王禎 樊葉楊 莊杰云 朱玉君

（中國水稻研究所國家水稻改良中心/水稻生物學國家重點實驗室，杭州310006；*

通訊作者：yjzhu2013@163.com）

103個雜交稻親本白葉枯病和稻瘟病抗性基因型檢測

王禎 樊葉楊 莊杰云 朱玉君*

（中國水稻研究所國家水稻改良中心/水稻生物學國家重點實驗室，杭州310006；*

通訊作者：yjzhu2013@163.com）

白葉枯病和稻瘟病是我國水稻生產的主要病害，選育抗病品種是一種經濟有效的防治手段。明確抗性基因在水稻品種資源中的分布，將有助于應用分子標記輔助選擇培育抗性品種。本研究針對13個重要抗病基因，包括8個白葉枯病抗性基因（Xa1、Xa4、xa5、Xa7、xa13、Xa21、Xa23和Xa26）和5個稻瘟病抗性基因（Pib、Pi2、Pi9、Pi25 和Pita），應用這些基因的基因標記或連鎖標記共29個，檢測103份雜交稻親本，初步確定了其等位基因分布和利用情況，為水稻基礎材料的篩選及應用提供參考。

水稻；白葉枯??；稻瘟??；抗性基因；DNA標記

水稻是我國重要的糧食作物之一。稻瘟病和白葉枯病是水稻生產的主要病害[1-2]。因此，針對這兩種病害的抗性基因定位和克隆一直備受關注。目前，已有超過100個稻瘟病抗性基因被定位，其中22個已經被克隆[3]；有20個白葉枯病抗性基因被定位，其中7個已經被克?。╤ttp://www.ricedata.cn/gene）。利用這些已鑒定的抗性基因，育種家借助分子標記輔助選擇培育了多個攜帶單個或多個抗性基因的水稻抗病新品種，并在水稻生產過程中取得成效[4-7]。應用分子標記輔助選擇進行品種抗性改良的關鍵步驟是如何從豐富的水稻品種資源庫中找到合適抗源。研究表明，基因信息庫的構建可以為此提供幫助[8-10]。本研究以水稻育種中常用的一些抗性基因為研究對象，包括白葉枯病抗性基因Xa1、xa5、Xa7、xa13、Xa21、Xa23、Xa4和Xa26以及稻瘟病抗性基因Pib、Pi2、Pi9、Pi25和Pita，應用位于基因內部或連鎖區(qū)間的分子標記鑒定103份雜交稻親本；分析這些抗性基因的等位基因分布及利用情況，以期為水稻新品種選育提供參考。

1 材料與方法

1.1 水稻材料

從中國水稻研究所和其他育種單位共征集了103份水稻材料（表1），包括秈型三系雜交稻母本23個（不育系8個、保持系15個），秈型三系雜交稻父本43個，粳型三系雜交稻母本2個，粳型三系雜交稻父本2個，秈型兩系雜交稻母本4個，秈型兩系雜交稻父本2個，常規(guī)秈稻品種8個，常規(guī)粳稻品種4個，未定名品系15個。未定名品系均由中國水稻研究所提供，其余材料來源在前期研究中已有介紹[11]。

1.2 分子標記

本文共用到29個分子標記（表2），其中16個用于檢測白葉枯病抗性基因，13個用于檢測稻瘟病抗性基因。這些標記中，檢測Xa1的3個標記RM17499、RM5473和 RM3836，以及檢測 xa5、xa13和 Pib的RM17750、RM447和RM208為本研究根據目標基因在水稻品種日本晴基因組上的物理位置篩選獲得：先從目標基因兩側選取多個SSR標記對代表性水稻品種進行多態(tài)性分析，挑選呈現多個等位基因、帶型清晰的SSR標記用于所有103個水稻品種的檢測。其余標記來自前人報道[12-28]。

1.3 標記檢測和等位基因記錄

采用簡易法提取水稻基因組DNA[29]。PCR反應體系為5×PCR緩沖液2.0 μL、25 mmol/L MgCl2溶液0.6 μL、2.5 mmol/L dNTP溶液0.8 μL、33 ng/μL上下游引物各1.0 μL、2 U/μL Taq聚合酶（鼎國）0.25 μL、ddH2O 3.35 μL和模板DNA 1.0 μL。PCR反應條件和擴增產物的檢測遵循前期報道[30]，根據擴增產物片段大小分別采用6%非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳和銀染顯色或2%瓊脂糖凝膠分離和GelRed（Biotium）顯色。等位基因記錄以每個基因的抗性材料為對照，當檢測到對照等位基因片段時記為1，反之記為0。

2 結果與分析

2.1 白葉枯病抗性基因的檢測結果

Xa1是已克隆的NBS-LRR類白葉枯病抗病基因。在RM17499和RM3836座位上未檢測到和抗性對照具有相同等位基因的品種，在RM5473座位上檢測到8個秈稻品種具有和抗性對照相同的等位基因，分別為6個三系雜交稻母本（中100A、中1A、博B、金23B、印32B和中9B）和 2個三系雜交稻父本（CH238和CH59）。RM5473和其余2個分子標記的吻合度為92.2%。

xa5是已克隆的抗白葉枯病隱性基因。在RM17750和SSR16座位上，未檢測到與抗性對照IRBB5等位基因相同的水稻品種。在RM122標記座位上，共檢測到16個與抗性對照等位基因相同的水稻品種，與 RM17750和 SSR16檢測結果的吻合度為84.5%。

Xa7被定位在第6染色體長臂，具有廣譜抗性。檢測結果顯示，秈型三系雜交稻父本鎮(zhèn)恢084、秈型兩系雜交稻父本雙七占和秈型兩系雜交稻母本廣占63S分別在3個、2個和1個座位上檢測到與抗性對照相同的等位基因；另外，8個已定名的粳稻品種均在RM20595座位上呈現與抗性對照相同的等位基因。B7 和RM20591的吻合度為99.0%，RM20595和其他2個分子標記的吻合度均為89.3%。

xa13是另一個已克隆的隱性抗病基因，位于第8染色體長臂末端。4個連鎖標記的檢測結果差異較大：在SR11和SR6座位上，分別檢測到42個和86個水稻品種的等位基因與抗性對照相同；在RM447座位上，僅中恢161的等位基因與抗性對照相同。

表2 分子標記清單

Xa21是水稻中第1個被克隆的抗白葉枯病基因，來自于非洲長穗野生稻，具有廣譜抗性。僅5個品種在PTA248座位上檢測到與抗性對照相同的等位基因，分別為4個秈型三系雜交稻父本（中恢218、中恢111、中恢333和中恢8015）和1個秈型三系雜交稻不育系對應的保持系（中2B）。

Xa23是已克隆的來自普通野生稻的抗白葉枯病基因，具有廣譜抗性。在03STS1和RM206座位上均未檢測到與抗性對照具有相同等位基因的品種。

Xa26是已克隆的LRR類白葉枯病抗病基因，Xa4 是1個尚未被克隆的抗白葉枯病基因，被定位在Xa26附近，形成1個抗病基因簇[31]。在B4座位上，僅16個品種檢測到與抗性對照相同的等位基因，其中13個品種為秈稻，包括三系雜交稻母本3個（內香2A、天豐A和中浙A）、三系雜交稻父本6個（R402、中恢111、中恢1176、中恢333、中恢161和恢66）、常規(guī)稻2個（中香1號和中香98）和未定名品種Z13-1；另外，3個粳稻品種為兩系雜交稻母本廣占63S和父本雙七占以及三系雜交稻母本春江12A。

這8個白葉枯病抗性基因、16個標記的檢測結果及等位基因記錄見國家水稻數據中心數據庫（http://www.ricedata.cn/marker/xassr.htm）。

2.2 稻瘟病抗性基因的檢測結果

Pib是第1個被克隆的抗稻瘟病基因。通過1對互補性顯性基因標記Pibdom/Lys145檢測，有44個品種的等位基因與抗性對照相同；在連鎖標記RM208座位上檢測到41個品種與抗性對照具有相同等位基因。在2個座位上存在差異的3個品種中，未定名品種Z11-1 在RM208座位與抗性對照一致，中恢8012和廣恢128則在Pibdom/Lys145座位上與抗性對照具有相同表現。

Pi2和Pi9是兩個已被克隆的主效廣譜抗稻瘟病基因，處于同一個NBS-LRR基因簇內。在NBS2-Pi9座位上檢測到22個與抗性對照具有相同等位基因的品種，在PB9-1座位上檢測到18個與抗性對照具有相同等位基因的品種，在標記195座位上檢測到22個品種與抗性對照帶型相同。其中，有13個品種在3個座位上均與抗性對照相同，表明這些品種可能同時攜帶Pi2和Pi9，包括8個秈型三系雜交稻母本（川香29A、豐源A、內香2A、D優(yōu)62B、V20B、菲改20B、協青早B和中2B）、1個秈型三系雜交稻父本（先恢207）、2個秈型兩系雜交稻母本（株1S和C815S）和2個秈型常規(guī)稻（中佳早32和中鑒100）。

Pi25是從谷梅2號中鑒定出的一個具有穩(wěn)定廣譜抗性的抗稻瘟病基因。CAP3/BglⅡ是Pi25的功能標記，在該座位上未檢測到與抗性對照相同的等位基因。在與Pi25連鎖的4個座位上，有9個品種的等位基因均與抗性對照相同，包括4份常規(guī)粳稻（秀水04、春江051、春江057和日本晴）、2份粳型三系雜交稻母本（春江12A和春江16A）、1份粳型三系雜交稻父本（CH89）和2份未定名品種。

Pita是另一個已被克隆的廣譜抗稻瘟病基因。在顯性標記YL155/YL87（檢測抗病等位基因）和YL183/ YL87（檢測感病等位基因）座位上，有33個品種檢測到與抗性對照相同的等位基因，包括秈型三系雜交稻母本2份（內香2A和中3B）、秈型三系雜交稻父本20份、秈型兩系雜交稻母本1份（株1S）、秈型兩系雜交稻父本1份（雙七占）、粳型常規(guī)稻3份（秀水04、春江051和春江057）、粳型三系雜交稻母本2份（春江12A和春江16A）和粳型三系雜交稻父本1份（CH89）。

這5個稻瘟病抗性基因、13個標記的檢測結果及等位基因記錄見國家水稻數據中心數據庫（http://www.ricedata.cn/marker/pissr.htm）。

3 討論

基因型和表型之間的吻合度與檢測所用的分子標記和基因的物理位置有關。一般認為，在基因內部的標記吻合度最高，其次，離基因較近或在基因兩側的標記檢測結果也具有很高的參考價值[32]。在前期工作中，筆者應用檢測Xa4、Xa21、xa5、xa13和Pi25的連鎖標記進行分子標記輔助育種，成功選育出聚合了多個有利基因的候選恢復系[33]，初步驗證了所用分子標記可以用于抗性基因的篩選。

在檢測的103個水稻品種中，秈型三系雜交稻母本內香2A可能攜帶6個抗性基因，分別為Xa4、xa13、 Pib、Pi2、Pi9和Pita；秈型三系雜交稻父本先恢207可能攜帶5個抗性基因，與內香2A相比少了Xa4。通過查詢“中國水稻品種及其系譜數據庫（http://www.ricedata.cn/variety/）”，發(fā)現這2個品種在新品種選育中作為基礎材料發(fā)揮了重要作用。如內香6A、內香7A、內香8A和內香9A均是以內香2A為背景進行改良育成，另外，以內香2A為母本培育了國稻6號、內香2002、內2優(yōu)3015、內香2128和內香18等12個秈型三系雜交稻品種；以先恢207為基礎材料選育了秈型三系雜交稻父本先恢207選和RB207-1，并與不育系配組獲得了Ⅱ優(yōu)207、湘優(yōu)207、宜優(yōu)207和T優(yōu)207等約20個秈型三系雜交稻品種。這些成果說明，通過抗性基因分布初探有機會篩選到很好的基礎材料。

另外，部分基因在這103份水稻品種中檢測到的頻率很低。在CAP3/BglⅡ（Pi25）、RM17750（xa5）和03STS1（Xa23）座位上沒有檢測到與抗性對照相同的等位基因，在RM20591（Xa7）和PTA248（Xa21）座位上僅分別檢測到2個和5個品種與抗性對照攜帶相同的等位基因。這種頻率分布可能與基因來源有關。上述5個基因中，Xa21和Xa23分別來自非洲長穗野生稻和普通野生稻，xa5和Xa7來源于孟加拉和尼泊爾[34]，Pi25來源于地方品種谷梅2號[35]。在以往品種選育過程中，可能受地域或供體性狀等方面的影響，抗性基因的傳播應用受到了限制。本研究為這些基因的進一步應用提供了重要的參考。

[1]吳建利，莊杰云，李德葆，等.水稻對稻瘟病抗性的分子生物學研究進展[J].中國水稻科學，1999，13（2）：123-128.

[2]章琦.水稻白葉枯病抗性的遺傳及改良[M].北京：科學出版社，2007：1-2.

[3] Ashkani S,Rafii M Y,Shabanimofrad M,et al.Molecular progress on the mapping and cloning of functional genes for blast disease in rice （Oryza sativa L.）：current status and future considerations[J].Crit Rev Biotechnol，2016，32（2）：353-367.

[4]朱玉君，樊葉楊，黃得潤，等.分子標記輔助選擇在水稻育種中的應用[J].核農學報，2012，26（5）：756-761.

[5] Jiang J,Mou T,Yu H,et al.Molecular breeding of thermo-sensitive genic male sterile（TGMS）lines of rice for blast resistance using Pi2 gene[J].Rice，2015，8：11.

[6] Pradhan S K,Nayak D K,Mohanty S,et al.Pyramiding of three bacterila blight resistance genes for broad-spectrum resistance in deepwater rice variety,Jalmagna[J].Rice,2015,8:19.

[7] Luo Y C,Sangha J S,Wang S H,et al.Marker-assisted breeding of Xa4,Xa21 and Xa27 in the restorer lines of hybrid rice for broadspectrum and enhanced disease resistance to bacterial blight[J].Mol Breeding,2012,30（4）:1 601-1 610.

[8]時克，雷財林，程治軍，等.稻瘟病抗性基因Pita和Pib在我國水稻主栽品種中的分布 [J].植物遺傳資源學報，2009，10（1）：21-26.

[9]李進斌，李成云，陳艷，等.二十二個抗稻瘟病基因在云南的利用價值評價[J].植物保護學報，2005，32（2）：113-119.

[10]高利軍，高漢亮，顏群，等.4個抗稻瘟病基因分子標記的建立及在水稻親本中的分布[J].雜交水稻，2010（S1）：294-298.

[11]莊杰云，施勇烽，應杰政，等.中國主栽水稻品種微衛(wèi)星標記數據庫的初步構建[J].中國水稻科學，2006，20（5）：460-468.

[12]Blair M W,Garris A J,Iyer A S,et al.High resolution genetic mapping and candidate gene identification at the xa5 locus for bacterial blight resistance in rice（Oryza sativa L.） [J].Theor Appl Genet, 2003,107:62-73.

[13]鐘義明，江光懷，陳學偉，等.水稻含隱性抗白葉枯病基因xa5的24 kb片段的鑒定與基因預測 [J].科學通報，2003，48（19）：2 057-2 061.

[14]Porter B W,Chittoor J M,Yano M,et al.Development and mapping of markers linked to the rice bacterial blight resistance gene Xa7[J].Crop Sci,2003,43:1 484-1 492.

[15]Chen S,Huang Z,Zeng L,et al.High-resolution mapping and gene prediction of Xanthomonas Oryzae pv.Oryzae resistance gene Xa7 [J].Mol Breeding,2008,22:433-441.

[16]Chu Z,Fu B,Yang H,et al.Targeting xa13,a recessive gene for bacterial blight resistance in rice[J].Theor Appl Genet,2006,112（3）: 455-461.

[17]Huang N,Angeles E R,Domingo J,et al.Pyramiding of bacterial blightresistance genes in rice:marker-assisted selection using RFLP and PCR[J].Theor Appl Genet,1997,95:313-320.

[18]樊穎倫，陳學偉，王春連，等.水稻抗白葉枯病基因Xa23的RFLP標記定位及其STS標記的轉化[J].作物學報，2006，32（6）：931-935.

[19]潘海軍，王春連，趙開軍，等.水稻抗白葉枯病基因Xa23的PCR分子標記定位及輔助選擇[J].作物學報，2003，29（4）：501-507.

[20]馬伯軍，王文明，趙彬，等.水稻抗白葉枯病基因Xa4的PCR標記研究[J].遺傳，1999，21（3）：9-12.

[21]Fjellstrom R,Conaway-Bormans C A,McClung A M,et al.Development of DNA markers suitable for marker assisted selection of three Pi genes conferring resistance to multiple Pyricularia grisea Pathotypes[J].Crop Sci,2004,44:1790-1798.

[22]劉洋，徐培洲，張紅宇，等.水稻抗稻瘟病Pib基因的分子標記輔助選擇與應用[J].中國農業(yè)科學，2008，41（1）：9-14.

[23]Zhou B,Qu S,Liu G,et al.The eight amino-acid differences within three leucine-rice repeats between Pi2 and Piz-t resistance proteins determine the resistance specificity to Magnaporthe grisea[J].Mol Plant Microbe Interact,2006,19（11）:1216-1228.

[24]殷得所，夏明元，李進波，等.抗稻瘟病基因Pi9的STS連鎖標記開發(fā)及在分子標記輔助育種中的應用 [J].中國水稻科學，2011，25（1）：25-30.

[25]Qu S,Liu G,Zhou B,et al.The broad-spectrum blast resistance gene Pi9 encodes a nucleotide-binding site-leucine repeat protein and is a member of a multigene family in rice[J].Genetics,2006,172（3）: 1 901-1 914.

[26]王惠梅，陳潔，施勇烽，等.稻瘟病抗性基因Pi25特異性CAPS標記的開發(fā)與驗證[J].作物學報，2012，38（11）：1 960-1 968.

[27]朱玉君，莊杰云，樊葉楊，等.檢測抗稻瘟病等位基因的特異性PCR分子標記[P]：中國，ZL200910155609.5.2012年10月3日.

[28]Wang Z,Jia Y,Rutger J N,et al.Rapid survey for presence of a blast resistance gene Pita in rice cultivars using the dominant DNA markers derived from portions of the Pita gene[J].Plant Breeding,2007, 126:36-42.

[29]Zheng K L,Huang N,Bennett,et al.PCR-based marker-assisted selection in rice breeding[J].IRRI discussion paper series NO.12.Philippines:International Rice Research Institute,1995:24.

[30]施勇烽，應杰政，王磊，等.鑒定水稻品種的微衛(wèi)星標記篩選[J].中國水稻科學，2005，19（3）：195-201.

[31]Sun X,Yang Z,Wang S,et al.Identification of a 47-kb DNA fragment containing Xa4,a locus for bacterial blight resistance in rice [J].Theor Appl Genet,2003,106（4）:683-687.

[32]陳志偉，官華忠，吳為人，等.稻瘟病抗性基因Pi-1連鎖SSR標記的篩選和應用 [J].福建農林大學學報：自然科學版，2005，34 （1）：74-77.

[33]朱玉君，樊葉楊，王惠梅，等.應用分子標記輔助選擇培育兼抗稻瘟病和白葉枯病的水稻恢復系 [J].分子植物育種，2014，12（1）：17-24.

[34]Busto G A,Ogawa Jr T,Endo N,et al.Distribution of genes for resistance to bacterial blight of rice in Asian countries[J].Rice Genet Newslett,1990,7:127.

[35]彭紹襲，黃費元，孫國昌，等.水稻品種在不同緯度下持久抗瘟性的研究[J].中國農業(yè)科學，1996，9（2）：52-56.

Genotyping of 103 Parents of Hybrid Rice Using DNA Markers for Bacterial Blight and Blast Resistance Genes

WANG Zhen,FAN Yeyang,ZHUANG Jieyun,ZHU Yujun*
（Chinese National Center for Rice Improvement/State Key Laboratory of Rice Biology,China National Rice Research Institute,Hangzhou 310006,China;*Corresponding author:yjzhu2013@163.com）

The rice blast and bacterial blight are two of the most serious disease in rice production.The use of resistance genes in rice breeding has been known to be an efficient approach for rice protection,which requires an understanding the allelic distribution of the resistance genes in rice germplasm.The objective of this study is to determine the allelic variation of 13 resistance genes in 103 parental lines of hybrid rice，including 8 genes for bacterial blight resistance（Xa1,Xa4,xa5,Xa7,xa13,Xa21,Xa23 and Xa26）and 5 ones for blast resistance（Pib,Pi2,Pi9,Pi25 and Pita）.29 DNA markers determining the 13 genes were used for genotyping.The information could be useful in the processing of variety improvement.

Oryza sativa L;bacterial blight;rice blast;resistance gene;DNA marker

S511；S435.111.4+2；S435.111.4+7

A

1006-8082（2016）06-0020-05

2016－09－18

國家“863”計劃（2014AA10A603）；中央級公益性科研院所基本業(yè)務費專項（2014RG003-1）