龍 敏，吳垣轅，趙 露，劉東方

(重慶醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院內(nèi)分泌科 400010)

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NOX 與2型糖尿病腎功能及尿清蛋白排泄率的相關(guān)性研究

龍 敏，吳垣轅，趙 露，劉東方

(重慶醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院內(nèi)分泌科 400010)

目的 探討2型糖尿病患者尼克酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸氧化酶(NOX)的變化與腎功能及尿清蛋白排泄率(UAER)的關(guān)系，并分析比較氧化應(yīng)激指標(biāo)與糖尿病腎臟損害程度的相關(guān)性。方法 將100例2型糖尿病患者，排除感染應(yīng)激和急慢性代謝紊亂，其中，50例為無腎病糖尿病組，另50例患者為糖尿病性慢性腎臟疾病(DKD)組，健康對照組50例。測定2組患者空腹血糖、腎小球功能、血和尿肌酐水平，以及血中糖化血紅蛋白(HbA1c)、三酰甘油(TG)、總膽固醇(TC)、低密度脂蛋白(LDL)、NOX、8-羥基脫氧鳥苷(8-OHdG)、丙二醛(MDA)、超氧化物歧化酶(SOD)水平。同時留取所有受試者3次不同時間清潔尿液檢測尿清蛋白與尿肌酐比值，計(jì)算UAER。結(jié)果 無腎病糖尿病組體內(nèi)NOX、8-OHdG、MDA明顯高于健康對照組，SOD明顯低于健康對照組；而DKD患者NOX、8-OHdG UAER明顯高于無腎病糖尿病組，Logistic回歸分析顯示NOX與DKD更為緊密(OR=1.199，P<0.01)。結(jié)論 與3個氧化應(yīng)激指標(biāo)8-OHdG、MDA、SOD相比，NOX更能確切地反映2型糖尿病腎病患者體內(nèi)的氧化應(yīng)激水平，即NOX是反映氧化應(yīng)激水平與2型糖尿病腎臟損害相關(guān)的更為理想的指標(biāo)。

糖尿病，2型；腎功能；尿清蛋白排泄率；尼克酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸氧化酶

慢性腎臟疾病(chronic kidney disease,CKD)是糖尿病的常見并發(fā)癥，其中，以糖尿病性腎臟疾病(diabetic kidney disease,DKD)最常見，據(jù)調(diào)查我國30歲以上的成人2型糖尿病中約63.9%的患者合并了慢性腎臟疾病，而國外的數(shù)據(jù)表明DKD是引起終末期腎臟疾病的首要原因[1-2]。DKD是遺傳因素與環(huán)境因素等共同作用的結(jié)果，其發(fā)病機(jī)制較為復(fù)雜，高血糖引起的氧化應(yīng)激在諸多機(jī)制中扮演重要角色。傳統(tǒng)的氧化應(yīng)激指標(biāo)包括8-羥基脫氧鳥苷(8-hydroxy-2′-deoxyguanosine urin，8-OHdG)、丙二醛(malondialdehyde,MDA)及超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)等?；钚匝?reactive oxygen species，ROS) 被認(rèn)為是氧化應(yīng)激的主要原因,包括超氧陰離子(O2-)、羥自由基和過氧化氫等。尼克酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸氧化酶(nicotinamide adenine dinucleotide phosphate oxidase，NADPH oxidase，NOX)是人類發(fā)現(xiàn)的第1個主要產(chǎn)生ROS的酶，也被稱為ROS產(chǎn)生的“心臟”[3-4]。研究發(fā)現(xiàn)，NOX的同工酶在腎臟的分布具有區(qū)域和細(xì)胞特異性，其與DKD的關(guān)系目前在國際上受到關(guān)注，國內(nèi)相關(guān)的研究報道較少[5-7]。研究表明，NOX及其產(chǎn)物ROS通過改變腎臟血流動力學(xué)、影響腎內(nèi)基質(zhì)重?fù)p傷和腎小球基底膜等多方面對DKD的進(jìn)展可能起關(guān)鍵作用，但具體機(jī)制仍不清楚。本研究擬探討2型糖尿病患者其NOX的變化與腎臟功能及尿清蛋白排泄率(UAER)的關(guān)系，并比較NOX及傳統(tǒng)氧化應(yīng)激指標(biāo)與糖尿病(DM)腎臟損害程度的相關(guān)性。

1 資料與方法

1.1 一般資料 本研究入組的所有患者均簽署知情同意書，治療方案均經(jīng)過本院醫(yī)學(xué)倫理委員會批準(zhǔn)。按照WHO 1999年DM診斷標(biāo)準(zhǔn)，篩選2014年5月至2015年5年在本院內(nèi)分泌科住院部及門診就診的100例2型糖尿病患者，男女各50例，UAER正常(男性UACR<2.5mg/mmoL，女性UACR<3.5mg/mmoL)的患者為無腎病DM(DM)組，而腎小球?yàn)V過率(eGFR)<60mL·min-1·1.73m-2和(或)男性UAER> 2.5mg/mmoL，女性UAER > 3.5mg/mmoL并排除其他原因腎病的患者為DKD組50例(具體資料見表1)。50例年齡性別匹配的健康自愿者(健康對照組)來自本院常規(guī)體檢的市民，既往均無DM、慢性阻塞性肺疾病、原發(fā)性高血壓、高脂血癥及冠狀動脈粥樣硬化性心臟病等慢性病病史，體檢及實(shí)驗(yàn)室檢查各項(xiàng)指標(biāo)均正常。兩組患者在年齡、性別、癥狀及病程等方面相比，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (P>0.05)，具有可比性。排除標(biāo)準(zhǔn)：(1)年齡小于18歲或大于70歲者；(2)1型糖尿病患者；(3)伴有DM急性并發(fā)癥(高滲性非酮癥糖尿病昏迷或糖尿病酮癥酸中毒)者；(4)合并各種急慢性感染性疾病或急性代謝紊亂的患者；(5)有心臟、肝臟及其他腎臟疾病者；(6)近期有創(chuàng)傷病史、手術(shù)史或患有惡性腫瘤者；(7)已行透析的糖尿病腎病患者。

1.2 方法 被檢者過夜禁食(8～10h)，次日抽取空腹靜脈血，離心后收集上層血清，測定空腹血糖、腎小球功能，用肌氨酸氧化酶法(四川邁克生物科技股份有限公司)檢測血液和尿肌酐水平；用高效液相色譜法(美國Bio-Rad公司)檢測糖化血紅蛋白(HbA1c)、NOX和8-OHdG水平檢測均采用酶聯(lián)免疫吸附測定(ELISA，德國IBL公司)；使用三酰甘油(TG)測定試劑盒(GPO-PAP法，四川邁克生物科技公司)測定TG；使用總膽固醇測定試劑盒(COD-CE-PAP法，四川邁克生物科技公司)測定總膽固醇(TC)、低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)和高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)；使用水溶性四唑鹽-1法(WST-1,德國IBL公司 )檢測SOD；使用硫代巴比妥酸法(TBA,南京建成生物工程研究所)檢測MDA。測量被檢者血壓、身高、體質(zhì)量、腰圍、臀圍，采用校正簡化的 MDRD公式計(jì)算eGFR，體質(zhì)量指數(shù)(BMI)=體質(zhì)量(kg)/身高2(m2)。所有受試者于抽血當(dāng)日坐位休息30min后，清潔外陰，留取中段晨尿1次，間隔1或2周后再留取尿液1次，3次尿液均送生化室檢測尿清蛋白與尿肌酐比值。使用尿微量清蛋白測定試劑盒(免疫比濁法，中生北控生物科技公司)檢測尿微量清蛋白，計(jì)算UAER，如eGFR<60mL·min-1·1.73m-2和(或)男性UAER>2.5mg/mmoL，女性UAER>3.5mg/mmoL并排除其他原因腎病的定義為DKD[8]。

2 結(jié) 果

2.1 3組氧化應(yīng)激和腎損害相關(guān)指標(biāo)的變化 無腎病DM組與健康對照組比較，二者eGFR、UAER值差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05),而無腎病DM組的NOX、8-OHdG、MDA指標(biāo)均高于健康對照組(P<0.05)，無腎病DM組的SOD低于健康對照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；DKD組與健康對照組比較，二者eGFR、SOD值低于健康對照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),而DKD組的NOX、UAER、8-OHdG、MDA指標(biāo)均高于健康對照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；DKD組與無腎病DM組比較，SOD、MDA值差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，而DKD組的eGFR值低于無腎病DM組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，DKD組的UAER、8-OHdG、NOX值均高于無腎病DM組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見表2。

表1 臨床資料和實(shí)驗(yàn)室指標(biāo)比較

表2 各組氧化應(yīng)激和腎臟損害相關(guān)指標(biāo)比較

2.2 2型糖尿病腎病的Logistic回歸分析 2型糖尿病腎病與BMI、高脂血癥、吸煙無相關(guān)性(P>0.05)，2型糖尿病腎病與患者年齡、高血壓、DM病程、HbA1c、NOX、8-OHdG、SOD、MDA呈正相關(guān)(OR=1.025,1.720,1.028，1.137，1.199，1.791，1.067，0.940，P<0.05)，而NOX與2型糖尿病腎病則更為緊密(OR=1.199，P<0.01)，見表3。

表3 相關(guān)因素在2型糖尿病腎病患者的Logistic回歸分析

3 討 論

氧化應(yīng)激作用在2型糖尿病及其并發(fā)癥的發(fā)生、發(fā)展過程中發(fā)揮著重要作用。既往研究表明，各種因素導(dǎo)致過強(qiáng)的氧化應(yīng)激作用可通過抑制胰島β細(xì)胞的分泌功能、促使胰島β細(xì)胞凋亡及破壞胰島素作用的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路等諸多機(jī)制，使機(jī)體的胰島功能發(fā)生障礙，從而促進(jìn)DM的發(fā)生、發(fā)展[7]。研究表明，MDA和SOD是較早和經(jīng)典的氧化應(yīng)激相關(guān)指標(biāo)，SOD是體內(nèi)主要的抗氧化物質(zhì)之一，反映機(jī)體的抗氧化應(yīng)激能力。而MDA是ROS過氧化反應(yīng)的最終產(chǎn)物，其含量可體現(xiàn)機(jī)體過氧化反應(yīng)的程度。8-OHdG是DNA氧化應(yīng)激損傷的主要和特異性產(chǎn)物，可反映機(jī)體DNA氧化應(yīng)激損傷水平。NOX廣泛分布于體內(nèi)多種非吞噬細(xì)胞，目前發(fā)現(xiàn)其有7種同工酶。NOX 產(chǎn)生的ROS 是線粒體外ROS 的主要來源。已有的研究表明，NOX在DM胰島功能失調(diào)、胰島素抵抗、血管功能紊亂等發(fā)病機(jī)制中都起重要作用[3-4,8]。

本研究采用NOX、8-OHdG、MDA及SOD 等氧化應(yīng)激指標(biāo)評估了單純2型糖尿病和DKD患者體內(nèi)氧化應(yīng)激狀態(tài)，同時探討了這些氧化應(yīng)激指標(biāo)與DKD的關(guān)系。研究發(fā)現(xiàn)，在無腎病的DM患者體內(nèi)氧化應(yīng)激各指標(biāo)水平已經(jīng)明顯高于健康對照組，伴DKD的患者氧化應(yīng)激水平更進(jìn)一步升高，以NOX升高更顯著。本研究顯示DM患者體內(nèi)8-OHdG、MDA、NOX已經(jīng)顯著高于健康對照組，SOD低于健康對照組，表明DM患者氧化應(yīng)激水平顯著升高，而抗氧化能力顯著降低。

本研究中的DM患者血糖控制不佳,平均HbA1c都在9%左右，高血糖使氧化應(yīng)激處于高度活躍的狀態(tài)，導(dǎo)致體內(nèi)ROS水平增高。過多的ROS會通過不同機(jī)制進(jìn)一步導(dǎo)致DM慢性并發(fā)癥的發(fā)生。本研究表明，雖然8-OHdG、MDA、SOD和NOX 4個反映氧化應(yīng)激水平的指標(biāo)，在DKD患者中都有明顯變化，但NOX和8-OHdG升高更顯著，Logistic回歸分析顯示NOX與DKD聯(lián)系更為緊密。表明與前3個氧化應(yīng)激指標(biāo)所反映的氧化應(yīng)激水平相比，NOX能更好地反映機(jī)體氧化應(yīng)激水平，表明NOX是反映機(jī)體氧化應(yīng)激水平與DM腎臟損害之間更為確切的指標(biāo)。在NOX的7種亞型中，目前研究發(fā)現(xiàn)與DKD 病理機(jī)制密切相關(guān)的NOX同工酶主要報道的是NOX4[9-10]。

研究表明，生理劑量的活性氧本身是在人體的生理功能中起重要作用，比如細(xì)胞功能，激素合成，基因的表達(dá)等，但是當(dāng)氧化應(yīng)激導(dǎo)致ROS產(chǎn)生過多就會引起炎癥或者纖維化的發(fā)生，導(dǎo)致一系列病理機(jī)制的激活[11-12]。動物實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn),高糖可促進(jìn)機(jī)體腎臟NOX4和NOX5表達(dá)升高，從而引起足細(xì)胞的持續(xù)氧化應(yīng)激損傷，繼而產(chǎn)生大量蛋白尿[13]。DKD患者或者動物模型的腎臟局部p47phox等NOX重要功能亞基表達(dá)顯著增加，從而引起活性氧產(chǎn)生過多。過多NOS損害腎臟的可能機(jī)制有：(1)過多的ROS引起腎臟血流動力學(xué)障礙，內(nèi)皮舒張功能受損。當(dāng)NOX激活，ROS產(chǎn)生過度時，一氧化氮的生物活性降低，從而導(dǎo)致內(nèi)皮依賴性血管舒張功能下降，腎小球囊內(nèi)壓增高，繼而導(dǎo)致內(nèi)皮細(xì)胞功能損傷甚至腎血管性高血壓。(2)NOX 過度表達(dá)時，ROS的表達(dá)相應(yīng)升高，從而腎臟系膜細(xì)胞基質(zhì)聚集、腎臟形成纖維化、繼而導(dǎo)致足細(xì)胞損傷。基因敲除p47(phox-/-)或者抑制腎臟NOX的表達(dá)腎臟氧化應(yīng)激損傷，系膜細(xì)胞增生及腎小球肥大等病理改變明顯減輕[14-15]。

本研究通過檢測多種氧化應(yīng)激指標(biāo)，評估其與DM腎臟損害的關(guān)系，發(fā)現(xiàn)NOX是與DM腎臟病變關(guān)系更密切的氧化應(yīng)激標(biāo)志物。由于NOX與DKD的密切關(guān)系，抑制NOX表達(dá)或許可以延緩DKD的進(jìn)展，因此仍需要進(jìn)一步深入研究。但由于本研究病例有限，關(guān)于NOX與DKD的密切關(guān)系還需進(jìn)行大樣本 、多中心臨床試驗(yàn)進(jìn)一步研究。

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The relationship between NOX,kidney function and urinary albumin excretion rate in patients with type 2diabetes mellitus

Long Min,Wu Yuanyuan,Zhao Lu,Liu Dongfang

(Department of Endocrinology,the Second Affiliated Hospital of Chongqing Medical University,Chongqing 400010,China)

Objective To observe the relationship between the change of NOX and renal function and urinary albumin excretion rate(UAER) in type 2diabetes patients,and demonstrates the relationship of oxidative stress indicators and diabetic kidney damage.Methods Totally 100cases of patients with type 2diabetes mellitus,eliminated infection stress and acute and chronic metabolic disorder,of which 50cases for non diabetic nephropathy group and the other 50cases of patients for diabetic chronic kidney disease (DKD) group;healthy control group (50cases).The levels of FBG,renal function,Cr in blood and urine,HbA1c,TG,TC,LDL,NOX,8-OHdG,MDA,SOD were measured.While specimens from all subjects at three different time of clean urine urine albumin / creatinine ratio were calculated for UAER.Results Compared with healthy control group,diabetes with non kidney disease group had higher NOX，8-OHdG，MDA,and had significantly lower level in the serum SOD level;but compared with diabetes with non kidney disease group,the DKD group had even higher in UAER,NOX，8-OHdG，Logistic regression analysis revealed that NOX were positively associated with DKD(OR=1.199,P<0.01).Conclusion Compared with serum 8-OHdG,MDA and SOD,the serum NOX level can more accurately reflect the level of oxidative stress in the body,and can be as an ideal index to reflecting the relationship between oxidative stress and diabetes chronic kidney damage.

diabetes mellitus,type 2；renal functions；urinary albumin excretion rate；nicotinamide adenine dinucleotide phosphate oxidase

龍敏(1970-)，主治醫(yī)師，碩士，主要從事糖尿病與骨質(zhì)疏松研究。

論著·臨床研究

10.3969/j.issn.1671-8348.2016.29.011

R587.1

A

1671-8348(2016)29-4065-03

2016-02-18

2016-04-06)