陳 蘭，胡 沙 ，李素萍△

(1.湖北民族學(xué)院附屬民大醫(yī)院婦科，湖北恩施 445000；2.華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院附屬協(xié)和醫(yī)院，武漢 430022)

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白藜蘆醇對(duì)卵泡顆粒細(xì)胞線粒體的調(diào)節(jié)作用及人工輔助生殖效果的影響

陳 蘭1，胡 沙2，李素萍1△

(1.湖北民族學(xué)院附屬民大醫(yī)院婦科，湖北恩施 445000；2.華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院附屬協(xié)和醫(yī)院，武漢 430022)

目的 探討口服白藜蘆醇對(duì)卵泡顆粒細(xì)胞線粒體功能及人工輔助生殖技術(shù)(ART)效果的影響。方法 研究入組受試對(duì)象109例，其中，對(duì)照組59例，白藜蘆醇組50例。分析其顆粒細(xì)胞氧化應(yīng)激水平和線粒體功能，檢測(cè)胚胎發(fā)育和妊娠結(jié)局相關(guān)指標(biāo)及不良反應(yīng)。結(jié)果 白藜蘆醇使顆粒細(xì)胞的還原型輔酶Ⅱ(NADPH)氧化活性下降了28.57%(P<0.05)，同時(shí)也降低了丙二醛(MDA)水平(0.653±0.084)nmol/mL vs. (0.382±0.052)nmol/mL，(P<0.05)。白藜蘆醇增加了線粒體DNA(mtDNA)拷貝數(shù)(4.62±0.24)×105vs. (5.77±0.38)×105，(P<0.05)和ATP生成(2.516±0.160)pmol vs. (4.484±0.180)pmol，(P<0.05)。白藜蘆醇組較之對(duì)照組其卵成熟率(87.75% vs. 94.15%，P<0.05)、受精率(86.69% vs. 91.49%，P<0.05)和優(yōu)質(zhì)胚胎率(44.30% vs. 51.22%，P<0.05)均顯著提高，且尚未發(fā)現(xiàn)有明顯的不良反應(yīng)。結(jié)論 白藜蘆醇可能對(duì)提高ART的成功率具有一定的輔助作用。

人工輔助生殖技術(shù)；白藜蘆醇；顆粒細(xì)胞

人工輔助生殖技術(shù) (assisted reproductive technology,ART) 是目前治療不孕不育的重要方法之一。目前，全球1.1%～2.0%的新生兒依靠輔助生殖技術(shù)出生，這一技術(shù)的發(fā)展還在不斷的進(jìn)展中[1]。在ART的開(kāi)展過(guò)程中，顆粒細(xì)胞 (granulosa cells,GCs) 對(duì)胚胎著床率和妊娠率具有重要的作用。顆粒細(xì)胞是組成卵泡的主要細(xì)胞成分，調(diào)節(jié)了卵母細(xì)胞的成熟及其胞核和胞質(zhì)的正常分裂。而顆粒細(xì)胞線粒體的功能與卵母細(xì)胞的質(zhì)量，以及女性生育能力具有密切的關(guān)系[2-3]。因此，調(diào)節(jié)線粒體功能可能是改善卵母細(xì)胞活性和提高ART成功率的有效途徑之一。白藜蘆醇(resveratrol,Res)是一種富含于桑葚、花生和葡萄等植物果實(shí)內(nèi)的天然小分子多酚類(lèi)物質(zhì)，具有抗氧化、調(diào)節(jié)線粒體功能的作用[4]。有研究顯示，Res對(duì)于體外培養(yǎng)的卵泡及受精卵均有正向的調(diào)節(jié)作用[5-6]，而口服Res對(duì)于顆粒細(xì)胞的作用及對(duì)ART成功率的影響尚鮮有報(bào)道。因此，本研究將就口服Res對(duì)志愿者卵泡顆粒細(xì)胞線粒體功能及ART的效果進(jìn)行探討，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 研究選擇2010年9月至2012年4月來(lái)武漢協(xié)和醫(yī)院輔助生殖中心接受ART的患者120名，分為對(duì)照組和Res組各60名，均采用常規(guī)體外受精-胚胎移植術(shù)(IVF-ET)。所有入組對(duì)象均經(jīng)過(guò)腹腔鏡、子宮輸卵管造影術(shù)、生殖內(nèi)分泌檢查、精液檢查、遺傳學(xué)檢查及B超等相關(guān)檢查，證實(shí)不育原因主要為輸卵管盆腔因素、子宮內(nèi)膜異位癥、多囊卵巢綜合征，符合IVF-ET術(shù)的適應(yīng)證，并排除泌尿生殖系統(tǒng)感染、性傳播疾病、遺傳疾病、子宮疾患等禁忌證，排除男性少弱精癥或無(wú)精癥等對(duì)研究結(jié)果有影響的男方因素?；颊呔幸庠附邮躀VF-ET術(shù)，并告知藥物可能產(chǎn)生的不良反應(yīng)，簽署知情同意書(shū)，告知受試對(duì)象在該項(xiàng)研究中具有自主權(quán)。Res組給予Res膠囊(GNC,美國(guó))，500mg/d，連續(xù)服用6周，于取卵前停服。本研究入組受試對(duì)象120名，研究結(jié)束時(shí)保留受試對(duì)象109名，其中，對(duì)照組59名，Res組50名：對(duì)照組失訪1例，Res組不能耐受治療6例，失訪4例。兩組間患者年齡、不孕時(shí)間、基礎(chǔ)卵泡數(shù)目、激素基礎(chǔ)水平差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見(jiàn)表1。

表1 各組一般情況比較

1.2 方法

1.2.1 促排卵方案及顆粒細(xì)胞獲取 所有入組對(duì)象均采用長(zhǎng)方案控制性促排卵。(1)于黃體中期使用短效促性腺激素釋放激素激動(dòng)劑皮下注射(GnRH-a,triptorelin，德國(guó)輝凌)，劑量0.05mg/d。在此過(guò)程中，通過(guò)B超監(jiān)測(cè)雙側(cè)卵泡數(shù)量及大小，使卵泡直徑均小于8mm，如出現(xiàn)卵泡囊腫則B超引導(dǎo)下穿刺引流。(2)根據(jù)患者情況注射促性腺激素(Gn,珠海麗珠)，直至出現(xiàn)1個(gè)以上直徑大于18mm的卵泡，予以肌肉注射人絨毛膜促性腺激素(hCG,珠海麗珠) 10000U。注射hCG后36h，在異丙酚麻醉下經(jīng)陰道超聲引導(dǎo)穿刺取卵。取卵后1h使用透明質(zhì)酸酶脫顆粒細(xì)胞，并將脫落顆粒細(xì)胞，2500r/min，離心10min，收集細(xì)胞團(tuán)用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。卵泡行IVF，并于72h后移植卵裂期胚胎。移植4周后，行B超檢查，以宮內(nèi)見(jiàn)孕囊確定臨床妊娠。

1.2.2 實(shí)驗(yàn)室檢測(cè) 氧化應(yīng)激水平由丙二醛(MDA)和還原型輔酶Ⅱ(NAPDH)活性反映。提取顆粒細(xì)胞團(tuán)的蛋白，利用MDA試劑盒(南京建成，中國(guó))測(cè)定MDA水平，使用NADPH氧化活性試劑盒(Genmed Scientifics,美國(guó))。線粒體的ATP生成采用ATP檢測(cè)試劑盒(碧云天，中國(guó))分析。線粒體DNA(mtDNA)拷貝數(shù)比較采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR(RT-PCR)的方法，以MT-ND1基因反映mtDNA的拷貝數(shù)，以HGB基因作為內(nèi)參。ND1基因的引物如下。上游：5′-CCC TAA AAC CCG CCA CAT CT-3′，下游：5′-GAG CGA TGG TGA GAG CTA AGG T-3′；HGB基因的引物為：上游：5′-GTG CAC CTG ACT CCT GAG GAG A-3′，下游：5′-CCT TGA TAC CAA CCT GCC CAG-3。MT-ND1擴(kuò)增條件為：95℃ 10min，95℃ 15s 40個(gè)循環(huán)，60℃ 1min；HGB的擴(kuò)增條件為：95℃ 10min，95℃ 15s 40個(gè)循環(huán)，56℃ 1min。

1.2.3 胚胎發(fā)育和妊娠結(jié)局的評(píng)價(jià)指標(biāo) 本研究利用卵成熟率、受精率及優(yōu)質(zhì)胚胎率和臨床妊娠率對(duì)胚胎發(fā)育及妊娠結(jié)局進(jìn)行評(píng)價(jià)。卵成熟率=MⅡ卵數(shù)/獲卵總數(shù)×100%；受精率= 2PN數(shù)/ MⅡ卵數(shù)×100%；優(yōu)質(zhì)胚胎率=Ⅰ～Ⅱ級(jí)胚胎數(shù)/獲卵總數(shù)×100%；臨床妊娠率=臨床妊娠數(shù)/移植周期數(shù)×100%。

2 結(jié) 果

2.1 Res對(duì)顆粒細(xì)胞氧化應(yīng)激水平的影響 口服Res使卵泡顆粒細(xì)胞的NADPH氧化活性下降了28.57%，并顯著低于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。此外，Res組顆粒細(xì)胞的MDA水平(0.382±0.052)μmol/mL顯著的低于對(duì)照組(0.653±0.084)nmol/mL，(P<0.05)，見(jiàn)圖1。

2.2 Res對(duì)顆粒細(xì)胞線粒體功能的影響 Res顯著的提高了卵泡顆粒細(xì)胞mtDNA的拷貝數(shù)，從對(duì)照組的(4.62±0.24)×105上升為(5.77±0.38)×105(P<0.05)。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，Res組線粒體ATP的合成(4.484±0.180)pmol顯著高于對(duì)照組(2.516±0.160)pmol，其能量代謝水平較高(P<0.05)，見(jiàn)圖2。

A：Res對(duì)顆粒細(xì)胞NADPH氧化活性的作用；B：Res對(duì)顆粒細(xì)胞MDA水平的作用。*:P<0.05，與對(duì)照組比較。

A：Res對(duì)顆粒細(xì)胞mtDNA的作用；B：Res對(duì)顆粒細(xì)胞ATP生成的作用。*:P<0.05，與對(duì)照組比較。

2.3 口服Res對(duì)胚胎發(fā)育和妊娠結(jié)局的作用 對(duì)照組移植59周期，Res組移植50周期，后者的卵成熟率由87.75%上升為94.15%，受精率由86.69%上升為91.49%，優(yōu)質(zhì)胚胎率由44.30%上升為51.22%，3項(xiàng)指標(biāo)均顯著高于對(duì)照組(P<0.05)。Res組的臨床妊娠率為48.0%，高于對(duì)照組的44.1%，但二者間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見(jiàn)表2。

表2 Res對(duì)胚胎發(fā)育及妊娠結(jié)局的影響

2.4 藥物不良反應(yīng)評(píng)價(jià) 對(duì)照組和Res組在畸胎率、死胎率及流產(chǎn)率上差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。孕婦發(fā)生妊娠高血壓疾病和妊娠期糖尿病的比率在二組間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見(jiàn)表3。

表3 Res的不良反應(yīng)評(píng)價(jià)[n(%)]

3 討 論

Res作為一類(lèi)天然小分子多酚類(lèi)化合物，其抗氧化作用逐步受到民眾的關(guān)注。近年來(lái)，較多的研究表明，Res與女性健康密切相關(guān)。有研究顯示，Res具有類(lèi)雌激素效應(yīng)，可顯著增加卵巢和子宮的濕質(zhì)量，這一作用依賴于Res與雌激素α和β受體的結(jié)合[7-8]。本研究發(fā)現(xiàn)，口服Res(500mg/d，6周)可顯著的降低卵泡顆粒細(xì)胞的氧化應(yīng)激水平，增加顆粒細(xì)胞線粒體的合成和ATP生成。這一作用與前期的體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)相類(lèi)似。早期研究顯示，Res可通過(guò)抑制脂氧合酶和環(huán)加氧酶的活性，減少顆粒細(xì)胞的凋亡[9]。Sugiyama等[5]研究也指出Res通過(guò)增加顆粒細(xì)胞的線粒體生物合成和降解，從而對(duì)卵母細(xì)胞的生長(zhǎng)發(fā)揮了積極的作用。而Res對(duì)顆粒細(xì)胞的抗氧化作用可能與抑制核因子κB(NF-κB)，抑制環(huán)加氧酶活性等作用有關(guān)[10]。

另一方面，研究發(fā)現(xiàn)，Res增高了IVF-ET后的卵成熟率、受精率及優(yōu)質(zhì)胚胎率；此外，Res組增高了臨床妊娠率，但與對(duì)照組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。這與Res對(duì)顆粒細(xì)胞的積極作用有關(guān)。顆粒細(xì)胞對(duì)卵母細(xì)胞的成熟具有重要的作用[11]。同時(shí)，Res對(duì)于卵泡細(xì)胞亦有直接的保護(hù)作用。Res可減緩卵泡閉鎖的過(guò)程，增加卵泡的儲(chǔ)備量，延長(zhǎng)卵巢的功能期[12]。Liu等[13]研究發(fā)現(xiàn)，給予老年小鼠Res后，改善了其卵巢的端粒酶活性、端粒長(zhǎng)度和年齡相關(guān)基因的表達(dá)水平。此外，也有研究者認(rèn)為，Res對(duì)于多囊卵巢綜合征及IVF術(shù)后的卵巢過(guò)度刺激綜合征同樣具有預(yù)防作用，但仍需進(jìn)一步證實(shí)[10]。

近期有報(bào)道指出，孕期使用Res可能對(duì)阻礙胎兒胰腺的發(fā)育，增加子代罹患糖尿病的風(fēng)險(xiǎn)[14]。本研究于ART前期給予患者口服Res，其不良反應(yīng)尚未見(jiàn)報(bào)道。因此，筆者對(duì)口服Res的不良反應(yīng)發(fā)生率進(jìn)行了分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，兩組在畸胎率、死胎率、流產(chǎn)率及妊娠高血壓疾病和妊娠期糖尿病的發(fā)生率上差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。而前期的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)同樣也沒(méi)有發(fā)現(xiàn)Res具有致畸等不良反應(yīng)[15]。

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Effect of resveratrol on the granulosa cell mitochondrial function and ART pregnancy outcome

Chen Lan1,Hu Sha2,Li Suping1△

(1.Department of Gynaecology and Obstetrics,University Hospital of Hubei University for Nationalities,Enshi,Hubei 445000，China;2.Union Hospital,Tongji Medical College,Huazhong University of Science andTechnology,Wuhan,Hubei 430022,China)

Objective To explore the effect of resvertrol supplement to the granulosa cell mitochondrial function and assisted reproductive technology (ART) outcome.Methods The study would analyze the level of oxidative stress and mitochondrial function in granulosa cell from 109cases with or without resvertrol supplement,including 50cases in resvertrol group and 59cases as control group.The embryo quality,IVF-ET outcome and adverse reactions would be observed.Results Resveratrol reduced the NADPH oxidation activity of granule cells by 28.57%(P<0.05),and also decreased the MDA content (0.653±0.084)nmol/mL vs. (0.382±0.052)nmol/mL,(P<0.05).Moreover,resvertrol supplement improved the mitochondrial DNA copy number (4.62±0.24)×105vs. (5.77±0.38)×105,(P<0.05) and ATP production (2.516±0.160)pmol vs. (4.484±0.180)pmol,(P<0.05) in granulosa cell.Compared with the control group,the oocyte maturation rate (87.75% vs. 94.15%,P<0.05),fertilization rate (86.69% vs. 91.49%,P<0.05) and high quality embryo rate (44.30% vs. 51.22%,P<0.05) in the resveratrol group were significantly increased.Meanwhile,the resvertrol supplement did not show any adverse effect.Conclusion Resvertrol might be a adjunctive therapy to the ART.

assisted reproductive technology；resvertrol；granulosa cell

陳蘭(1980-)，主治醫(yī)師，本科，主要從事輔助生殖技術(shù)的應(yīng)用研究?！?/p>

論著·臨床研究

10.3969/j.issn.1671-8348.2016.29.016

R71

A

1671-8348(2016)29-4080-03

2016-02-22

2016-04-11)