楊 雪， 李云亮， 王禹程， 黃姍芬， 馬海樂

(江蘇大學食品與生物工程學院， 江蘇鎮(zhèn)江 212013)

Note:* stands for significant difference compared with male rats in control group(P<0.05); ** stands for extremely significant difference compared with male rats in control group(P<0.05).

Note:** stands for extremely significant difference compared with male rats in control group(P<0.05).

Note:* stands for significant difference compared with female rats in control group(P<0.05).

Note: * stands for significant difference compared with rats with the same sex in control group(P<0.05); ** stands for extremely significant difference compared with rats with the same sex in control group(P<0.01).

Note:* stands for significant difference compared with rats with the same sex in control group(P<0.05); ** stands for extremely significant difference compared with rats with the same sex in control group(P<0.05).

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脫毒菜籽多肽對大鼠的亞慢性毒性研究

楊 雪， 李云亮， 王禹程， 黃姍芬， 馬海樂*

(江蘇大學食品與生物工程學院， 江蘇鎮(zhèn)江 212013)

[目的]通過對大鼠的90 d喂養(yǎng)試驗，評價脫毒菜籽多肽的食用安全性。[方法]將動物隨機分為4組，分別為低、中、高劑量組和對照組。試驗組分別在基礎飼料中添加1.65、3.30和6.60 g/kg脫毒菜籽多肽，按80 g/kg的日攝入量以自由采食的方式喂養(yǎng)大鼠90 d，觀察脫毒菜籽多肽對大鼠體重、進食量、食物利用率、血清學、臟器系數以及組織病理學等指標的影響。[結果]與對照組相比，各劑量組大鼠體重、進食量、食物利用率、臟器絕對重量和臟體比均無顯著差異(P>0.05)，大鼠血液學指標檢測值、生化指標檢測值均在正常范圍內；高劑量組各大鼠臟器均未出現(xiàn)明顯的組織病理變化。[結論]脫毒菜籽多肽對大鼠的生長發(fā)育、血漿、生化功能及臟體比等指標均未見不良影響。

脫毒菜籽多肽；喂養(yǎng)試驗；組織學檢查；血液學指標；血清生化指標

我國是菜籽粕生產第一大國，每年可產800萬t以上[1]，且價格較低，期貨價格在2 500元/t上下波動。菜籽蛋白占菜籽餅粕的30%以上，為全價蛋白質，且其營養(yǎng)價值與大豆蛋白和酪蛋白相接近[2-3]，含有豐富的人體必需氨基酸，是一種理想的、潛在的優(yōu)質蛋白資源，具有較高的開發(fā)利用價值[4-5]，精深加工菜籽蛋白已成為充分利用優(yōu)質蛋白質的新熱點。

由于菜籽餅粕中的一些有毒成分和抗營養(yǎng)成分的存在，包括硫甙及其代謝衍生物、植酸、單寧和芥子堿等，影響了其蛋白質的消化吸收及利用。因此，菜籽餅粕只能在飼料中少量添加或脫毒后使用。常見的脫毒方法包括物理脫毒法、化學脫毒法和生物脫毒法，其中化學脫毒方法脫毒較為徹底。蘭文菊等[6]研究表明使用硫酸溶液脫毒后菜籽粕中植酸、單寧、硫代葡萄糖苷、異硫氰酸酯和噁唑烷硫酮的脫除率均高于90%，且蛋白質含量升高、氨基酸組成基本維持不變。因此，采用酸浸溶法脫毒后的菜籽蛋白，再經過堿溶酸沉的方法提取蛋白后可獲得優(yōu)質的脫毒菜籽蛋白，目前許多研究者基于脫毒菜籽蛋白制備了具有多種生物學功能的多肽[7]。

多肽是比蛋白質結構更簡單、分子量小、由氨基酸通過肽鏈相連的一類化合物，具有調節(jié)機體生理功能和為機體提供營養(yǎng)的雙重功效，它幾乎影響著人體的所有代謝合成[8]。研究表明，某些多肽不僅能提供人體生長發(fā)育所需的營養(yǎng)物質，而且具有防病治病、調節(jié)人體生理機能的功效，具有一些原食品蛋白質或其組成氨基酸所不具備的獨特的生物活性[9-10]。利用酶解或水解法制備菜籽多肽是開發(fā)與利用菜籽蛋白資源的重要途徑之一[11-12]。然而，長期食用脫毒后的菜籽多肽是否會對機體產生毒副作用還有待進一步探索。筆者通過大鼠的90 d喂養(yǎng)試驗，研究了脫毒菜籽多肽對動物機體的亞慢性毒性，旨在為脫毒菜籽多肽作為保健食品進行開發(fā)提供科學依據。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 脫毒菜籽多肽。脫毒菜籽多肽購自江蘇天琦生物科技有限公司，多肽含量≥85%。

1.1.2 主要儀器和試劑。生化試劑盒；自動生化分析儀、血細胞分析儀、病理切片機、離心機等。

1.1.3 實驗動物。4周齡健康SD大鼠，雌雄各48只，共90只，由上海斯萊克實驗動物有限責任公司提供，清潔級，動物生產許可證號為SCXK(滬)2012-0002號。實驗動物屏障環(huán)境設施的使用許可證號為SYXK(蘇)2012-0037號，雌雄大鼠進室適應3 d后分性別按體重分成4組，每組12只，均單籠飼養(yǎng)，無菌水自由飲用。

1.2 試驗方法

1.2.1 動物分組及受試物劑量。脫毒菜籽多肽推薦劑量為22.00 mg/kg，設置高劑量組(6.6 g/kg)以及中劑量組(3.30 g/kg)和低劑量組(1.65 g/kg)。分別稱取82.500、41.250和20.625 g脫毒菜籽多肽拌入滅菌基礎鼠飼料(購自蘇州雙獅實驗動物飼料科技有限公司，合格證號為蘇飼審(2009)05032號)，按80 g/kg 的日攝入量給予大鼠自由食用，飼養(yǎng)90 d。

1.2.2 生長發(fā)育情況觀察。每天觀察大鼠的排便、進食及活動等情況2次，視納食情況調整喂食量，每7 d稱1次體重和2次食物攝入量，計算每周及總的食物利用率及實際平均每天攝入受試物的劑量。

1.2.3 樣本采取及測定指標。飼養(yǎng)中期對大鼠內呲靜脈采血，測其血紅蛋白、血小板、紅細胞、白細胞總數及分類，結束時取血，進行大體解剖檢查，取臟器稱重，固定并保存。對大鼠血紅蛋白、血小板、紅細胞、白細胞總數及分類、腦、心臟、肝、脾、肺、腎、腎上腺、胸腺、睪丸、卵巢絕對重量和臟體比、丙氨酸氨基轉移酶(ALT)、天門冬氨酸氨基轉移酶(AST)、總蛋白(TP)、白蛋白(ALB)、血糖(GLU)、尿素氮(BUN)、肌酐(CRE)、總膽固醇(CHO)、甘油三酯(TG)進行測定，90 d喂養(yǎng)試驗結束后對大鼠進行大體解剖，并對其腦、心臟、肝、脾、肺、腎、腎上腺、胸腺、胃、十二指腸、睪丸、卵巢、子宮進行組織切片病理學檢查。

1.3 數據統(tǒng)計與分析 各項測定指標均使用SPSS 16.0統(tǒng)計軟件進行單因素方差分析，方差不齊先進行變量轉換，仍不齊改用秩和檢驗分析。

2 結果與分析

2.1 大鼠的生長發(fā)育 90 d喂養(yǎng)期間，各組大鼠生長發(fā)育良好，皮毛濃密有光澤，飲食、行為、精神狀態(tài)等未見異常，試驗期間無1例動物死亡。

2.2 脫毒菜籽多肽對大鼠體重的影響 試驗開始前測定大鼠始重，并于試驗開始后測定每周大鼠的體重。由表1可知，各劑量組雌雄不同時間大鼠的體重與對照組相比均無顯著差異(P>0.05)。這說明不同用量的脫毒菜籽多肽對雄性和雌性大鼠均無毒性。

表1 脫毒菜籽多肽對大鼠體重的影響

2.3 脫毒菜籽多肽對大鼠進食量和食物利用率的影響 由表2和表3可知，43～49 d因喂養(yǎng)過程中期對大鼠內眥靜脈采血測定血液學指標，導致試驗組與對照組雌雄大鼠的食物利用率均出現(xiàn)下降現(xiàn)象。此外，其他組雌雄大鼠每周進食量及總進食量、每周食物利用率及總食物利用率與對照組相比均無顯著差異(P>0.05)。

表2 脫毒菜籽多肽對大鼠每周進食量和總進食量的影響

2.4 脫毒菜籽多肽對大鼠血細胞計數和白細胞分類的影響 分別于試驗中期和末期，通過對大鼠內呲靜脈采血測定血紅蛋白、血小板、紅細胞、白細胞總數及分類。由表4和表5可知，喂養(yǎng)中期低劑量組、高劑量組雄性大鼠HGB降低，喂養(yǎng)末期高劑量組雄性大鼠的血小板計數(PLT)升高，與對照組相比差異顯著(P<0.01)，但數值均在正常范圍內[13-14]，且無劑量-反應關系，故不認為具有生物學意義。其他劑量組各指標與對照組相比，均無顯著差異(P>0.05)。

由表6和表7可知，喂養(yǎng)中期、喂養(yǎng)末期雌雄大鼠白細胞分類的有些指標與對照值相比差異有顯著性(P<0.05,P<0.01)，但數值均在正常值范圍內[13-14]，且無劑量-反應關系，故不認為具有生物學意義。其他劑量組各指標與對照組相比，均無顯著差異(P>0.05)。

表3 脫毒菜籽多肽對大鼠食物利用率的影響

表4 脫毒菜籽多肽對喂養(yǎng)中期大鼠血細胞計數的影響

注：*表示與對照組雄性大鼠相比差異顯著(P<0.05)；**表示與對照組雄性大鼠差異極顯著(P<0.01)。

Note:*stands for significant difference compared with male rats in control group(P<0.05);**stands for extremely significant difference compared with male rats in control group(P<0.05).

表5 脫毒菜籽多肽對喂養(yǎng)末期大鼠血細胞計數的影響

注：**表示與對照組雄性大鼠差異極顯著(P<0.05)。

Note:**stands for extremely significant difference compared with male rats in control group(P<0.05).

%

注：*表示與對照組雌性大鼠差異顯著(P<0.05)。

Note:*stands for significant difference compared with female rats in control group(P<0.05).

2.5 脫毒菜籽多肽對大鼠血清生化指標的影響 試驗結束后采血，測定大鼠的血清生化指標。由表8可知，與對照組相比，低劑量組雌性大鼠的血糖(GLU)升高，低、中劑量組雄性大鼠的總蛋白(TP)降低，低劑量組雄性大鼠的白蛋白(ALB)降低，差異均達到顯著水平(P<0.05,P<0.01)，但數值均在正常范圍內[13-14]，且無劑量-反應關系，故不認為具有生物學意義。其他劑量組雌雄大鼠的生化指標與對照組相比均無顯著差異(P>0.05)。

%

注：*表示與相同性別對照組大鼠差異顯著(P<0.05)；**表示與相同性別對照組大鼠差異極顯著(P<0.01)。

Note:*stands for significant difference compared with rats with the same sex in control group(P<0.05);**stands for extremely significant difference compared with rats with the same sex in control group(P<0.01).

表8 脫毒菜籽多肽對大鼠血清生化指標的影響

注：*表示與相同性別對照組大鼠差異顯著(P<0.05)；**表示與相同性別對照組大鼠差異極顯著(P<0.05)。

Note:*stands for significant difference compared with rats with the same sex in control group(P<0.05);**stands for extremely significant difference compared with rats with the same sex in control group(P<0.05).

2.6 脫毒菜籽多肽對大鼠臟器絕對重量和臟器比的影響 試驗結束后，對大鼠進行大體解剖檢查，取臟器稱重，固定、保存，分別測定大鼠臟器絕對重量和臟器比。由表9和表10可知，各劑量組雌雄大鼠臟器絕對重量、臟體比與對照組相比均無顯著差異(P>0.05)。

表9 脫毒菜籽多肽對大鼠臟器絕對重量的影響

%

2.7 大體解剖和組織學檢查 對大鼠進行大體解剖，對照組出現(xiàn)1例雄鼠局部肝細胞輕度脂肪變性、1例雌鼠肺左葉局部血管輕度充血，局部間質炎細胞浸潤、1例雄鼠腎上腺皮質區(qū)束狀帶細胞輕度空泡變性。高劑量組出現(xiàn)1例雄鼠局部心肌炎細胞浸潤、1例雄鼠局部肝細胞輕度脂肪變性、雌鼠1例肺左葉局部間質輕度炎細胞浸潤，雌鼠1例左肺局部間質血管輕度出血。此外，對照組和高劑量組大鼠的大腦、小腦、脾臟、腎、胸腺、胃、十二指腸、卵巢、子宮睪丸均未見明顯異常。

2.8 各試驗組大鼠實際攝入受試物劑量 通過90 d喂養(yǎng)試驗結束后，計算大鼠平均每天受試物的攝入量。由表11可知，雌性大鼠平均每天受試物的攝入量略高于設定的劑量，而雄性大鼠則略有降低。

表11 大鼠實際攝入脫毒菜籽多肽劑量

3 討論與結論

大量研究表明，菜籽多肽具有多種生物學活性，除了降血壓[15-17]、清除體內自由基、具有抗氧化作用[18-19]外，菜籽多肽還具有醒酒[20]、抗凝血[21]、抗腫瘤和增強免疫力[22]等功能。經過脫毒后的菜籽蛋白是一種非常好的資源，長期服用菜籽多肽是否具有毒性尚未確定。為探討脫毒菜籽多肽長期服用的安全性，筆者通過90天喂養(yǎng)試驗對脫毒菜籽多肽的亞慢性毒性進行了研究，觀察了受試物以不同劑量水平經長期喂養(yǎng)后對動物的毒性作用性質和靶器官，并初步確定最大無毒副作用劑量。該試驗結果表明，試驗期內各劑量組大鼠生長發(fā)育良好，體重增重、食物利用率、血常規(guī)、血生化、臟器系數等各項指標均在正常值范圍內，與對照組之間差異均無統(tǒng)計學意義,經病理組織學檢查，各劑量組也未發(fā)現(xiàn)受試物質造成的病理學改變和損傷。

該試驗結果表明，脫毒菜籽多肽對大鼠90 d喂養(yǎng)試驗各項指標均未見明顯毒性反應,最大無作用劑量為6.6 g/kg,已達到人體推薦每日攝入量的300倍。在該試驗條件下長期服用脫毒菜籽多肽對機體并無明顯不良反應，但由于實驗動物種類的局限性和試驗時間的限制，對脫毒菜籽多肽食用安全性的評價還需要進行更加深入和長期的試驗研究。參考文獻

[1] 劉敏佳.菜子粕的抗營養(yǎng)因子及其脫毒研究進展[J].湖北畜牧獸醫(yī),2016,37(3) :9-12.

[2] YOSHIE-STARK Y,WADA Y,SCHOTT M,et al.Functional and bioactive properties of rapeseed protein concentrates and sensory analysis of food application with rapeseed protein concentrates [J].LWT-Food Science and Technology,2006,39(5):503-512.

[3] FLEDDERMANNA M，F(xiàn)ECHNERA A，R?BLER A,et al.Nutritional evaluation of rapeseed protein compared to soy protein for quality,plasma amino acids,and nitrogen balance：A randomized cross-over intervention study in humans[J].Clinical nutrition,2013,32(4):519-526.

[4] 付敏,何軍,余冰,等.混菌固態(tài)發(fā)酵對菜籽餅營養(yǎng)價值及抗營養(yǎng)因子含量的影響[J].動物營養(yǎng)學報,2013,25(7):1579-1586.

[5] PASTUSZEWSKA B,JABLECKI G,SWIECH E,et al.Nutritional value of rapeseed meal containing lecithin gums precipitated with citric acid[J].Animal feed science and technology,2000,86(1):117-123.

[6] 蘭文菊,彭密軍,彭勝,等.酸溶液對菜籽粕脫毒工藝探討[J].中國糧油學報,2012,27(11):67-71.

[7] 王雪峰.混菌固態(tài)發(fā)酵生產菜籽肽的研究[D].南京:南京財經大學,2012:20-24.

[8] 劉清,謝奇珍,師建芳,等.菜籽蛋白活性肽研究[J].糧食與油脂,2008(3):4-6.

[9] MORA L，ARISTOY M C，TOLDRF.Bioactive peptides in foods[M]//GASPAR S,RAMOS F.Encyclopedia of food and health.Oxford:Elsevier Ltd.,2016:395-400.

[10] SINGH B P,VIJ S,HATI S.Functional significance of bioactive peptides derived from soybean[J].Peptides,2014,54(2):171-179.

[11] XIE N N,HUANG J J,LI B,et al.Affinity purification and characterisation of zinc chelating peptides from rapeseed protein hydrolysates:Possible contribution of characteristic amino acid residues[J].Food chemistry,2015,173:210-217.

[12] 杜冬梅,郭華,鄒正.酶解菜籽粕制備多肽的研究[J].現(xiàn)代食品科技,2011,27(11):1344-1348.

[13] WANG X,HE X,ZOU S,et al.A subchronic feeding study of dicamba-tolerant soybean with the dmo gene in Sprague-Dawley rats[J].Regulatory toxicology and pharmacology,2016,77:134-142.

[14] ZHU Y X,HE X Y,LUO Y B,et al.A 90-day feeding study of glyphosate-tolerant maize with theG2-aroAgene in Sprague-Dawley rats[J].Food and chemical toxicology,2013,51:280-287.

[15] 何榮,鞠興榮.菜籽蛋白水解物及其膜分離組分的降血壓相關活性[J].食品科學,2013,34(15):57-61.

[16] 張艷.菜籽餅粕蛋白酶法制備ACE抑制肽研究[D].武漢：武漢工業(yè)學院,2012：8-21.

[18] 秦曉佩,余筱潔,楊華,等.菜籽餅粕蛋白模擬胃腸消化過程抗氧化研究[J].中國糧油學報,2016,31(1):21-26.

[19] 張晶,張怡一,徐斐然,等.菜籽多肽體外和細胞內抗氧化性評價及氨基酸分析[J].食品科學,2016,37(13):36-41.

[20] 王微星.菜籽蛋白的制備及其酶解產物的醒酒功效[D].金華：浙江師范大學,2012：38-44.

[21] 王子偉.菜籽肽的酶法制備及其抗凝血活性研究[D].鄭州：河南工業(yè)大學,2014：39-54.

[22] 薛照輝,尉萬聰,吳謀成,等.菜籽肽抑制腫瘤作用和對免疫功能的影響[J].中國糧油學報,2007,22(1):73-75.

Study on Subchronic Toxicity of Detoxification Rapeseed Peptide on Rats

YANG Xue,LI Yun-liang,WANG Yu-cheng,MA Hai-le*et al

(School of Food and Biological Engineering,Jiangsu University,Zhenjiang,Jiangsu 212013)

[Objective] To access sinchronic toxicity of detoxification rapeseed peptides,ninty days feeding study of rats were researched.[Method] Experimental animals were divided into four groups,including low-dosage,middle-dosage and high-dosage group and control group.According to the daily free feed intake of 80 g/kg, basic feed in experimental group were added with 1.65,3.30,6.60 g/kg dose detoxification rapeseed peptides respectively,for 90 days to observe effects of detoxification rapeseed peptides on rat weight,feed intake,food utilization rate,serology indexes,organ coefficient and tissue pathology.[Result]Compared with control group,there were no significant difference (P>0.05) of weight,feed intake,food utilization rate,absolute visceral organ weight and organ/body weight ratio in each dosage group,and hematology and biochemical index of rats were within normal range; In high-dosage group,there was no obviously histopathologic change of rat visceral organ.[Conclusion] Detoxification rapeseed peptides had no adverse effects on the growth and development,plasma,biological function,organ/body weight ratio of rats.

Detoxification rapeseed peptide;Feeding test;Histological examination; Hematology index; Blood biochemical index

國家高技術研究發(fā)展計劃項目(2013AA102203)；江蘇大學高級人才科研啟動基金項目(16JDG049)。

楊雪(1989- )，女，河北承德人，博士研究生，研究方向：多肽提取與功能評價。*通訊作者，教授，博士生導師，從事功能食品、食品物理學加工方法及裝備開發(fā)研究。

2016-08-31

S 865.1

A

0517-6611(2016)33-0148-05