì)藥材秦艽進(jìn)行了鑒定研究，結(jié)果顯示ITS2序列可有效鑒定秦艽藥材及其混偽品[28]。辛天怡等研究了ITS/ITS2條形碼對(duì)羌活藥材鑒定的穩(wěn)定性與準(zhǔn)確性，結(jié)果表明ITS/ITS2序列可穩(wěn)定、準(zhǔn)確地鑒別羌活藥材[21]。趙莎等應(yīng)用ITS2序列對(duì)中藥材五加皮及其混偽品進(jìn)行鑒定研究，發(fā)現(xiàn)ITS2條形碼可準(zhǔn)確鑒別五加皮及其混偽品[25]。本研究應(yīng)用ITS2條形碼對(duì)水紅花子進(jìn)行鑒定研究。為確保研究的準(zhǔn)確性和可重復(fù)性，收集了大量樣本(共71份)，其中水紅花子正品樣本44份，包含藥材樣本29份。通過(guò)對(duì)水紅花子基原植物紅蓼44條ITS2序列進(jìn)行種內(nèi)變異分析，發(fā)現(xiàn)紅蓼ITS2序列種內(nèi)遺傳距離較小。種間變異分析表明紅蓼與其混偽品ITS2序列間的遺傳距離較大。紅蓼與其混偽品種間最小遺傳距離大于紅蓼種內(nèi)最大遺傳距離。另外，從基于ITS2序列構(gòu)建的NJ樹(shù)可看出紅蓼單獨(dú)聚為一支，明顯與其混偽品分開(kāi)。因此，本研究顯示ITS2條形碼能夠穩(wěn)定、準(zhǔn)確地鑒別水紅花子藥材及其混偽品，是鑒定水紅花子的好工具。

3.3 運(yùn)用DNA條形碼技術(shù)鑒定中藥材具有重要實(shí)踐價(jià)值 近年來(lái)，隨著分子生物學(xué)技術(shù)的迅猛發(fā)展，促進(jìn)了DNA分子標(biāo)記鑒定技術(shù)的誕生，目前已在中藥鑒定領(lǐng)域中廣泛應(yīng)用，推動(dòng)著中藥鑒定技術(shù)不斷進(jìn)步和完善。DNA條形碼是目前國(guó)際上物種鑒定的最新技術(shù)，與其他分子鑒定方法相比具有如下優(yōu)勢(shì)：鑒定結(jié)果可重復(fù)性良好；方法通用性強(qiáng)；可構(gòu)建統(tǒng)一數(shù)據(jù)庫(kù)和鑒定平臺(tái)，易于推廣和標(biāo)準(zhǔn)化[35]。目前該技術(shù)已在中藥材鑒定領(lǐng)域廣泛應(yīng)用，大大加快了中藥鑒定標(biāo)準(zhǔn)化的進(jìn)程。水紅花子為我國(guó)傳統(tǒng)中藥，據(jù)報(bào)道其同屬植物酸模葉蓼、春蓼、水蓼等在不同地區(qū)被作為水紅花子入藥，嚴(yán)重影響其藥材品質(zhì)及療效[4]。由于水紅花子的混偽品來(lái)自同屬近緣植物，藥材形態(tài)近似，采用傳統(tǒng)的鑒定方法通常會(huì)較為困難，只有具備豐富鑒別經(jīng)驗(yàn)的專業(yè)人員才能準(zhǔn)確地識(shí)別出混偽品，因此建立有效的水紅花子鑒定方法十分必要。本研究采用ITS2條形碼對(duì)其進(jìn)行鑒定，可以準(zhǔn)確便捷地鑒別水紅花子與其混偽品，為水紅花子藥材的準(zhǔn)確客觀鑒定提供了新的技術(shù)手段。DNA條形碼技術(shù)不僅可解決中藥材的鑒定問(wèn)題，而且非專業(yè)分類人員通過(guò)DNA條形碼鑒定體系也可準(zhǔn)確鑒定藥材的正品及混偽品。鑒于DNA條形碼技術(shù)的諸多優(yōu)勢(shì)，必將在今后的中藥材鑒定、流通管理以及藥材市場(chǎng)監(jiān)管等領(lǐng)域發(fā)揮更大的作用。

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(2016-04-12收稿 責(zé)任編輯：洪志強(qiáng))

Identification of Polygoni Orientalis Fructus and its adulterants using ITS2 barcode

Ren Li，Xin Tianyi，Guo Mengyue，Yao Hui，Pang Xiaohui

(InstituteofMedicinalPlantDevelopment，ChineseAcademyofMedicalSciencesandPekingUnionMedicalCollege，Beijing100193，China)

Objective:The ITS2 barcode was used to identify Polygoni Orientalis Fructus and its adulterants in this study.Methods:For the accuracy of the identification，a total of 71 samples from Polygoni Orientalis Fructus and its adulterants were collected.The DNA was extracted from the samples and the ITS2 regions were amplified and sequenced.The sequences were then assessed and assembled using the CodonCode Aligner.The genetic distances and variable sites of ITS2 region were analyzed using MEGA after sequence alignment.Nearest distance and phylogenetic tree(NJ-tree)methods were used to test the identification efficiency of the ITS2 barcode.Results:The intraspecific genetic distances of Polygonum orientale were 0～0.0124，while the interspecific genetic distances between P.orientale and its adulterants were 0.0334～0.0508，0.0688～0.0875 and 0.0379～0.0467，respectively.The maximum intraspecific genetic distance of P.orientale was lower than the minimum interspecific genetic distance between P.orientale and its adulterants，which showed that ITS2 barcode could discriminate P.orientale and its adulterants accurately.Besides，the NJ tree based on ITS2 sequences supported that P.orientale and its adulterants can be easily differentiated.Conclusion:The ITS2 barcode is an effective tool for the identification of P.orientale and its adulterants.Our study may provide a new technique to ensure the production feeding security of traditional Chinese medicine.

Polygoni Orientalis Fructus; DNA barcoding; ITS2; Molecular identification

重大新藥創(chuàng)制國(guó)家科技重大專項(xiàng)“中藥新藥安全性檢測(cè)技術(shù)與標(biāo)準(zhǔn)研究”(編號(hào)：2014ZX09304307001);國(guó)家科技支撐計(jì)劃(編號(hào)：2011BAI07B08)

任莉，在讀碩士研究生，E-mail:renliwangyi@163.com

龐曉慧，博士，副研究員，主要研究方向：中藥分子鑒定研究，Tel:(010)57833051，E-mail：xhpang@implad.ac.cn

R282.5

A

10.3969/j.issn.1673-7202.2016.01.007