李慧恩 王志剛 沈騰維 閻愛(ài)華

(河北省林木種質(zhì)資源與森林保護(hù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室(河北農(nóng)業(yè)大學(xué))，保定，071001)

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光肩星天牛觸角cDNA文庫(kù)構(gòu)建及質(zhì)量分析1)

李慧恩 王志剛 沈騰維 閻愛(ài)華

(河北省林木種質(zhì)資源與森林保護(hù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室(河北農(nóng)業(yè)大學(xué))，保定，071001)

以新羽化的光肩星天牛(Anoplophoraglabripennis)雄成蟲(chóng)觸角為材料，采用RNA轉(zhuǎn)錄5′末端轉(zhuǎn)換(SMART)技術(shù)構(gòu)建全長(zhǎng)cDNA文庫(kù)。經(jīng)驗(yàn)證，該文庫(kù)容量為1.35×106pfu/mL，重組率為95%。從中隨機(jī)挑取48個(gè)克隆進(jìn)行表達(dá)序列標(biāo)簽(ESTs)測(cè)序，有效序列為45條，其中35條序列有相關(guān)同源信息，24條為全長(zhǎng)序列，完整性比率為68.6%。

光肩星天牛；觸角；cDNA文庫(kù)；表達(dá)序列標(biāo)簽(ESTs)

光肩星天牛(Anoplophoraglabripennis)屬鞘翅目(Coleoptera)，天?？?Cerambycidae)，是我國(guó)北方地區(qū)楊樹(shù)、柳樹(shù)、榆樹(shù)、槭樹(shù)等闊葉樹(shù)種的重要害蟲(chóng)，成蟲(chóng)取食嫩枝和葉片主脈，幼蟲(chóng)鉆蛀樹(shù)干，上下活動(dòng)取食，形成大量蛀道，使樹(shù)干機(jī)械強(qiáng)度嚴(yán)重下降，甚至造成林木整株死亡，是鉆蛀類害蟲(chóng)的代表性種類[1-4]。對(duì)光肩星天牛腦部解剖結(jié)構(gòu)的研究表明，相對(duì)于其他感覺(jué)功能，天牛的中腦觸角葉較大，嗅覺(jué)最發(fā)達(dá)[5]。超微結(jié)構(gòu)觀察顯示，觸角是昆蟲(chóng)感受器最富集的器官，具有嗅覺(jué)、觸覺(jué)和味覺(jué)等多種感受功能，機(jī)械感器和化學(xué)感器的種類和數(shù)量都遠(yuǎn)多于其他感器，在昆蟲(chóng)的寄主定位和配偶選擇過(guò)程中起到了重要作用[6-7]。因此，加強(qiáng)對(duì)光肩星天牛觸角的研究有利于明確天牛的生理生化特性和行為學(xué)特征，為天牛的無(wú)公害防治奠定基礎(chǔ)。當(dāng)前的研究主要集中在寄主揮發(fā)物信息對(duì)天牛觸角的電化學(xué)反應(yīng)方面[8-10]，對(duì)觸角功能的分子生物學(xué)研究很少。王偉等[11]利用mRNA差異顯示體系(DDRT-PCR)發(fā)現(xiàn)了在光肩星天牛觸角中特異表達(dá)的28條序列，涉及化學(xué)感受、覓食等相關(guān)功能，但目前還未見(jiàn)到這種天牛功能基因克隆的報(bào)道。

構(gòu)建cDNA文庫(kù)能夠全面發(fā)掘器官、組織的新基因，明確基因功能，是系統(tǒng)研究功能基因組的重要方法。松褐天牛(Monochamusalternatus)[12-13]、家蠅(Muscadomestica)[14]、銅綠麗金龜(Anomalacorpulenta)[15]、大草蛉(Chrysopapallens)[16]、美國(guó)白蛾(Hyphantriacunea)[17]等農(nóng)林害蟲(chóng)已成功構(gòu)建了cDNA文庫(kù)，獲得了大量功能基因信息。本研究以光肩星天牛雄蟲(chóng)觸角為試驗(yàn)材料，通過(guò)構(gòu)建光肩星天牛觸角全長(zhǎng)cDNA文庫(kù)并結(jié)合ESTs序列分析，對(duì)該天牛包括嗅覺(jué)、味覺(jué)、觸覺(jué)在內(nèi)的功能基因進(jìn)行全面挖掘和分析，為探明天牛觸角感器功能的分子機(jī)制和感覺(jué)相關(guān)功能蛋白的相互作用機(jī)制提供線索，同時(shí)有利于了解光肩星天牛感覺(jué)器官控制行為反應(yīng)的內(nèi)在機(jī)制，為研究其他昆蟲(chóng)的感覺(jué)機(jī)制提供了新的思路，有助于豐富光肩星天牛的行為控制技術(shù)，為進(jìn)一步開(kāi)發(fā)出引誘劑、驅(qū)避劑和干擾劑奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

供試?yán)ハx(chóng)：試蟲(chóng)采自河北省靈壽縣，在羽化前將有排糞孔的柳樹(shù)木段帶回實(shí)驗(yàn)室保濕，昆蟲(chóng)羽化后在冰上將其觸角切下，液氮中迅速冷凍，放入冰箱，-80 ℃保存。

主要試劑：In-Fusion?SMARTer?Directional cDNA Library Construction Kit和Advantage 2 Polymerase Mix購(gòu)自Clotech公司；PCR產(chǎn)物純化及回收試劑盒QIAquick PCR Purification Kit購(gòu)自Qiagen公司；SfiI酶購(gòu)自NEB公司；DL2000 Marker購(gòu)自TaKaRa公司。

總RNA提?。河捎诠饧缧翘炫Ｓ|角的幾丁質(zhì)含量較高，為了獲得高質(zhì)量的觸角總RNA，比較了液氮人工研磨法和勻漿器勻漿法2種研磨方法的效率，并按照說(shuō)明書(shū)用Trizol法提取觸角總RNA。用1%瓊脂糖凝膠電泳和紫外吸收法測(cè)定、計(jì)算總RNA的純度與比值，以檢測(cè)RNA質(zhì)量。

cDNA的合成及分級(jí)分離：按照In-Fusion?SMARTer?Directional cDNA Library Construction Kit說(shuō)明書(shū)構(gòu)建觸角全長(zhǎng)cDNA文庫(kù)，LD PCR產(chǎn)物用蛋白酶K消化，SfiI酶切后，分級(jí)分離cDNA，收集酶切產(chǎn)物并用電泳檢測(cè)質(zhì)量。cDNA與pMD19-T相連轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH-5α感受態(tài)后涂板，獲得光肩星天牛觸角cDNA質(zhì)粒文庫(kù)。

文庫(kù)質(zhì)量檢測(cè)和重組率鑒定：計(jì)算菌落數(shù)與藍(lán)白斑的比例，得到文庫(kù)滴度、庫(kù)容量，以此初步鑒定所構(gòu)建的文庫(kù)質(zhì)量。從構(gòu)建的光肩星天牛雄蟲(chóng)觸角cDNA質(zhì)粒文庫(kù)中隨機(jī)挑取48個(gè)克隆，用M13通用引物進(jìn)行菌落PCR。反應(yīng)結(jié)束后取5 μL產(chǎn)物進(jìn)行1%瓊脂糖凝膠電泳分析插入片段大小。計(jì)算公式如下：

庫(kù)容量=菌落數(shù)×連接產(chǎn)物量。

文庫(kù)滴度=(菌落數(shù)×稀釋倍數(shù)×103)/所用文庫(kù)體積。

重組率=轉(zhuǎn)化噬菌斑/菌落總數(shù)。

文庫(kù)的保存：將挑取的陽(yáng)性克隆置于1 mL加入Amp的LB培養(yǎng)液中，37 ℃培養(yǎng)至渾濁，將85 μL菌液與15 μL滅菌甘油混合后加入96孔細(xì)胞培養(yǎng)板，編號(hào)，在超低溫冰箱中-80 ℃保存。

ESTs序列測(cè)定與比對(duì)：從構(gòu)建的cDNA文庫(kù)中隨機(jī)挑取48個(gè)獨(dú)立克隆測(cè)序，測(cè)序得到的序列進(jìn)行去載體、聚類拼接，拼接得到的Unigenes用Blastx程序進(jìn)行同源性比較，計(jì)算完整性比率。將篩選出的陽(yáng)性克隆進(jìn)行測(cè)序，測(cè)序委托上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司(Sangon)完成。將測(cè)序結(jié)果去除冗余序列并采用GeneBank(www.ncbi.nlm.nih.gov)中的Blastx程序?qū)y(cè)序結(jié)果進(jìn)行同源性檢索和序列分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 總RNA的提取質(zhì)量

把手動(dòng)研磨和勻漿儀研磨2種研磨方法提取的光肩星天牛觸角總RNA用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)(圖1)，28 S和18 S核糖體RNA條帶清晰明亮，邊緣銳利，無(wú)拖尾。經(jīng)檢測(cè)，研磨樣品提取得到的總RNAA260/A280為2.01，勻漿儀粉碎樣品提取得到的總RNAA260/A280為2.09。因此，說(shuō)明2種提取方法獲得的RNA無(wú)降解，純度較好，均可進(jìn)行下一步的試驗(yàn)。

2.2 cDNA第一鏈和第二鏈合成

以光肩星天牛觸角總RNA反轉(zhuǎn)錄合成第一鏈cDNA，經(jīng)LD-PCR合成第二鏈cDNA。1%瓊脂糖凝膠電泳分析顯示，條帶彌散均勻，片段主要集中于500～2 000 bp(圖2)，表明雙鏈cDNA合成成功。

1.手動(dòng)研磨；2.勻漿儀研磨。

圖2 光肩星天牛觸角雙鏈cDNA電泳

2.3 cDNA文庫(kù)質(zhì)量評(píng)價(jià)

將光肩星天牛觸角cDNA酶切片段與pMD19-T載體連接形成重組質(zhì)粒，然后轉(zhuǎn)化大腸桿菌E.coliDH5α菌株，得到菌落數(shù)大于1 500，構(gòu)建了相應(yīng)文庫(kù)，重組率為95%，滿足文庫(kù)構(gòu)建的一般要求。文庫(kù)滴度為1.5×109pfu/mL，庫(kù)容量為1.35×106pfu/mL。隨機(jī)選取48個(gè)克隆，用M13通用引物進(jìn)行菌落PCR，擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳分析(圖3)表明，插入片段大小為500～2 000 bp。因此，構(gòu)建的光肩星天牛觸角cDNA文庫(kù)質(zhì)量較高，符合要求。

2.4 cDNA質(zhì)粒文庫(kù)的ESTs分析

隨機(jī)挑選48個(gè)克隆送上海生工公司進(jìn)行序列測(cè)定，并對(duì)所得序列進(jìn)行質(zhì)量評(píng)估和拼接，對(duì)于峰圖比較好的序列去除載體得到45條有效序列。利用Blastx程序，將上述獲得的序列與GeneBank的nr數(shù)據(jù)庫(kù)和EST數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行同源性對(duì)比分析(表1)，結(jié)果顯示，45條序列中有35條序列有相關(guān)同源信息，其中24條為全長(zhǎng)序列，完整性比率為：24/35=68.6%。10條序列(占22%)未在GeneBank中找到同源序列，這些序列可能是光肩星天牛的特異基因序列，新基因部分登錄在GeneBank中，登錄號(hào)為gb|AKM70275.1|。從功能上看，已知功能的同源基因涉及包括氨基酸代謝、電子傳遞、性激素合成與識(shí)別、能量合成與代謝、化學(xué)感受等不同家族不同功能。其中，與化學(xué)感受相關(guān)的基因十分豐富，可能與嗅覺(jué)相關(guān)的基因有C端氣味結(jié)合蛋白1-4、穿膜蛋白107異構(gòu)體、礦化蛋白、化學(xué)感受蛋白等。沒(méi)有具體功能的基因序列為16條，可能成為新的功能候選基因。

圖3 隨機(jī)挑取的48個(gè)克隆的PCR產(chǎn)物電泳圖譜

表1 光肩星天牛觸角ESTs序列Blastx比對(duì)結(jié)果

3 結(jié)論與討論

RNA的質(zhì)量是構(gòu)建全長(zhǎng)文庫(kù)的關(guān)鍵。cDNA文庫(kù)的代表性以及插入片段的完整性是評(píng)價(jià)建庫(kù)質(zhì)量的2個(gè)標(biāo)準(zhǔn)[18-19]。理論上每個(gè)cDNA文庫(kù)應(yīng)至少包含3.3×105個(gè)獨(dú)立克隆。本研究構(gòu)建的cDNA文庫(kù)包含1.35×106個(gè)獨(dú)立克隆，插入片段主要集中于500～2 500 bp，重組率約為95%，完整性比率為68.6%，符合構(gòu)建全長(zhǎng)cDNA文庫(kù)的要求。經(jīng)測(cè)序，得到45條有效序列，35條同源序列，24條全長(zhǎng)序列，具有已知功能的光肩星天牛ESTs 20個(gè)。

很多研究者報(bào)道，氣味結(jié)合蛋白和化學(xué)感受蛋白都與昆蟲(chóng)感覺(jué)機(jī)制相關(guān)，尤其是嗅覺(jué)[20-21]。構(gòu)建cDNA文庫(kù)是挖掘功能基因的有效手段之一。Zeng et al.[22]從稻縱卷葉螟(Cnaphalocrocismedinalis)觸角文庫(kù)中分離cDNA克隆，發(fā)現(xiàn)了8個(gè)嗅覺(jué)基因，包括2個(gè)普通氣味結(jié)合蛋白(GOBPs)基因、3個(gè)信息素結(jié)合蛋白(PBPs)基因和3個(gè)化學(xué)感受蛋白(CSPs)。Zeng et al.[23]分析西花薊馬(Frankliniellaoccidentalis)觸角cDNA文庫(kù)鑒定出2個(gè)嗅覺(jué)基因，分別編碼PBP、CSP；Li et al.[24]將云斑天牛(Batocerahorsfields)成蟲(chóng)觸角全長(zhǎng)cDNA文庫(kù)測(cè)序發(fā)現(xiàn)18個(gè)蛋白基因，用RT-PCR技術(shù)克隆得到3個(gè)CSP基因BhorCSP1、BhorCSP1、BhorCSP1和3個(gè)GOBP基因BhorGOBP1、BhorGOBP2、BhorGOBP3。本試驗(yàn)通過(guò)Blastx比對(duì)，發(fā)現(xiàn)一些具有特殊功能的基因序列，如四聯(lián)跨膜蛋白，推測(cè)其在光肩星天牛嗅覺(jué)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)過(guò)程中起重要作用；同時(shí)發(fā)現(xiàn)了很多與代謝和能量轉(zhuǎn)化相關(guān)的基因，具體的功能還需后續(xù)進(jìn)行相關(guān)試驗(yàn)鑒定。這些為篩選克隆光肩星天牛重要功能基因，分析光肩星天牛感覺(jué)機(jī)制、生理行為學(xué)的本質(zhì)奠定了基礎(chǔ)，為無(wú)公害防治光肩星天牛提供新思路和新方法。雖然光肩星天牛觸角cDNA文庫(kù)已經(jīng)成功構(gòu)建，但是本試驗(yàn)獲得的基因仍然有限，以后研究還應(yīng)該通過(guò)高通量測(cè)序獲取更多的基因，為光肩星天牛遺傳圖譜的建立提供數(shù)據(jù)。

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Construction and Primary Analysis of Full Length cDNA Library ofAnoplophoraglabripennisAntenna//

Li Huien, Wang Zhigang, Shen Tengwei, Yan Aihua

(Key Laboratory of Germplasm Resources of Forest and Forest Protection of Hebei Province, Agricultural University of Hebei, Baoding 071001, P. R. China)//Journal of Northeast Forestry University，2016,44(11)：96-99.

The full length cDNA library ofAnoplophoraglabripennisantenna was constructed by SMART RNA (switching mechanism at 5′end of RNA transcript) which consisted of 1.35×106pfu/mL and the recombinant percentage was 95%. Forty-eight clones were randomly selected from the cDNA library, the ESTs (expressed sequence tags) were sequenced. Forty-five were effective, 35 homologous sequences which contained 24 full-length sequences were found by blasted in the NCBI nonredundant nucleotide databases, and the integrity ratio of the full-length sequences was 68.6%.

Anoplophoraglabripennis; Antenna; cDNA Library; Expressed sequence tags

1)河北省教育廳杰出青年基金項(xiàng)目(YQ2014022)；河北省自然科學(xué)基金項(xiàng)目(C2012204098)。

李慧恩，女，1991年11月生，河北省林木種質(zhì)資源與森林保護(hù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室(河北農(nóng)業(yè)大學(xué))，碩士研究生。E-mail：994721417@qq.com。

閻愛(ài)華，河北省林木種質(zhì)資源與森林保護(hù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室(河北農(nóng)業(yè)大學(xué))，副研究員。E-mail：yanaihua@hebau.edu.cn。

2016年4月18日。

S763.38

責(zé)任編輯：程 紅。