趙大川，黃宗海，林志群，郎 敏，柳學(xué)文

(南方醫(yī)科大學(xué)珠江醫(yī)院普外科，廣州 510280)

?

·技術(shù)與方法·

新型納米銀殼聚糖敷料的應(yīng)用研究*

趙大川，黃宗?！鳎种救?，郎 敏，柳學(xué)文

(南方醫(yī)科大學(xué)珠江醫(yī)院普外科，廣州 510280)

目的 觀察并評(píng)價(jià)新型納米銀殼聚糖敷料的物理特性、細(xì)胞毒性、抑菌性及其對(duì)傷口愈合的影響。方法 將納米銀材料添加到殼聚糖中制備新型復(fù)合生物抗菌敷料，并通過使用電子顯微鏡、CCK-8、抑菌圈及平板抑菌法、大鼠創(chuàng)傷動(dòng)物模型愈合試驗(yàn)將殼聚糖敷料、納米銀殼聚糖敷料、銀離子敷料及普通紗布敷料進(jìn)行對(duì)比，以評(píng)價(jià)新型納米銀殼聚糖敷料的物理特性、細(xì)胞毒性、抑菌性及對(duì)傷口愈合的影響。結(jié)果 電子顯微鏡提示納米銀顆粒在殼聚糖敷料表面均勻分散，粒子直徑約50nm；抑菌圈及平板抑菌法提示新型納米銀殼聚糖敷料對(duì)金黃色葡萄球菌、大腸桿菌及銅綠假單胞桿菌均有較強(qiáng)的抑菌能力；CCK-8實(shí)驗(yàn)提示其在0.5%及1.0%的納米銀濃度下無明顯細(xì)胞毒性；動(dòng)物愈合實(shí)驗(yàn)提示納米銀殼聚糖敷料可以促進(jìn)傷口愈合。 結(jié)論 納米銀殼聚糖敷料符合現(xiàn)代新型生物敷料的基本要求，相較傳統(tǒng)敷料有其優(yōu)越性。

殼聚糖；納米銀；新型生物敷料；抗菌性

傷口愈合是一個(gè)復(fù)雜且精細(xì)的過程，是一系列不同類型細(xì)胞、蛋白激酶和生長因子等交互作用的結(jié)果，它們彼此之間相互協(xié)調(diào)，共同完成傷口修復(fù)[1]。1963 年Winter提出的濕性傷口愈合理論，發(fā)現(xiàn)保持傷口濕潤，避免形成結(jié)痂可以促進(jìn)傷口恢復(fù)，濕潤的環(huán)境可以通過增加上皮再生，提高巨噬細(xì)胞及纖維母細(xì)胞活性，保持傷口清潔，減輕疼痛及減少敷料更換等方面促進(jìn)傷口愈合[2-3]。為達(dá)到濕性愈合的效果，多種新興材料制成的敷料孕育而生。其中，殼聚糖材料因其具有生物相容性、生物可降解性、無毒性及免疫原性，已經(jīng)在生物領(lǐng)域有較為廣泛的研究，且已經(jīng)應(yīng)用于血管支架、創(chuàng)傷修復(fù)等組織工程領(lǐng)域。在傷口修復(fù)領(lǐng)域，殼聚糖止血封堵敷料、殼聚糖創(chuàng)傷敷料已在我國批準(zhǔn)使用[4]。

無機(jī)金屬銀具有抗菌譜廣、抗菌性能強(qiáng)及不易產(chǎn)生抗藥性等優(yōu)點(diǎn)，近些年出現(xiàn)的含有納米銀的新型抗菌敷料在抗菌性及安全性上較以前的銀離子敷料又有了進(jìn)一步發(fā)展，而既往的研究也曾嘗試將殼聚糖與納米銀結(jié)合，以制作一種具有更強(qiáng)抗菌性、生物相容性的材料[5-6]；或?qū)ぞ厶桥c納米銀整合到常規(guī)敷料中[7-8]，使其可以在臨床中進(jìn)行使用。本課題組嘗試制作基于普通殼聚糖敷料的新型納米銀殼聚糖(silver nanoparticles chitosan,SNC)敷料。并通過對(duì)其物理特性、細(xì)胞毒性、抗菌性及在實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中的應(yīng)用，來評(píng)價(jià)該新型復(fù)合生物抗菌敷料的應(yīng)用價(jià)值。

1 材料與方法

1.1 材料 動(dòng)物： Wistar大鼠，體質(zhì)量約250 g(由南方醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供)。細(xì)胞：L-929(小鼠成纖維細(xì)胞)取自南方醫(yī)科大學(xué)細(xì)胞生物學(xué)研究所細(xì)胞庫。試劑：CCK-8試劑盒(日本同仁公司)。殼聚糖敷料：由濕法工藝將殼聚糖溶解后配制成一定濃度的紡絲原液，通過過濾、脫泡、凝固、拉伸、干燥等操作制成殼聚糖纖維，并用水刺法加工生產(chǎn)出醫(yī)用殼聚糖敷料。銀離子抗菌敷料購自百合公司(廣東)。納米銀溶液購自耐爾納米技術(shù)有限公司(張家港)。菌株：金黃色葡萄球菌(ATCC25923)、大腸桿菌(ATCC25922)及銅綠假單胞菌(ATCC27853)由南方醫(yī)科大學(xué)珠江醫(yī)院微生物實(shí)驗(yàn)室提供并常規(guī)保存。儀器：NanoDrop 2000光譜儀(Thermo公司)；掃描電鏡 (Jeol 公司)；離子濺射儀(Jeol公司)；酶標(biāo)儀(molecular devices，美國)。

1.2 方法

1.2.1 SNC敷料的制備 采用自組裝技術(shù)制造SNC敷料，先將納米銀溶液用無菌去離子水稀釋，按照溶液與敷料質(zhì)量比為50∶1的比例加入敷料所在容器中，使殼聚糖敷料浸入溶液中，溶液中所含納米銀質(zhì)量分別為敷料質(zhì)量的4.0%、2.0%、1.0%、0.5%，25 ℃在振蕩器中以80 r/min震蕩12 h。于65 ℃烘干敷料后分別用紫外照射敷料兩側(cè)各1 h。用分光光度計(jì)檢測(cè)反應(yīng)前及反應(yīng)后納米銀溶液光密度(OD)值，判斷納米銀離子是否與殼聚糖敷料組合。

1.2.2 SNC物理特性檢測(cè) (1)紫外-可見分光檢測(cè)：用紫外-可見分光光度計(jì)(NanoDrop 2000)用于檢測(cè)SNC敷料，波長掃描范圍為200～800 nm。既往的研究提示417 nm處的紫外-可見光吸收峰是由于銀微粒表面的電子云周期性變化集體激發(fā)產(chǎn)生的表面等離子共振帶[8]，由此推斷納米銀是否已組合于殼聚糖敷料上。(2)殼聚糖敷料的掃描電鏡：將SNC敷料裁剪成面積為8 mm×8 mm，厚度為5 mm的小片，60 ℃干燥2 h后將樣品通過離子濺射鍍膜法進(jìn)行導(dǎo)電處理，并進(jìn)行觀察。

1.2.3 SNC敷料的細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn) 基于用于醫(yī)療器械(ISO 10993-12和ISO 10993-5)生物評(píng)估的國際標(biāo)準(zhǔn)，估計(jì)敷料的細(xì)胞毒性。分別將不同濃度的已紫外消毒的SNC敷料0.5 g浸入50 mL 1640PRMI(加入10%胎牛血清)，并于37 ℃的條件下震蕩24 h。通過0.2 mm的過濾器將SNC敷料浸提液過濾以除去不溶物殘基，得到浸提液。選擇經(jīng)美國食品、藥品監(jiān)督管理局(FDA)認(rèn)證的銀離子敷料，及未結(jié)合納米銀的殼聚糖敷料，按上述方法制備，分為未添加敷料浸提液的空白對(duì)照組、殼聚糖敷料組、0.5%SNC敷料組、1.0%SNC敷料組，2.0%SNC敷料組、4.0%SNC敷料組及銀離子敷料組。將小鼠L-929 成纖維細(xì)胞以1×104/孔分別加入96孔板中培養(yǎng)，培養(yǎng)條件為37 ℃、體積分?jǐn)?shù)為5%CO2的環(huán)境下用加入10%小牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)液培養(yǎng)，培養(yǎng)24 h。之后，將培養(yǎng)基替換為先前獲得的浸提液(空白對(duì)照組更換為上述培養(yǎng)基)，按上述條件繼續(xù)培養(yǎng)24 h，移除培養(yǎng)基，按照CCK-8試劑盒說明書，將10 μL CCK-8及100 μL PRMI 1640試劑加入每個(gè)孔，并在37 ℃、5%CO2的環(huán)境下孵育30 min。由酶標(biāo)儀在450 nm處檢測(cè)每個(gè)孔的吸光度。相對(duì)增殖率(%)=(樣品吸光度/空白對(duì)照組吸光度)×100%。根據(jù)相對(duì)增值率的大小，按表1評(píng)價(jià)不同敷料的細(xì)胞毒性。

表1 細(xì)胞毒性分級(jí)

1.2.4 SNC的抗菌性 (1)抑菌圈實(shí)驗(yàn)：抑菌圈實(shí)驗(yàn)可以模擬本敷料在潮濕或有滲出的傷口時(shí)敷料控制微生物增長的能力，作為具有較強(qiáng)吸濕能力的SNC敷料，有必要探尋其擴(kuò)散抑菌能力。每種細(xì)菌分別以1×108/mL的濃度接種到營養(yǎng)瓊脂平板上，均勻涂抹3次，將不同濃度的SNC敷料、殼聚糖敷料及銀離子敷料分別剪裁成直徑為10 mm的圓形，濕潤后放入已經(jīng)接種細(xì)菌的培養(yǎng)皿上，并在37 ℃、5%CO2的條件下孵育18 h時(shí)，并測(cè)量抑菌環(huán)的范圍。根據(jù)不同敷料的選擇，本實(shí)驗(yàn)共分為殼聚糖敷料組、0.5%SNC敷料組、1.0%SNC敷料組、2.0% SNC敷料組、4.0%SNC敷料組及銀離子敷料組。(2)震蕩法測(cè)定SNC敷料抑菌能力：將不同濃度的SNC敷料分別剪成1 cm×1 cm的大小，置于無菌離心管中，作為實(shí)驗(yàn)組。選擇經(jīng)FDA認(rèn)證的銀離子敷料，及未結(jié)合納米銀的殼聚糖敷料，按上述方法制備，據(jù)置入敷料的不同，分為未添加敷料的空白對(duì)照組、殼聚糖敷料組、0.5%SNC敷料組、1.0%SNC敷料組、2.0%SNC敷料組、4.0%SNC敷料組及銀離子敷料組。在每個(gè)離心管中加入4 mL 2XYT培養(yǎng)基。

分別在2XYT培養(yǎng)基中分別加入從瓊脂平板上挑取的金黃色葡萄球菌、大腸桿菌及銅綠假單胞桿菌菌落過夜培養(yǎng)后，將菌液濃度稀釋為(1.0～1.5)×105/mL的濃度，將1 mL菌液分別加入上述每個(gè)離心管中。將離心管在振蕩器中以25 ℃、200 r/min震蕩1 h，然后將其于37 ℃，5%CO2培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)。分別于0、1、6和24 h，稀釋并涂布到瓊脂平板進(jìn)行細(xì)菌數(shù)量測(cè)定。

1.2.5 傷口愈合實(shí)驗(yàn) 將16只Wistar大鼠分為4組，即1%SNC敷料組、殼聚糖敷料組、銀離子敷料組和普通紗布敷料組。研究方案符合中國準(zhǔn)則實(shí)驗(yàn)動(dòng)物。每只大鼠經(jīng)腹腔注射水合氯醛麻醉，除去背毛后皮膚用75%乙醇和安爾碘Ⅲ消毒。在每一只大鼠背后去毛處切除出一個(gè)面積為 100 mm2大小的完整厚度傷口。將敷料分別固定于每一只大鼠身上，每天在傷口處局部換藥。分別于第2、4、6、8、10天觀察實(shí)驗(yàn)動(dòng)物傷口愈合情況。創(chuàng)面愈合率=(術(shù)后傷口面積-第n天傷口面積)/術(shù)后傷口面積×100%。在術(shù)后第8天分別從各組取1只大鼠的皮膚樣品。將組織用10%福爾馬林溶液固定，并用乙醇梯度脫水，二甲苯透明、石蠟包埋，將組織切成5～7 mm寬的薄片，常規(guī)蘇木素-伊紅(HE)染色。觀察上皮組織、皮脂腺、新生血管及肉芽組織情況。

2 結(jié) 果

2.1SNC敷料物理特性 紫外-可見吸收光譜見圖1，結(jié)果提示納米銀已組合于殼聚糖敷料上。SNC敷料的電鏡掃描結(jié)果見圖2，納米銀顆粒在殼聚糖敷料表面均勻分散，粒子直徑約50nm，但仍可見納米銀團(tuán)聚現(xiàn)象。

圖1 SNC敷料的紫外-可見光譜

2.2SNC敷料的細(xì)胞毒性檢測(cè)L929細(xì)胞用上述6種浸提液及空白對(duì)照組處理24h后，殼聚糖無細(xì)胞毒性，而銀離子敷料具有中度細(xì)胞毒性，SNC敷料有一定細(xì)胞毒性，且其細(xì)胞毒性隨納米銀含量增加而增加，見圖3、表2。

2.3 抗菌性實(shí)驗(yàn)

2.3.1 抑菌圈實(shí)驗(yàn) 根據(jù)上述評(píng)價(jià)方法，發(fā)現(xiàn)單純的殼聚糖敷料在3種細(xì)菌中均無抑菌圈出現(xiàn)，而添加了納米銀的殼聚糖敷料，在3種不同細(xì)菌中，其抑菌圈大小隨著納米銀濃度的增加而逐步增加，見圖4。

圖2 SNC敷料的電鏡掃描圖

圖3 細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)

表2 不同敷料的細(xì)胞毒性評(píng)價(jià)

圖4 不同敷料分別在金葡菌、大腸桿菌及銅綠假單胞菌的抑菌圈

2.3.2 震蕩抑菌實(shí)驗(yàn)結(jié)果 分別在1、6及24h測(cè)量添加不同敷料的各個(gè)離心管中細(xì)菌濃度，制作抑菌曲線，結(jié)果未添加納米銀的殼聚糖敷料無明顯抑菌性，而添加納米銀或具有銀離子的敷料則有較為優(yōu)秀的抑菌性能，見圖5。

圖5 震蕩抑菌實(shí)驗(yàn)抑菌曲線

2.4 傷口愈合實(shí)驗(yàn)

2.4.1 傷口愈合程度測(cè)量 分別于第2、4、6、8、10天記錄傷口愈合情況。第6天時(shí)，1.0%SNC敷料組傷口愈合情況明顯優(yōu)于其他組(P<0.05)，第10天時(shí)相較不具有抗菌能力的殼聚糖敷料組及普通紗布敷料組，1.0%SNC敷料組及銀離子敷料組的愈合率更高(P<0.05)，見表3、圖6。

表3 應(yīng)用不同敷料小鼠傷口愈合情況

圖6 傷口愈合情況趨勢(shì)圖

2.4.2 組織染色 在切口愈合的第10天，HE染色顯示1.0%SNC敷料組中上皮組織增生良好，可見皮脂腺及新生血管，炎癥反應(yīng)較輕；而普通紗布敷料組則顯示為不完全的上皮化形成，見圖7。

圖7 第10天不同組別小鼠傷口病理切片(HE，×20)

3 討 論

殼聚糖作為一種具有吸濕、抑菌、止血、調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng)的天然材料，是當(dāng)前研究的熱點(diǎn)。然而殼聚糖的生物性能，又與多種因素相互關(guān)聯(lián)，不同的脫乙酰程度及相對(duì)分子質(zhì)量的大小，會(huì)對(duì)其止血性、抗菌性及與炎癥反應(yīng)產(chǎn)生極大影響。低脫乙酰度的殼聚糖甚至對(duì)耐甲氧西林金葡菌有很好的抑制性[9]，而小相對(duì)分子質(zhì)量的殼聚糖也會(huì)提高組織對(duì)其降解的速度[10]。

既往的研究顯示，在一定范圍內(nèi)，生物材料的抗菌性能與納米銀濃度呈正相關(guān)，為達(dá)到較為優(yōu)秀的抗菌性能，一般需要納米銀的添加比例不低于生物材料的1.5%[11]，而在本實(shí)驗(yàn)中，0.5%的SNC敷料已經(jīng)顯示出優(yōu)秀的抗菌能力，考慮其為納米銀與殼聚糖的協(xié)同作用所導(dǎo)致的抗菌性能提升。其協(xié)同作用表現(xiàn)為:(1)納米銀粒子尺寸小且比表面積大，容易與細(xì)菌發(fā)生接觸反應(yīng)，使納米銀粒子黏附到細(xì)胞膜上，并滲入到細(xì)菌內(nèi)部,在細(xì)菌細(xì)胞內(nèi)部納米銀粒子通過與酶蛋白中的硫和磷發(fā)生作用，使細(xì)菌喪失酶活性，同時(shí)也會(huì)破壞細(xì)菌的呼吸鏈，導(dǎo)致細(xì)菌死亡[12]；(2)納米銀粒子在細(xì)菌細(xì)胞中可以釋放銀離子,從而進(jìn)一步提高其抗菌能力；再次，殼聚糖上未反應(yīng)的-NH2質(zhì)子化生成-NH3+,能夠吸附細(xì)菌表面帶負(fù)電荷的分子基團(tuán)而改變其細(xì)胞通透性,從而導(dǎo)致細(xì)菌細(xì)胞內(nèi)組分如蛋白質(zhì)與葡萄糖的泄露,致使細(xì)菌死亡；(3)殼聚糖復(fù)合物具有獨(dú)特的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu),當(dāng)與細(xì)菌接觸時(shí),其更易堆積在細(xì)菌細(xì)胞表面而造成細(xì)胞代謝減弱,從而抑制細(xì)菌繁殖[13]。

現(xiàn)代生物敷料應(yīng)該是具有良好保濕能力，不粘連新生肉芽組織，減少更換時(shí)患者的痛苦；可以促進(jìn)上皮細(xì)胞再生，提高巨噬細(xì)胞及纖維母細(xì)胞活性；保持傷口清潔，減少傷口可能的細(xì)菌感染，促進(jìn)傷口愈合的新型敷料。本課題組所制作的敷料，除了其優(yōu)異的抗菌性外，低于1%的SNC模型更是無明細(xì)的細(xì)胞毒性。且在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中證明本敷料相較傳統(tǒng)敷料可以促進(jìn)傷口的愈合，也能夠保持傷口的濕潤。綜上所述，本敷料符合現(xiàn)代生物敷料的要求。

但本實(shí)驗(yàn)依然有一些問題尚待解決：(1)盡管選擇的納米銀材料是一種目前看來較為優(yōu)秀的抗菌材料，相關(guān)的研究也證實(shí)在短期研究中，未見到銀對(duì)生物體產(chǎn)生嚴(yán)重不良反應(yīng)[14-15]，但是其長期影響仍無定論。(2)現(xiàn)階段并未完全理解SNC敷料是如何影響傷口愈合的，其具體機(jī)制是為何。有研究提示小相對(duì)分子質(zhì)量的殼聚糖可以抑制基質(zhì)金屬蛋白酶2的活性及表達(dá)，當(dāng)其相對(duì)應(yīng)分子質(zhì)量在(3～5)×103時(shí)，其可以達(dá)到最大的效應(yīng)。而過量的基質(zhì)金屬蛋白酶2被認(rèn)為是抑制傷口愈合的因素之一。但這只是其中一個(gè)假設(shè)，關(guān)于SNC敷料如何促進(jìn)傷口愈合，還需要進(jìn)一步研究。

總而言之，SNC敷料符合現(xiàn)代新型生物敷料的基本要求，相較傳統(tǒng)敷料有其優(yōu)越性，值得臨床進(jìn)一步研究。

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Application research of a novel silver nanoparticles chitosan dressing*

ZhaoDachuan,HuangZonghai△,LinZhiqun,LangMin,LiuXuewen

(DepartmentofGeneralSurgery,ZhujiangHospital,SouthernMedicalUniversity,Guangzhou,Guangdong510280,China)

Objective To evaluate the construction,cytotoxicity,antibacterial activity and wound healing application of a novel silver nanoparticles chitosan dressing.Methods Silver nanoparticles were added into chitosan to prepare a new compound biological antimicrobial dressing(silver nanoparticles chitosan dressing,SNC dressing).By using UV-Vis spectroscopy,scanning electron microscopy,CCK-8 test,zone of inhibition test,quantitative test and wound healing experiment,we evaluated the physical property of the new dressing and compared this new dressing with traditional dressing,chitosan dressing and silver ion-releasing chitosan dressing.Results UV-Vis Spectroscopy and SEM studies showed silver nanoparticles well dispersed in chitosan fiber with a particle size about 50 nm.In antimicrobial test,the SNC dressing showed a immense antimicrobial property for Staphylococcus aureus,escherichia coli and pseudomonas aeruginosa.In cytotoxicity test,the SNC dressing loading 0.5% and 1.0% silver nanoparticles was proved to behaved slight cytotoxicity.In wound healing experiments,healing promotion and improved reconstruction were observed in the SNC dressing compared with other dressings.Conclusion SNC dressing meets the basic requirements of the modern biological dressing and it might have more advantages comparing with traditional dressings.

chitosan;silver nanoparticles;novel biological dressings;antibacterial activity

廣州市海珠區(qū)科技計(jì)劃項(xiàng)目(2013-cg-27)。 作者簡(jiǎn)介：趙大川(1990-)，在讀博士，主要從事外科敷料對(duì)傷口愈合方面研究?！?/p>

E-mail:drhuangzh@163.com。

10.3969/j.issn.1671-8348.2016.23.024

R

A

1671-8348(2016)23-3237-04

2016-04-09

2016-06-29)